COVER KJH

BUKU PETUNJUK PRAKTIKUM
KULTUR JARINGAN HEWAN
Penyusun:
KholifahHolil, M.Si.
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN)
MAULANA MALIK IBRAHIMMALANG
2012
KATA PENGANTAR
Segala puji syukur kehadirat Allah SWT atas kesempatan yang diberikan
untuk selesainya penyusunan buku petunjuk praktikum kultur jaringan hewan ini.
Buku petunjuk ini disusun berdasarkan kebutuhan mahasiswa biologi UIN
Maulana Malik Ibrahim Malang khususnya untuk para mahasiswa yang
menempuh matakuliah kultur jaringan hewan.
Buku petunjuk ini terdiri dari beberapa bagian tetapi secara garisbesar
buku petunjuk praktikum ini berisi dasar-dasar praktikum yang dilakukan dalam
kultur jaringan hewan. Sebagai dasar praktikum maka diharapkan buku petunjuk
ini memberikan ketrampilan dasar bagi para mahasiswa khususnya mahasiswa
yang menempuh matakuliah kultur jaringan hewan dan umumnya bagi mahasiswa
biologi atau mahasiswa yang serumpun.
Pada akhirnya tak ada gading yang retak. Saran dan kritik untuk
pengembangan lebih lanjut guna penyempurnaan buku petunjuk ini benar-benar
sangat diharapkan dan semoga bermanfaat.
Malang, Februari 2012
Penyusun
DAFTAR ISI
Kata
Pengantar……………………………….………………………………………....i
Daftar Isi………………………………………………………….........................ii
I. PreparasidanSterilisasiAlatdanBahan………….………...................................1
II. SterilisasiRuang……....………………………………….................................4
III. UjiSterilitas…………………………………………………………………..6
IV. Pembuatan Media Stock……………….….…………….…………………..8
V. KulturSel Baby Hamster kidney (BHK)………………….……………....10
VI. PengamatanSelHasilKultur BHK……………………….………………….12
VII. In Vitro Maturation (IVM)..………………………………………..............15
PREPARASI DAN STERILISASI ALAT DAN BAHAN
A. Pendahuluan
Teknik kultur jaringan merupakan teknik untuk mengembangbiakkan sel,
jaringan maupun organ di dalam media yang sesuai yang dilakukan di luar
tubuh organisme. Keberhasilan teknik ini salah satunya ditentukan oleh
teknik sterilisasi yang tepat untuk menghasilkan alat-alat maupun bahan yang
steril yang akan digunakan dalam kultur jaringan. Jenis alat dan bahan yang
akan disterilisasi didasarkan pada beberapa pertimbangan diantaranya adalah
pada ketahanan alat maupun bahan tersebut terhadap perlakuan suhu yang
diberikan pada saat sterilisasi, komponen penyusun, dan lain-lain.
Alat-alat dari jenis glassware menunjukkan ketahanan yang lebih terhadap
panas daripada alat-alat selain itu. Untuk beberapa bahan tertentu didasarkan
pada komponen penyusunnya (ada yang dengan menggunakan filter dan ada
juga yang menggunakan autoclave). Berikut ini adalah beberapa metode
untuk sterilisasi (table 1) yang dapat dijadikan bahan pertimbangan untuk
proses sterilisasi.
Tabel 1. Metode sterilisasi menurut Freshney (2005)
Method
Dry heat
Conditions
160◦C, 1 h
Materials
Heat stable: metals, glass,
PTFE.
Limitations
Some charring may occur,
e.g., of
indicating tape and cotton
plugs.
Moist heat
121◦C, 15–20 min
Steam penetration requires
steam-permeable packaging.
Large fluid
loads need time to heat up.
Irradiation:
γ –Irradiation
25 kGy
Heat-stable liquids: water, salt
solutions,
autoclavable media.
Moderately
heat-stable plastics: silicones,
polycarbonate,
nylon,
polypropylene
Plastics, organic scaffolds,
heat-sensitive
reagents and pharmaceuticals.
Electron beam
25 kGy
Plastics, organic scaffolds,
heat-sensitive
reagents and pharmaceuticals.
Microwave
5 min full power
Aqueous solutions and gels
such as agar.
Short-wave UV
254 nM, 50–100 W,
30 min
Flat surfaces, circulating air.
Chemical:
Ethylene oxide
Heat-labile plastics.
Chemical alteration of plastics
can occur.
Macromolecular degradation.
Needs high-energy source.
Not suitable
for
average
laboratory
installation.
Only useful for small volumes;
usually just
for melting agar
Will not reach shadow areas.
Spores
resistant.
Items must be ventilated for
24–48 h;
leaves toxic residue.
