Artikel Bioindustri

Pengembangan BOD Sensor Berbasis Biospesies Lokal
Ivandini Tribidasari Anggraningrum, Feni Triana Zulfia dan Endang Saepudin
Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia, Kampus UI
Depok 16424, Indonesia
E-mail: [email protected]
Abstrak
Fabrikasi BOD sensor dilakukan untuk mempersingkat waktu pengukuran BOD dari 5 hari menjadi 30
menit. Khamir lokal Candida fukuyamaensis UICC Y-247 digunakan sebagai transducer. Khamir ini
diimobilisasikan sebagai suatu lapisan tipis dalam media agarose menggunakan membran Nafion. Lapisan
ini kemudian dilekatkan pada glassy carbon yang telah dimodifikasi dengan nanopartikel emas dan
digunakan sebagai elektroda kerja. Nilai BOD diperoleh dengan mengukur konsentrasi glukosa
menggunakan metode multi pulse amperometri dan dikonversikan ke nilai BOD. Optimasi dilakukan pada
jumlah sel khamir, potensial pengukuran 450 mV dan waktu tunggu pengukuran 30 menit. Hasil
pengukuran linier pada daerah konsentrasi glukosa 0,1 mM - 0,5 mM, atau setara dengan 10 mg/L – 50
mg/L BOD. Uji kedapatulangan pengukuran dan kestabilan film menunjukkan nilai RSD sebesar 2,7 % (n
= 15) dan penurunan respon setelah 3 hari dengan batas deteksi minimum 1,1336 mg/L BOD.
Perbandingan dengan metode pengukuran BOD konvensional menunjukkan bahwa BOD sensor yang
difabrikasi dapat digunakan untuk menggantikan metode konvensional.
Abstract
BOD sensors were fabricated in order to reduce measurement time of BOD from 5 days to 30 min.
Indonesian yeast, Candida fukuyamaensis UICC Y-247, was used as a transducer. The yeast was
immobilized as a thin film in agarose medium and Nafion membran. The film was then attached at goldmodified glassy carbons and used as working electrodes. The measurements were conducted by
investigation of glucose concentrations using multi pulse amperometric method and then conversed to BOD
values. Optimization was conducted for the yeast cell number, applied potential of 450 mV, and waiting
time measurement of 30 min. Linearity was shown in glucose concentration range of 0,1 mM - 0,5 mM or
similar to BOD concentration range of 10 mg/L – 50 mg/L. Good reproducibility was shown by RSD of
2.7% (n = 15). Decreasing of current responses was found after 3 days. Detection limit of 1.1336 mg/L
BOD was found. Comparison with conventional BOD measurement methods indicated that the fabricated
BOD sensor can be used as an alternative method for BOD measurements.
Keywords: Indonesian yeast, Candida fukuyamaensis UICC Y-247, gold-modified glassy carbon, multi
pulse amperometry, BOD sensor
1. Pendahuluan
Biochemical Oxygen Demand (BOD) merupakan salah satu parameter penting
dalam pencemaran air. Parameter ini diukur sebagai banyaknya konsumsi oksigen oleh
mikroorganisme untuk mendegradasi senyawa organik. Metode konvensional pengukuran
BOD menggunakan cara titrimetrik (APHA,1986) yang membutuhkan waktu selama 5
hari. Metode ini memiliki banyak kelemahan diantaranya sulit untuk mengontrol
bioproses dan monitoring, sehingga mulai dilakukan metode alternatif yang menyajikan
metode yang praktis, mudah dilakukan, cepat, dan dapat dikembangkan menjadi
pengukuran secara in situ. Salah satu metode yang memiliki kriteria tersebut adalah
metode sensor (Karube et al.1990; Riedel et al., 1990; Tmmeveski et al., 1998). Teknik
sensor ini memanfaatkan modifikasi tranduser dengan cara mengimobilisasi
mikroorganisme diatas permukaan elektroda pendeteksi oksigen, respon signal yang
dihasilkan cukup signifikan dan sangat cepat sehingga deteksi dapat dilakukan dalam
waktu 30 menit. Beberapa jurnal bahkan dapat mempercepat proses hingga 5 sampai 20
menit (Riedel et al.1988).
Namun demikian, hingga saat ini penggunaan mikroorganisme asli Indonesia
untuk BOD sensor belum banyak dilaporkan. Umumnya penelitian mengenai fabrikasi
BOD sensor dilakukan oleh peneliti luar negeri dan menggunakan mikroorganisme dari
luar Indonesia yang bila diaplikasikan akan membutuhkan kondisi eksperimen yang
berbeda, biaya yang banyak, serta resiko penyebaran mikroorganisme luar yang tidak
diinginkan.