1h
Hypochlorite
300–2500 ppm
30 min
Contaminated
Plastics.
solutions.
70% Alcohol
Soak for 1 h
Dissecting instruments
(combined with
Needs extensive washing.
May leave
residue.
Does not kill spores. Fire risk
with
Filtration
0.1- to 0.2-µm
porosity
flaming). Some plastics.
flaming. Precast Perspex or
Lucite may
shatter if immersed in alcohol.
All aqueous solutions;
particularly suitable
for heat-labile reagents and
media.
Specify low protein binding for
growth
factors, etc.
Not suitable for some
solvents, e.g.,
DMSO. Slow with viscous
solutions
B. Tujuan
1. Untuk menyiapkan alat-alat yang akan digunakan dalam kultur jaringan
hewan
2. Untuk mengetahui teknik sterilisasi pada berbagai alat dan bahan yang
akan digunakan dalam kultur jaringan hewan.
C. Alat dan Bahan
Disinfectan (300ppm hypoclorit yang diencerkan dengan menggunakan
detergen seperti Clorox atau detegen lain yang biasa digunakan)
Detergen (7X atau Decon, teepol)
Ember
Kuas penggosok botol/Busa pencuci
Keranjang stainless
Aluminum Foil
Oven
Autoclave
D. Cara Kerja
1. Rendam alat-alat yang akan digunakan dengan menggunakan air yang
ditambah dengan detergen yang mengandung disinfectan (contoh larutan
teepol). Biarkan selama 24 jam.
2. Sikat dan bilas alat-alat tersebut di bawah air mengalir lakukan sebanyak
20x.
3. Bilas dengan aquades dan Deionized Water (DI), lakukan sampai tidak ada
busa yang menempel pada glassware.
4. Keringkan alat-alat tersebut dalam oven suhu 50°C -60°C. Jika sudah
kering bungkus dengan aluminium foil.
5. Sterilisasi kering untuk glassware dan alat-alat stainless lainnya dalam
oven pada suhu 125oC selama 3 jam atau pada suhu 160°C selama 1 jam.
6. Sterilisasi basah untuk alat-alat yang bukan tergolong glassware dan alatalat stainless dalam autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit dan
selanjutnya keringkan dalam oven suhu 50°C -60°C.
7. Simpan alat-alat yang sudah disterilisasi dalam oven dengan suhu 50°C 60°C tersebut atau simpan dalam lemari penyimpanan yang disinari
dengan bolam dalam ruang steril.
8. Alat-alat siap untuk digunakan (maksimal penyimpanan 48 jam).
E. Data Pengamatan
No Nama Alat
Fungsi
Jenis Sterilisasi
F. Tugas/Pertanyaan
1. Jelaskan fungsi alat-alat dibilas dengan menggunakan DI?
2. Apa tujuan sterilisasi kering dan sterilisasi basah
3. Sebutkan alat-alat apa saja yang tergolong disterilisasi dengan sterilisasi
kering dan yang tergolong disterilisasi dengan sterilisasi basah pada
praktikum yang sudah saudara lakukan.
STERILISASI RUANG
A. Pendahuluan
Ruang menjadi salah satu pendukung dalam menunjang keberhasilan
dalam kultur jaringan hewan. Ruang yang terbebas dari kontaminan akan
menjadi lingkungan yang tepat untuk tumbuhnya sel/jaringan yang dikultur.
Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam mempersiapkan ruangan
yang tepat untuk keberhasilan kultur jaringan. Beberapa diantaranya adalah
pada prilaku dan penanganan yang dilakukan oleh peneliti. pemilihan teknik
sterilisasi, dan intensitas sterilisasi.
Ada beberapa teknik sterilisasi ruang yang bisa digunakan mulai dari cara
fisik/mekanik, kimiawi dan radiasi. Teknik sterilisasi ruang dengan cara
fisik/mekanik yaitu sterilisasi dengan cara membersihkan ruangan dengan
melakukan pengepelan atau penyapuan dengan dikombinasi dengan
pemakaian disinfektan. Sedangkan teknik sterilisasi cara kimiawi misalnya
dengan membersihkan ruangan menggunakan alcohol 70% atau melalui
proses fumigasi. Sementara itu teknik sterilisasi dengan cara radiasi adalah
dengan cara penyinaran menggunakan sinar UV.
Selain teknik sterilisasi di atas maka intensitas sterilisasi juga perlu
diperhatikan. Sterilisasi ruang yang dilakukan secara berkala akan
meminimalisir kontaminan.
B. Tujuan
1. Untuk menyiapkan ruangan yang steril yang akan digunakan dalam kultur
jaringan hewan.