Pada penelitian ini, BOD sensor dibuat dengan memanfaatkan mikroorganisme
local Indonesia. Khamir Candida fukuyamaensis UIC 274 dipilih karena bersifat aerob,
mudah diperoleh dan dibiakkan, serta stabil secara genetik. Elektroda yang digunakan
adalah glassy karbon yang telah dimodifikasi oleh nanopartikel emas. Elektroda ini
dilekatkan dengan lapisan imobilisasi mikroorganisme dan digunakan untuk pengukuran.
Pengukuran dilakukan melalui deteksi konsentrasi glukosa menggunakan metode multi
pulse amperometry (MPA) dan hasilnya dikonversi ke nilai BOD. Larutan glukosa
digunakan karena telah diketahui kesetaraan konsentrasi glukosa dengan nilai BOD yaitu,
1 mM konsentrasi glukosa setara dengan 100 mg/L BOD (Miller and Miller 1993).
Validasi dilakukan dengan pengukuran menggunakan metode konvensional. Hasil yang
diperoleh menunjukkan bahwa BOD yang dibuat dapat digunakan sebagai metode
alternatif pengukuran BOD.
2. Eksperimental
2.1 Penentuan kurva pertumbuhan Candida fukuyamaensis UICC Y-247
Candida fukuyamaensis UICC Y-247 diperoleh dari Universitas Indonesia Culture
Collection (UICC), Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Falultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Unuversitas Indonesia. Kurva pertumbuhan
ditentukan dengan menginkubasi khamir pada beberapa media erlenmeyer 100 mL yang
ditandai dengan waktu pengamatan yaitu, 0, 6, 12, 24, 30, 42, dan 48 jam. Masingmasing erlenmeyer diisikan dengan 25 mL media fermentasi cair YMB (YMA tanpa
agar) dan 1,25 mL suspensi sel. Fermentasi dilakukan menggunakan inkubator shaker
pada suhu 30oC selama 2 hari dengan guncangan 110 rpm. Jumlah sel kemudian diamati
sesuai dengan waktu yang ditentukan dengan mengamati perubahan kekeruhan
menggunakan alat UV spectronic 20 pada panjang gelombang 600 nm.
2.2 Imobilisasi Khamir
Suspensi sel dipisahkan dengan media cairnya dengan cara sentrifugasi kemudian dicuci
dengan larutan 0,1 M buffer fosfat pH 7. Suspensi tersebut lalu diimobilisasi dengan
membuat biomembran dari 2% agarose dalam larutan buffer fosfat. Larutan agarose
dipanaskan sampai mendidih kemudian didinginkan pada 36oC dan 2 mL suspensi
khamir ditambahkan ke dalamnya. Hasil campuran disebarkan ke membran Nafion
sampai mencapai ketebalan tertentu. Ketebalan lapisan divariasikan dengan variasi
volume campuran 0,25, 0,5, 0,75 dan 1 mL pada luas membran 3,5cm x 2,5cm. Lapisan
imobilisasi ini dapat disimpan dalam larutan buffer fosfat dalam temperatur ruang.
2.3 Aplikasi Sebagai sensor BOD
2.3.1. Pembuatan Elektroda Kerja
Permukaan glassy carbon yang telah dibersihkan dicelupkan ke dalam larutan NH4OH
pekat dan diiradiasi dibawah sumber UV (λ = 254 nm) selama 6 jam lalu elektroda
dibilas dan dikeringkan. Larutan nanopartikel emas disiapkan dengan menambahkan
sebanyak 0,5 mL larutan HAuCl4 0,01 M ke dalam 18,5 mL akuademin dan diaduk
selama 5 menit. Setelah itu 0,5 mL natrium sitrat 0,1 M ditambahkan lalu diaduk
kembali selama 5 menit dan 0,5 mL NaBH4 0,1 M ditambahkan. Karaktersisasi
dilakukan dengan spektrofotometer UV-Visible dan Transmission Electron Microscopy
(TEM). Modifikasi dilakukan dengan mencelupkan glassy carbon yang telah diaktivasi
permukaannya tadi ke dalam larutan nanopartikel emas selama 20 menit lalu dibilas dan
dikeringkan pada suhu 60oC. Setiap kali akan dipakai, lapisan imobilisasi khamir
dipotong dan dilekatkan pada glassy karbon yang sudah termodifikasi nanopartikel emas
dan digunakan sebagai elektroda kerja
2.3.1. Sensor BOD
Aktivitas sistem sensor dilihat terhadap oksidasi senyawa organik glukosa dalam larutan
buffer fosfat pH 7. Sel elektrokimia disiapkan dengan memasukkan 3 mL larutan glukosa
dalam 0,1 M larutan buffer fosfat pH 7 ke dalam kontainer. Larutan tersebut terlebih
dahulu dibebaskan dari oksigen dengan menjenuhkan larutan dengan gas nitrogen selama
2 menit. Kemudian dijenuhkan kembali dengan oksigen selama 2 menit. Sebagai
elektroda pembantu digunakan kawat Pt dan sebagai elektroda pembanding digunakan
Ag/AgCl. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan teknik Multi Pulse Amperometrik
(MPA). Potensial optimum 450 mV (vs. Ag/AgCl) ditentukan melalui siklik voltametri.
Pengaruh jumlah sel khamir dan waktu tunggu pengukuran juga diamati.
3. Hasil dan Pembahasan
3.1 Pengamatan kurva pertumbuhan Candida fukuyamaensis UICC Y-247
Kurva pertumbuhan mikroorganisme diamati dengan metode pengukuran optical density.
Kurva pertumbuhan yang dihasilkan (Gambar 1) menunjukkan bahwa khamir memasuki
fase lag pada waktu 0 sampai 6 jam. Pada kondisi awal ini, khamir terlebih dahulu
beradaptasi dengan lingkungan barunya dengan menggunakan sisa cadangan energi dari
lingkungan sebelumnya akibat adanya perubahan lingkungan yang kaya nutrien ke
lingkungan yang minim nutrien. Sedangkan pada waktu 12 sampai 24 jam, khamir
memasuki fase logaritma, saat adaptasi sudah dimulai dan terjadi peningkatan jumlah sel
yang hidup. Pada waktu pertumbuhan khamir memasuki 30 jam, merupakan fase
stasioner, dimana jumlah sel yang hidup sama dengan jumlah sel yang mati atau jumlah
sel tetap dan cenderung tidak mengalami perubahan.(Riki, 2008)
Gambar 1. Kurva pertumbuhan khamir Candida fukuyamaensis UICC Y-247
3.2 Imobilisasi lapisan khamir dengan matriks agarose/buffer fosfat
Imobilisasi dilakukan dengan membuat biomembran agarose dalam larutan buffer fosfat.
Penambahan buffer fosfat sendiri berfungsi sebagai elektrolit yang dapat meningkatkan
ektifitas pertukaran elektron dalam sistem sensor kimia. Sebagai sensor BOD, khamir
harus mendapatkan suplai oksigen yang maksimum dari larutan, namun harus tetap dijaga
agar matriks tidak terkontaminasi dengan larutan tersebut, atau dengan kata lain matriks
yang digunakan harus dijaga agar tidak kontak langsung dengan larutan. Oleh karena itu
diperlukan suatu tambahan lapisan membran yang dapat dengan baik memisahkan larutan
dengan matriks namun tetap efektif melewatkan gas oksigen dari larutan ke lingkungan
matriks. Pada penelitian ini digunakan membran Nafion yang dapat melewatkan gas
oksigen karena sifatnya yang permeable dan efektif dalam memisahkan gas dengan
larutan.
Aktivitas sistem sensor dilihat terhadap oksidasi elektrokimia glukosa dalam
larutan buffer fosfat pH 7. Larutan glukosa digunakan karena selain telah diketahui
kesetaraan konsentrasi glukosa dengan BOD (Miller and Miller 1993), larutan glukosa
juga merupakan larutan yang memberikan repon arus yang sangat signifikan
dibandingkan dengan substrat organik lain (Wu, 1999). Selain itu glukosa adalah jenis
senyawa organik yang dikonsumsi oleh khamir jenis Candida fukuyamaensis. Larutan
buffer fosfat digunakan dalam sistem sensor, agar terjadi keseimbangan pH selama
pengukuran dimana mendukung proses aktivitas mikroorganisme untuk tetap berlangsung
sehingga pengukuran BOD dapat dilakukan.
Nilai BOD tidak dapat langsung diukur karena khamir membutuhkan waktu untuk
mengkonsumsi oksigen terlarut dari sistem. Konsentrasi oksigen perlahan-lahan, seiring
dengan waktu, akan berkurang. Sistem elektrokimia akan mendeteksi penurunan
konsentrasi oksigen dalam larutan yang dihitung ekivalen dengan besarnya glukosa yang
berkurang dalam larutan (Wang, 2000). Gambar 3 menunjukkan variasi waktu
pengukuran BOD pada sesudah sistem berjalan. Arus respons yang relatif stabil
ditunjukkan pada waktu tunggu 30 menit.