2. Untuk mengetahui teknik sterilisasi ruang yang akan digunakan dalam
kultur jaringan hewan.
C. Alat dan Bahan
Sapu
Lap
Kain Pel
Disinfektan
Alkohol 70%
D. Cara Kerja
1. Laminar Air Flow (LAF)
• Bersihkan permukaan LAF dengan menggunakan lap bersih atau tissue.
• Semprotkan area kerja dengan menggunakan alkohol 70% dan lap
dengan menggunakan tissue.
• Semprotkan kembali area kerja dengan menggunakan alkohol 70% dan
biarkan kering sendiri.
• Lakukan penyinaran dengan menggunakan UV minimal 1 jam.
Lakukan langkah ini sebelum maupun sesudah digunakan. Jika LAF
tidak sedang digunakan hindari meninggalkan alat maupun bahan di
atas area kerja yang ada di dalam LAF.
2. Inkubator
• Nonaktifkan incubator, keluarkan rak incubator.
• Bersihkan rak incubator dari lemak, kotoron media yang tumpah, debu,
dan lain-lain yang bisa menjadi sumber kontaminan. Lakukan dengan
menggunakan tissue yang ditetesi alcohol 70%. Jika perlu rendam
dengan air hangat terlebih dahulu.
• Rendam dengan menggunakan detergen yang telah ditambah
disinfektan (minimal 1 jam), gosok dengan menggunakan busa
pembersih, bilas di bawah air mengalir dan bilas kembali dengan
menggunakan deionized water (DI). Keringkan.
• Masukkan rak ke dalam incubator dan semprot dengan menggunakan
alcohol 70%.
• Inkubator siap untuk digunakan.
3. Ruang Kultur
• Bersihkan lantai dari debu dan kotoran lain dengan menggunakan sapu.
• Lakukan pengepelan dengan detergen yang ditambah dengan
disinfektan (misal wipol).
• Lakukan penyinaran dengan sinar UV (minimal seminggu sekali
dengan durasi minimal 1 jam).
E. Data Pengamatan
Alat/Ruang
disterilisasi
LAF
Inkubator
Ruangan
yang
Metode sterilisasi (cara Hasil Uji Sterilitas
fisik, kimia, radiasi)
F. Tugas/Pertanyaan
1.
Apakah ada perbedaan hasil uji sterilitas pada berbagai alat/ruang yang
saudara sterilisasi?
2.
Jika terdapat perbedaan jelaskan mengapa demikian?
UJI STERILITAS
A. Dasar Teori
Salah satu factor penentu keberhasilan dalam teknik kultur jaringan adalah
tersedianya lingkungan yang steril yang terbebas dari kontaminan baik jamur,
bakteri maupun kontaminan lain. Teknik sterilisasi yang tepat akan
mendukung penyediaan lingkungan yang dibutuhkan oleh sel/ jaringan yang
ditumbuhkan.
Uji sterilitas adalah uji ada tidaknya kontaminan pada alat, bahan, maupun
lingkungan tempat sel/jaringan tersebut ditumbuhkan. Dengan menggunakan
medium yang dibutuhkan oleh kontaminan tertentu (contoh media NA, PDA)
maka akan dapat diketahui keberadaan dari kontaminan seperti jamur, bakteri,
dan lain-lain.
B. Tujuan
Untuk mengetahui sterilitas dari alat, bahan, dan lingkungan yang akan
dikultur.
C. Alat dan Bahan
Medium NA
Medium PDA
D. Cara Kerja
1. Siapkan medium nutrient agar (NA) dan medium Potato Dextrose Agar
(PDA) steril.
2. Letakkan medium tersebut pada bagian pinggir kiri, tengah, dan pinggir
kanan pada bagian LAF, Inkubator, dan lantai (lihat tabel pengamatan).
3. Buka medium dan biarkan selama 5 menit kemudian tutup.
4. Inkubasi dalam inkubator suhu 37°C dan lakukan pengamatan setiap 2x24
jam (lakukan pengamatan selama 6 hari). Jika pada medium yang
digunakan terdapat kontaminan dari bakteri, jamur, protozoa maupun
kontaminan lain, lakukan sterilisasi ulang sampai steril dan siap
digunakan.