Gambar 3. Amperogram larutan glukosa dalam 0,1 M buffer fosfat pH 7 diukur dengan
menggunakan elektroda kerja yang telah dimodifikasi dengan Candida fukuyamaensis UICC-247
terimobilisasi pada membran Nafion pada variasi waktu tunggu 0, 5, 20 dan 30 menit. Potensial yang
digunakan 450 mV (vs. Ag/AgCl)
3.3 Aplikasi sebagai sensor BOD
Keadaan sel khamir merupakan keadaan dimana sel khamir belum terimobilisasi.
Keadaan tersebut dikarakterisasi secara elektrokimia untuk mengetahui kondisi
sebenarnya aktivitas konsumsi oksigen oleh khamir dari jenis Candida fukuyamaensis.
Variasi konsentrasi glukosa dalam daerah konsentrasi 0,1 - 0,5 mM glukosa dalam buffer
fosfat pH 7 diamati. Nilai konsentrasi glukosa tersebut akan setara dengan nilai BOD 10 50mg/L berdasarkan standar Miller and Miller 1993. Kurva linier menunjukkan
hubungan antara arus yang dihasilkan dengan nilai BOD dari larutan yang digunakan
(Gambar 4).
Gambar 4. (a) Amperogram larutan glukosa pada variasi konsentrasi 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 dan 0,5 mM
dalam 0,1 M buffer fosfat pH 7 diukur dengan menggunakan elektroda kerja dengan kehadiran sel
khamir bebas Candida fukuyamaensis UICC-247 dan (b) Plot arus terjadap nilai BOD larutan yang
digunakan. Potensial yang digunakan 450 mV (vs. Ag/AgCl)
Arus yang dihasilkan meningkat seiring dengan bertambahnya nilai konsentrasi
glukosa yang didapatkan atau nilai BOD dari larutan. Hal ini karena bertambahnya
konsentrasi glukosa yang digunakan, menyebabkan akan semakin banyak oksigen yang
dikonsumsi oleh khamir. Keadaan sel khamir bebas menunjukan aktivitas yang saat baik
sebagai sensor BOD terlihat dari kurva linier yang dihasilkan memiliki nilai regresi R2 =
0,992. Keadaan ini didukung karena aktivitas respirasi dari mikroba khamir yang
digunakan tidak terhalangi oleh matriks, dan dengan kondisi yang jenuh dengan oksigen,
maka sel khamir pun akan dengan cepat dan sangat baik mengkonsumsi oksigen tersebut,
sehingga berkurangnya konsentrasi oksigen dapat langsung terlihat perbedaanya secara
signifikan dan menempuh waktu yang relatif lebih cepat. Sistem sensor ini dapat
selanjutnya digunakan untuk mengukur BOD dengan menggunakan sel khamir yang
terimobilisasi.
Kalibrasi keadaan terimobilisasi perlu dilakukan untuk mengetahui sejauh mana
keefektivitasan sistem transduser yang dibuat. Perlakuan kalibrasi linier sama dengan
keadaan saat sel khamir bebas dengan tiap pengukuran diulang sebanyak tiga kali.
Linieritas dari sistem transduser modifikasi lapisan imobilisasi menujukkan aktivitas
yang baik dengan nilai R2 yang dihasilkan sebesar 0,996 (Gambar 5). Sehingga dapat
disimpulkan bahwa sistem sensor ini memberikan respon yang baik untuk pengukuran
nilai BOD mulai dari range 10 mg/L sampai 50 mg/L.
50
a
I ( A)
40
30
20
10
0
0
50
100
150
200
250
w a ktu (de tik)
0,1 m M
0,2 m M
0,3 m M
0,4 m M
0,5 m M
16
b
14
I (m A)
12
y = 0.3242x - 2.8409
R 2 = 0.9962
10
8
6
4
2
0
0
10
20
30
40
50
B OD (m g /L )
Gambar 5. (a) Amperogram larutan glukosa pada variasi konsentrasi 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 dan 0,5 mM
dalam 0,1 M buffer fosfat pH 7 diukur dengan menggunakan elektroda kerja yang telah
diimobilisasi dengan Candida fukuyamaensis UICC-247 dan (b) Plot arus terhadap nilai BOD
larutan yang digunakan. Potensial yang digunakan 450 mV (vs. Ag/AgCl)
Perbandingan nilai BOD yang dihasilkan melalui metode konvensional dengan
metode sensor dilihat kesetaraannya membandingkan pengukuran empat macam sampel
glukosa yang memiliki konsentrasi yang berbeda. Metode konvensional yang digunakan
merupakan cara titrimetrik yang menghitung nilai BOD5 berdasarkan selisih jumlah
oksigen awal dengan oksigen akhir menggunakan metode APHA ed.20th 5210 B, 2005.