5. Lakukan hal yang sama pada alat dan medium yang sudah disterilkan dan
akan digunakan
E. Data Pengamatan
(Jenis
Medium yang Tempat
Jumlah
Koloni Keterangan
digunakan
pengambilan
Yang Terbentuk
Kontaminan: misal
sampel
bakteri, jamur, dll)
NA
LAF kiri atas
LAF
kanan
atas
LAF tengah
LAF
kiri
bawah
LAF
kanan
bawah
Kontrol
Inkubator rak
atas
Inkubator rak
tengah
Inkubator rak
bawah
Kontrol
Lantai kiri atas
Lantai kanan
atas
Lantai tengah
Lantai
kiri
bawah
Lantai kanan
bawah
PDA
Kontrol
LAF kiri atas
LAF
kanan
atas
LAF tengah
LAF
kiri
bawah
LAF
kanan
bawah
Kontrol
Inkubator rak
atas
Inkubator rak
tengah
Inkubator rak
bawah
Kontrol
Lantai kiri atas
Lantai kanan
atas
Lantai tengah
Lantai
kiri
bawah
Lantai kanan
bawah
Kontrol
F. Tugas/Pertanyaan
1. Jelaskan masing-masing kegunaan jenis medium yang digunakan pada
praktikum di atas?
2. Sebutkan komponen penyusun medium yang digunakan dalam praktikum
di atas dan bagaimana pula cara pembuatannya?
3. Apa yang bisa saudara simpulkan dari praktikum yang sudah saudara
lakukan?
PEMBUATAN MEDIA STOCK
A. Dasar Teori
Kultur sel/jaringan hewan adalah salah satu usaha menumbuhkan
sel/jaringan secara in vitro. Usaha ini memerlukan kondisi aseptis yang tinggi
yang menyangkut mulai dari persiapan alat dan bahan, persiapan media,
pelaksanaan sampai pada pemeliharaan. Kondisi yang tidak aseptis
memungkinkan tumbuhnya kontaminan-kontaminan tertentu seperti bakteri,
protozoa, dan jamur. Tumbuhnya kontaminan ini akan merusak lingkungan
untuk tumbuhnya sel itu sendiri. Oleh karenanya diperlukan kehati-hatian dan
kecermatan bekerja serta pemahaman yang tinggi dalam menjaga sterilitas
dalam teknik kultur sel/jaringan.
Sebagai sumber nutrisi maka sel atau jaringan yang ditumbuhkan
membutuhkan media tumbuh.
Media tersebut harus mengandung
karbohidrat, asam amino, vitamin, garam, lemak, faktor penumbuh, hormone,
zat-zat bioaktif, mineral, dan serum. Masing-masing komponen tersebut
terkandung pada beberapa media yang tersedia.
B. Tujuan
1. Untuk mengetahui macam-macam media yang digunakan dalam kultur
jaringan hewan
2. Untuk mengetahui komponen-komponen yang terkandung dalam media
yang digunakan dalam kultur jaringan hewan
3. Untuk mengetahui cara pembuatan media pada kultur jaringan hewan.
C. Alat dan Bahan
DMEM
HEPES
Oven
Bunsen
Erlenmeyer
Selotip Kertas
Laminar Air Flow (LAF)
Timbangan Analitik
Parafilm
Blue Tip
Masker
Filter Millipore
Spiritus
Kertas Label
Aquades
Penicillin
TCM 199
NaHCO3
Autoklaf
Korek Api
Botol Tutup Ulir
Sprayer
Sendok Timbang
Aluminium Foil
Mikropipet
Yellow Tip
Sarung Tangan
Alkohol 70%
Tissue
Deionized Water (DI)
NaCl
Streptomycin
D. Cara Kerja
1. Medium Pencuci/Washing Medium (NaCl 0,9%)
• 1000 ml aquades ditambah dengan 9 gram NaCl.
• Homogenkan dengan magnetic stirer.
• Masukkan ke dalam botol steril (masing-masing 100ml) dan kemudian
tutup dengan aluminium foil.
• Sterilisasi dengan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan
tekanan 1 atm.
• Simpan dalam suhu ruang, jika ingin digunakan tambah dengan
0,006g/100ml penicillin dan 0,01g/100ml streptomycin.
2. Medium Pencuci/Washing Medium (PBS, 21600-051)
• 100 ml aquades ditambah dengan 0.96 gram PBS atau sesuai dengan
kandungan yang tertera di label berapa gram yang harus ditambahkan
dalam setiap liter pelarut.
• Homogenkan dengan magnetic stirer.
• Masukkan ke dalam botol steril (masing-masing 100ml) dan kemudian
tutup dengan aluminium foil.
• Sterilisasi dengan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan
tekanan 1 atm.
• Simpan dalam suhu ruang, jika ingin digunakan tambah dengan
0,006g/100ml penicillin dan 0,01g/100ml streptomycin.
3. Medium Kultur (Stock)
• Timbang 1.35g DMEM, 0,37g NaHCO3, 0,006g penicillin, 0,01 gram
streptomycin, dan 0,238g Hepes. Selanjutnya bahan-bahan tersebut
dilarutkan dalam 100 ml deionized water (DI) steril.
• Homogenkan dengan magnetic stirrer.
• Filter dengan menggunakan Millipore ukuran 0,22µm.
• Simpan stock pada suhu 4oC dan siap untuk digunakan.
E. Data Pengamatan
Medium
Komponen
Fungsi
Keterangan
F. Tugas/Pertanyaan
Jika ingin membuat medium sebanyak 250 ml, hitung berapa kebutuhan
masing-masing komponen yang diperlukan dalam pembuatan ketiga medium
tersebut.
KULTUR SEL BABY HAMSTER KIDNEY (BHK)
A. Pendahuluan
Teknologi kultur jaringan hewan adalah salah satu teknik
mengembangbiakkan sel/jaringan hewan dalam kondisi in vitro. Teknik ini
memiliki beberapa manfaat diantaranya dapat digunakan sebagai bahan dasar
untuk mempelajari toksisitas bahan kimia tertentu, mekanisme dan fungsi sel,
rekayasa genetika, produksi hormone, produksi vaksin, dan lain-lain.
Keberhasilan kultur jaringan hewan bergantung pada beberapa factor
diantaranya pada pemilihan jenis medium yang tepat, penggunaan serum,
sterilitas bahan dan pengerjaan, jenis eksplan (sel atau jaringan yang akan
dikultur) dan lain-lain. Dengan memperhatikan factor-faktor di atas maka
akan didapatkan stock sel yang bagus dan selanjutnya dapat digunakan untuk
keperluan lebih lanjut.
Prinsip dasar teknik kultur jaringan ini adalah menumbuhkan eksplan
(sel atau jaringan) pada medium tertentu dengan lingkungan yang terkendali
sampai didapatkan biakan yang konfluen. Tingkat keberhasilan dari teknik ini
dapat dilihat dari beberapa parameter diantaranya adalah persentase konfluen,
viabilitas sel, abnormalitas sel, dan lain-lain.
B. Tujuan
1. Untuk mengetahui teknik kultur sel BHK
2. Untuk mengetahui peran serum terhadap pertumbuhan sel BHK secara in
vitro.
C. Alat dan Bahan
Mikropipet 1 ml
Mikropipet 20-200µl
Tissue culture dish (TC dish)
Erlenmeyer 25 ml dan 50 ml
Tabung reaksi 10 ml
Petri dish
Sentrifus
Pipet Pasteur dan karet hisap
Blue tip
Yellow tip
Tabung sentrifus
Rak tabung
Seperangkat alat bedah
Aluminium foil
Spuit 10 ml dan 2.5ml
Medium DMEM stock
Penicillin
Streptomycin
Serum FBS
Tripsin
NaCl 0.9%
PBS
Fetus Hamster umur 2 hari (belum berbulu)
D. Cara Kerja
•
Pembuatan medium
1. Medium Washing: medium washing yang digunakan terdiri dari
medium NaCl 0.9% steril, PBS steril, dan medium DMEM 0%.
2. Medium inkubasi: medium inkubasi yang digunakan adalah medium
DMEM 10 % FBS.
Catatan: semua medium di atas harus ditambah antibiotic (penicillin
dan streptomycin).
•
Isolasi dan Penanaman eksplan
1. Semprot fetus hamster dengan menggunakan alcohol 70%. Masukkan
ke dalam LAF yang telah diberi alas aluminium foil.
2. Lakukan dislokasi dengan cara menekan bagian leher dengan
menggunakan pinset dan menarik bagian ekor.
3. Gunting abdomen bagian posterior ke arah anterior sampai kemudian
selaput yang menyelubungi abdomen terbuka. Ambil bagian ginjal.
4. Masukkan ke dalam beaker glass kecil yang berisi NaCl 0.9%.
Lakukan sekali lagi.
5. Masukkan ke dalam beaker glass kecil yang berisi PBS.
6. Masukkan ke dalam petri dish yang berisi tripsin 0.25% sebanyak
500µl, cacah. Tambahkan 250µl PBS, homogenasi dengan
menggunakan spuit 2.5 ml.
7. Masukkan ke dalam tabung sentrifus steril, bilas petridish dengan cara
menambahkan 250µl PBS dan masukkan PBS bilasan tersebut ke
dalam tabung sentrifus yang sama. Inkubasi dalam incubator selama
30 menit.