Pada metode sensor, nilai arus yang didapatkan dimasukkan kedalam persamaan linier
keadaan terimobilisasi untuk mengetahui nilai BOD. Perbandingan nilai ini dengan nilai
BOD berdasarkan metode konvensional (Tabel 1) menunjukkan bahwa metode sensor
memiliki memiliki kesetaraan yang baik dengan metode konvensional, mengindikasikan
metode sensor ini dapat dengan baik mendeteksi nilai BOD untuk jenis sampel glukosa.
Tabel 1. Perbandingan nilai BPD 4 jenis sampel glukosa diukur dengan metode konvensional dan
sensor kimia
Nilai BOD dengan metode konvensional
Nilai BOD dengan sensor kimia
17
17
17
18
20
19
21
20
Uji kestabilan dilakukan dengan mengukur BOD dengan lapisan imobilisasi yang sama
berulang pada hari yang sama dan selama 5 hari. Selama tidak digunakan elektroda kerja
disimpan dalam akudemin dan lapisan imobilisasi didimpan dalam larutan buffer fosfat
pH 7. Pada15 kali pengukuran berturut-turut, RSD menunjukkan nilai 2,7 % (n = 15) dan
penurunan respon teramati setelah 3 hari
Batas deteksi ditentukan untuk mengetahui batas minimum larutan glukosa yang dapat
diuji dalam sistem sensor ini. Berdasarkan perhitungan didapatkan nilai batas minimum
deteksi nilai BOD adalah untuk konsentrasi larutan glukosa sebesar 0,011336 mM (2,04
ppm) atau setara dengan nilai BOD 1,1336 mg/L.
Kesimpulan
BOD sensor dibuat menggunakan khamir lokal Candida fukuyamaensis UICC Y-247
yang diimobilisasikan sebagai suatu lapisan tipis dalam media agarose menggunakan
membran Nafion. kemudian dilekatkan pada glassy carbon termodifikasi nanopartikel
emas dan digunakan sebagai elektroda kerja. Pada potensial pengukuran 450 mV dan
waktu tunggu pengukuran 30 menit, nilai BOD diperoleh dengan mengukur konsentrasi
glukosa menggunakan metode multi pulse amperometri dan dikonversikan ke nilai BOD.
Hasil pengukuran linier pada daerah konsentrasi glukosa 0,1 mM - 0,5 mM, atau setara
dengan 10 mg/L – 50 mg/L BOD. Uji kedapatulangan pengukuran dan kestabilan film
menunjukkan nilai RSD sebesar 2,7 % (n = 15) dan penurunan respon setelah 3
hari.dengan batas deteksi minimum 1,1336 mg/L BOD. Perbandingan dengan metode
pengukuran BOD konvensional menunjukkan bahwa BOD sensor yang difabrikasi setara
dengan metode konvensional.
Daftar Pustaka
APHA (1986)Standard Method for Examination of Water and Wastewater 16th ed.
American Public Health Association, Washington DC
Chan C., Lehmann M., Chan K., Chan C., Gruendig B., Kunze G., Renneberg R. (2000)
Biosensors Bioelectronics, 15, 343
Du Pont, General Information on Nafion Membran for Electrolysis
Karube, I. and Suzuki, M. (1990) Microbial
Biosensors, in: AE Cass (Edd.) Biosensors, A Practical Approach, IRL Press, Oxford, pp.
155
Riedel, K.; Lange, K. P.; Stein, H-J.; Kuhn, M.; Ott, P.; Scheller, P (1990), Water Res.
24, 883
Riedel, K., Rennerberg R., Kehn M., Scheller F. (1988) App. Microbiol. Biotechnol. 28,
316
Riki (2008). Seleksi Berbagai Spesies Khamir Untuk Menghasilkan Xilitol Menggunakan
Bahan Dasar D-Xilosa, Depok, Departemen Kimia, Universitas Indonesia
Tan T. C., Wu C., Sensors and Actuators B. Chemical (1999), 55, 252
Tmmeveski, K.; Kikas, T.; Tenno, T.; Niinisto, L. (1998), Sensors Actuators B 47, 21
Wang Joseph (2000). Analytical Electrochemistry, New York. Library of Congress
Cataloging-in publication