8. Keluarkan dari incubator dan tambah dengan 1 ml PBS.
9. Sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 1500rpm.
10. Buang supernatant dan tambah pellet dengan 2 ml DMEM 0%.
11. Sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 1500rpm.
12. Buang supernatant dan tambah pellet dengan 2 ml DMEM 0%.
13. Sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 1500rpm.
14. Buang supernatant dan tambah dengan 1 ml DMEM 10%.
15. Sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 1500rpm.
16. Buang supernatant dan sisakan pellet sebanyak 500µl.
17. Homogenasi, ambil 100µl pelet dan masukkan ke dalam TC dish yang
telah berisi 3.5 ml DMEM 10%.
18. Inkubasi dalam incubator CO2 5% pada suhu 37°C. Lakukan sampai
sel konfluen. Amati pada hari ke 3 dan ke 6.
19. Jika sel pada hari ke 3 sudah nempel pada dasar TC dish lakukan
penggantian medium dengan cara membuang medium lama dan
menggantinya dengan medium DMEM 10% yang baru.
E. Pertanyaan
1. Hitung total kebutuhan masing-masing medium pada kultur sel BHK
yang telah dilakukan.
2. Sebutkan kesulitan-kesulitan yang dihadapi pada saat kultur sel BHK
tersebut di atas dan bagaimana cara mengatasinya.
PENGAMATAN SEL HASIL KULTUR BHK
A. Pendahuluan
Sel adalah unit struktural terkecil dari penyusun makhluk hidup. Sebagai
unit terkecil sel mempunyai kemampuan untuk berproliferasi. Proses
proliferasi ini dilakukan dalam rangka untuk menggantikan sel yang telah
rusak dan untuk keperluan lain yang diperlukan untuk kehidupan sel.
Secara in vitro sel pada perkembangannya mengalami 3 fase yaitu fase
lambat (adaptasi), fase eksponensial dan fase menetap. Pada fase lambat
(adaptasi), sel mengalami adaptasi dengan media kultur sehingga proses yang
terjadi pada fase ini pelekatan atau penempelan sel pada substrat dan
penyebaran sel. Fase selanjutnya adalah fase eksponensial yaitu sel yang
sudah beradaptasi akan berproliferasi, sehingga pada fase ini terjadi
peningkatan jumlah sel secara eksponensial dan pertumbuhan mencapai
konfluen. Fase terakhir yaitu fase menetap yang merupakan fase terjadinya
penurunan dan berkurangnya kemampuan sel untuk tumbuh.
Tingkat perkembangan dari sel secara in vitro dapat dilihat dari beberapa
parameter yaitu persentase konfluen, jumlah sel, viabilitas sel, abnormalitas
sel, ukuran sel, dan lain-lain. Dengan mengamati beberapa parameter tersebut
maka akan dapat diketahui bagaimana pertumbuhan eksplan (sel) yang telah
dikultur.
B. Tujuan
1. Untuk mengetahui teknik pengamatan berbagai parameter sel hasil kultur.
2. Untuk mengetahui pertumbuhan sel BHK hasil kultur.
C. Alat dan Bahan
Mikropipet 1 ml
Mikropipet 20-200µl
Tissue culture dish (TC dish)
Erlenmeyer 25 ml dan 50 ml
Tabung reaksi 10 ml
Aluminium foil
Spuit 10 ml dan 2.5ml
PBS
Biakan sel BHK yang telah konflue
Blue tip
Yellow tip
Tabung sentrifus
Rak tabung
Petri dish
Sentrifus
Tripsin EDTA (Versen)
Tripan Blue
Hemocytometer
D. Cara Kerja
1. Amati TC dish yang berisi biakan di bawah mikroskop. Tentukan berapa
persen ekspansi yang dilakukan oleh sel dengan cara 25% jika menutupi
¼ dari total area TC dish, 50% jika menutupi ½ dari total area TC dish,
75% jika menutupi ¾ total area TC dish, dan 100% jika menutupi semua
area TC dish. Data persentase tersebut merupakan data persentase
konfluen.
2. Buang medium kultur dan cuci biakan dengan PBS. Lakukan sebanyak 3
kali atau sampai benar-benar bersih dan terbebas dari medium DMEM
10%.
3. Beri 1 ml tripsin EDTA atau sampai biakan tergenang oleh tripsin
EDTA. Inkubasi dalam incubator selama 30 menit.
4. Keluarkan dari incubator dan homogenasi dengan spuit 2.5 ml.
Masukkan dalam tabung sentrifus dan tambahkan 1 ml PBs.
5. Sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 1500rpm.
6. Buang supernatant dan tambahkan 2 ml PBS.
7. Sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 1500rpm.
8. Buang supernatant dan tambahkan 2 ml PBS.
9. Sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 1500rpm.
10. Buang supernatant dan sisakan pellet sebanyak 1 ml, homogenasi.
11. Ambil hemositometer bersih dengan gelas penutup diambil dan
diletakkan pada tempatnya.
12. Teteskan 1 suspensi sel pada 1 tetes pewarna pada gelas objek yang
masih terbuka, di aduk dan di ambil kemudian diteteskan pada
13.
14.
hemositometer ditepi gelas penutup, sehingga cairan masuk dibawah
gelas penutup.
Diamkan selama 1-2 menit, tidak boleh terlalu lama, sel yang rusak/tidak
viable/mati akan menyerap warna sedangkan sel yang tidak dapat
menyerap warna adalah sel yang viable (hidup).
Jumlah sel yang hidup dan yang mati selanjutnya dapat dihitung dengan
menggunakan rumus (Freshney, 2010) :
C= n x 5 x 104
Keterangan :
C = Konsentrasi sel (sel/ml)
n = Jumlah sel yang dihitung dalam 5 kotak hemocitometer.
104= Volume chamber hemocytometer pada kedalaman 0.1mm
E. Data pengamatan
Tabel 1. Efek konsentrasi FBS yang berbeda terhadap persentase konfluen sel
BHK secara in vitro
Perlakuan
% konfluen pada hari ke…
3
6
FBS 5%
FBS 10%
Tabel 2. Efek konsentrasi FBS yang berbeda terhadap jumlah sel BHK secara
in vitro
Perlakuan
Jumlah
sel
pada
hari Selisih
ke………….
0
6
FBS 5%
FBS 10%
Tabel 3. Efek konsentrasi FBS yang berbeda terhadap viabilitas sel BHK
secara in vitro pada hari ke 6 kultur.
Perlakuan
Total
Hidup
Mati
FBS 5%
FBS 10%
Tabel 4. Efek konsentrasi FBS yang berbeda terhadap abnormalitas sel BHK
secara in vitro pada hari ke 6 kultur.
Perlakuan
Jumlah sel yang…..
Normal
Abnormal
FBS 5%
FBS 10%
F. Pertanyaan
Apakah terdapat perbedaan efek dari kedua perlakuan di atas terhadap
berbagai parameter pertumbuhan sel BHK tersebut? Mengapa demikian?
IN VITRO MATURATION (IVM)
A. Pendahuluan
Kultur sel dan jaringan merupakan teknik yang digunakan secara luas
dalam berbagai disiplin ilmu mulai ilmu-ilmu dasar tentang sel dan biologi
molekuler sampai bidang aplikasi bioteknologi yang sedang berkembang
dengan pesat. Di bidang biologi, teknologi ini dapat bermanfaat untuk
mempelajari interaksi sel, mekanisme control intraseluler untuk diferensiasi
dan perkembangan sel, fungsi-fungsi sel, analisa kromosom, perkembangan
embrio, serta perkembangan sel-sel spesifik. Di bidang farmasi dan
kedokteran teknologi ini dimanfaatkan untuk memproduksi vaksin antivirus
dan untuk pengobatan lainnya (contoh teknik stem cell untuk pengobatan luka
bakar, kanker darah dll). Sedangkan di bidang peternakan teknologi ini
bermanfaat untuk menghasilkan ternak-ternak unggul (melalui cloning),
melestarikan hewan-hewan langka dan lain-lain. Sementara itu di bidang
reproduksi, teknik kultur sel dan jaringan dimanfaatkan dalam in vitro
fertization (IVF), in vitro maturation (IVM), dan lain-lain.
IVM merupakan salah satu teknik dalam kultur sel yang dilakukan untuk
mendapatkan oosit/ovum yang matang yang kemudian oosit tersebut nantinya
digunakan untuk kepentingan lebih lanjut. Oosit hasil IVM selanjutnya
digunakan sebagai bahan dasar untuk keperluan penelitian parthenogenesis,
IVF, dan untuk keperluan sebagai sel resipien pada teknik transfer inti
(cloning).
B. Tujuan
1. Untuk mengetahui dan memahami tahap-tahap yang dilakukan dalam
IVM.
2. Untuk mengetahui dan memahami perkembangan oosit yang dimaturasi
secara in vitro.
C. Alat dan Bahan
Tabung Reaksi
Bunsen
Erlenmeyer
Petridish Besar
Sprayer
Laminar Air Flow (LAF)
Aluminium Foil
Parafilm
Mikropipet
Yellow Tip
Hematokrit
Masker
Filter Millipore
Alkohol 70%
Tissue
Deionized Water (DI)
TCM 199 (Stock)
Penicillin
Streptomycin
Rak Tabung
Korek Api
Botol Tutup Ulir
Selotip Kertas
Botol Koleksi
Gunting
Falcon
Spuit 10 ml
Blue Tip
Inkubator CO2
Selang Infus
Sarung Tangan
Petridish kecil
Spiritus
Kertas Label
NaCl 0,9%
FBS
Parafin Oil
D. Cara Kerja
1. Pembuatan Medium IVM
a. Ambil 9 ml medium stok dan tambahkan 1 ml serum FBS, masukkan ke
dalam tabung reaksi (tabung 1: medium berserum 10%). Sedangkan pada
tabung lain ambil 9,5 ml medium stok dan tambahkan 500µl serum FBS
(tabung 2: medium berserum 5%). Sementara itu tabung 3 berisi 5 ml
medium stok.
b. Filter medium pada masing-masing tabung reaksi dengan menggunakan
Millipore ukuran 0,22µm.
c. Ambil 25 µl medium berserum 10% masukkan dalam falcon (buat bentuk
drop), tambahkan paraffin oil. Tambahkan kembali 25 µl medium
berserum dan berikutnya tambahkan kembali paraffin oil. Lakukan hal
yang sama sampai drop yang dibentuk berisi 100µl medium berserum
10%. Sisa medium yang dibuat drop tuang pada petridish kecil (bagi
menjadi 3 petridish).
d. Inkubasi dalam incubator CO2 sampai saat digunakan.
2.
a.
IVM
Koleksi ovarium dari RPH
• Potong jaringan ikat yang melekat pada ovarium dan cuci sampai
bersih dengan menggunakan NaCl 0,9% yang sudah ditambah
dengan penicillin dan streptomycin.
• Jika sudah bersih masukkan dalam botol koleksi yang juga berisi
NaCl 0,9% dan penicillin serta streptomycin.
• Masukkan botol koleksi ke dalam termos yang berisi air hangat.
• Bawa ke laboratorium.
b. Aspirasi oosit
• Di laboratorium masukkan ovarium hasil koleksi dari RPH ke
dalam waterbath pada suhu 38oC,
• Dalam kondisi steril aspirasi oosit melalui folikel antral yang
berdiameter 3-7mm dengan menggunakan disposable syringe 10ml
dan jarum berukuran 21 G (spuit diisi dengan 0,5-1ml washing
medium).
• Tempatkan hasil aspirasi dalam tabung reaksi yang berada dalam
waterbath yang sama.
• Tambahkan 5 ml medium tidak berserum.
c. Washing oosit
• Endapkan hasil aspirasi dalam tabung reaksi selama 10 menit.
• Buang supernatant (bagian atasnya) sisakan 1-2ml, tambahkan 5 ml
medium berserum 5%, biarkan selama 10 menit.
• Buang kembali supernatant (bagian atasnya) sisakan 1-2ml,
tambahkan 4 ml medium berserum 5%, biarkan selama 10 menit.
• Buang supernatant (bagian atasnya) sisakan 1 ml. Tuang pellet ke
dalam petridish kecil dan bilas sisa pellet pada tabung dengan 1 ml
medium berserum 5% dan hasilnya tuang pada petridish kecil tadi.
d. Seleksi oosit
• Dengan menggunakan hematokrit yang telah dihubungkan dengan
selang infus, seleksi oosit di bawah mikroskop dengan cara
memindahkan dan memilih hanya oosit yang memiliki cumulus
oophorus dan corona radiata yang kompak ke dalam petridish kecil
yang berisi medium berserum 10%.
• Lakukan proses pemindahan tersebut sampai 3x.
e. Maturasi dan Evaluasi Oosit
• Dengan menggunakan hematokrit maka oosit yang sudah diseleksi
dipindahkan ke dalam drop medium maturasi yang telah diinkubasi
minimal 2 jam sebelum. Masing-masing drop isi 5-10 oosit.
• Inkubasi dalam inkubator CO2 5%, suhu 38,5oC selama 1x24 jam.
• Amati perkembangan sel-sel kumulusnya. Perkembangan sel-sel
kumulus dikelompokkan menjadi 3 yaitu kualitas 0 (oosit dengan
sel-sel kumulus yang tidak berkembang sama sekali), kualitas 1
(oosit dengan sel-sel kumulus yang berkembang hanya sebagian),
dan kualitas 2 (oosit dengan sel-sel kumulus yang berkembang
seluruhnya).
E. Data Pengamatan
Tabel perbedaan jumlah oosit yang matur pada berbagai jam pengamatan
Perlakuan
Jumlah oosit pada……….
Jumlah Polar
Body (PB)
KO
K1
K2
Jam ke 26
Jam ke 30
F. Pertanyaan
Apakah ada perbedaan jumlah oosit yang berekspansi pada hasil IVM yang
sudah dilakukan. Mengapa demikian? Berikan penjelasan.