plagiat merupakan tindakan tidak terpuji
advertisement
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI EKSTRAK ETANOLIK BUNGA KRISAN (Chrysanthemum indicum L.) SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa) MELALUI REGULASI BCL-2 SKRIPSI Dijalankan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Farmasi ! Diajukan oleh: Maria Nareswari NIM: 138114002 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2017 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI EKSTRAK ETANOLIK BUNGA KRISAN (Chrysanthemum inicum L.) SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa) MELALUI REGULASI BCL-2 SKRIPSI Dijalankan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Farmasi ! Diajukan oleh: Maria Nareswari NIM: 138114002 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2017 ! i! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN And$when$you$want$something,$all$the$universe$conspires$in$helping$ you$to$achive$it$–$Paulo$Coelho$“The$Alchemist”$ $ Saat>saat$yang$luar$biasa$sulit$dalam$perjuangan$adalah$pertanda$ bahwa$kesuksesan$sudah$mendekat$–$Merry$Riana$ $ ! $ iv! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PRAKATA Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Kuasa penulis panjatkan atas segala berkat, rahmat, dan limpahan kasih-Nya yang luar biasa sehingga penulis dapat menyelesaikan naskah skripsi yang berjudul “Ekstrak etanolik bunga krisan (Chrysanthemum indicum L.) sebagai agen kemopreventif terhadap sel kanker serviks HeLa melalui regulasi Bcl-2” sebagai syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulisan skripsi ini mendapat dukungan dan bantuan dari berbagai pihak, sehingga penulis mengucapkan terima kasih kepada : 1.! Ibu Dr. Riris Istighfari Jenie, M.Si., Apt, selaku dosen pembimbing skripsi yang telah banyak membantu dalam berbagai ilmu, pengetahuan, dan wawasan, serta bersedia meluangkan waktu, tenaga dan pikiran untuk berdiskusi dan mengarahkan serta memberi semangat dan meyakinkan penulis dalam penyusunan skripsi ini. 2.! Ibu Dr. Erna Tri Wulandari., Apt., dan Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku dosen penguji atas semua saran, dan dukungan yang membangun. 3.! Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt, selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan izin kepada peneliti. 4.! Komisi Etik Universitas Gadjah Mada, yang telah memberikan ijin untuk melakukan penelitian. 5.! Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan ilmu pengetahuan dan bimbingan kepada penulis selama proses perkuliahan. 6.! Bapak Wagiran selaku laboran di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia di Universitas Sanata Dharma dan Ibu Atin selaku laboran di Laboratorium Parasitologi Universitas Gadjah Mada yang telah membantu peneliti selama melakukan penelitian di laboratorium. 7.! Bapak Angelo Karmayogi, Ibu Maudy Maria, Adikku Maria Sekartaji, dan seluruh keluargaku sumber semangat, yang selalu berdoa, memberikan kasih sayang dan cinta, dukungan, perhatian, kesabaran dalam membimbing penulis dari awal hingga berakhirnya penulisan ini. 8.! Teman-teman seperjuangan skripsi Fira Elsa Septiana dan Lela Fransisca Adi Liana yang selalu berjuang bersama dan saling memberikan semangat. 9.! Sahabat-sahabat yang selalu menemani dalam organisasi maupun proses perkuliahan Enggar, Kenny, Liana, Atika, Axl, Santi, Agnes dan seluruh teman-teman FSMA dan FKKA atas semua hiburan dan selalu mengingatkan penulis selama ini. ! vii! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 10.! Sahabat dan teman bermain Nonik, Feli, Raviano yang selalu membantu dan selalu ada bagi penulis serta memberikan semangat untuk menyelesaikan skripsi ini. 11.! Teman-teman FSM A 2013, FKK A 2013 dan semua angkatan 2013 yang telah bersama-sama berproses dan berbagi suka duka di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 12.! Semua pihak yang telah membantu penulis, yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih terdapat banyak kekurangan serta masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua pihak. Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak terutama di bidang ilmu farmasi. Yogyakarta, 31 Januari 2017 Penulis ! viii! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI EKSTRAK ETANOLIK BUNGA KRISAN (Chrysanthemum indicum L.) SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa) MELALUI REGULASI BCL-2 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Kampus III Paingan, Maguwoharjo, Depok, Sleman, Yogyakarta, Indonesia 55282 Telp. (0274) 883037, Fax. (0274) 886529 [email protected] ABSTRAK Kanker serviks memiliki karakter ekspresi berlebih pada protein Bcl-2 sehingga dapat menghambat proses apoptosis. Cisplatin merupakan obat lini pertama pada kemoterapi kanker serviks, namun dewasa ini terjadi meningkatnya resistensi cisplatin yang dapat menyebabkan kegagalan pada kemoterapi. Bunga krisan (Chrysanthemum indicum L.) merupakan salah satu tanaman yang memiliki kandungan myricetin, salah satu flavonoid yang memiliki aktivitas kemoprevensi. Penelitian ini bertujuan untuk untuk melihat penghambatan ekstrak etanol bunga krisan terhadap viabilitas sel HeLa melalui uji sitotoksik menggunakan metode MTT, uji flowcytometry Annexin V Flous untuk melihat potensi ekstrak etanol bunga krisan dalam menginduksi apoptosis pada sel HeLa dan penghambatan terhadap protein Bcl-2 dianalisis secara semi kuantitatif menggunakan metode imunositokimia. Hasil uji sitotoksik terhadap sel HeLa dengan metode MTT pada ekstrak etanol bunga krisan menunjukkan efek sitotoksik lemah pada nilai IC50 700 µg/mL, dan mampu menginduksi apoptosis sebesar 59% pada konsentrasi ½ IC50 (350 µg/mL) pada uji flowcytometry. Hasil uji imunositokimia menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga krisan mampu menekan ekspresi protein Bcl-2 dengan kuat pada konsentrasi 125 µg/mL. Hasil ini menunjukkan ekstrak etanol bunga krisan memiliki efek sitotoksik lemah dan menyebabkan kematian secara apoptosis salah satunya dengan menekan ekspresi protein Bcl-2. Kata kunci: Kanker serviks, Bcl-2, Chrysanthemum indicum L, sel HeLa ! ix! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Chrysanthemum indicum L. ETANOLIC EXTRACT AS CHEMOPREVENTION AGENT TOWARDS HeLa CANCER CELLS THROUGH BCL-2 REGULATION Faculty of Pharmacy Sanata Dharma University, Campus III Paingan, Maguwoharjo, Depok, Sleman, Yogyakarta, Indonesia 55282 Telp. (0274) 883037, Fax. (0274) 886529 [email protected] ABSTRACT Cervical caner has a character of over expression of Bcl-2 protein that could be inhibit apoptosis. Cisplatin is the first line medication for cervical cancer chemotherapy, eventually nowadays cisplatin resistance leads to the failure of chemotherapy. Chrysanthemum indicum L. flowers is one of many plants that contain myricetin one of flavonoids that has chemoprevention activity. The aim of this study is to determine the chemoprevention activity of Chrysanthemum indicum L etanolic extract towards HeLa cervical cancer cells with MTT to see HeLa viability, followed by flowcytometry with Annexin V Flous to analyze the activity of Chrysanthemum indicum L etanolic extract that undergo apoptotic cell and the expression of Bcl-2 is being analyzed using immunocytochemistry. Chrysanthemum indicum L etanolic extract shows weak cytotoxic activity on HeLa with IC50 of 700 µg/mL and induced 59% apoptosis at 350 µg/mL, as determined by flowcytometry. Imunocytochemistry shows that Chrysanthemum indicum L etanolic extract at 125 µg/mL reduce the expression of Bcl-2 firmly. Result shows that Chrysanthemum indicum L etanolic extract shows weak cytotoxic activity and cause death with an apoptotic pathway by reduce the expression of Bcl-2. Keywords: Cervical cancer, Bcl-2, Chrysanthemum indicum L, HeLa cells. ! x! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR ISI ! HALAMAN JUDUL .......................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................. ii HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ iii HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................ . iv LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................. v PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................. vi PRAKATA.......................................................................................................... vii ABSTRAK .......................................................................................................... ix ABSTRACT.......................................................................................................... x DAFTAR ISI....................................................................................................... xi DAFTAR TABEL............................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... xv PENDAHULUAN .............................................................................................. 1 METODOLOGI PENELITIAN.......................................................................... 2 Bahan penelitian ............................................................................................. . 2 Alat penelitian ................................................................................................ . 2 Determinasi dan ekstraksi .............................................................................. . 3 Pembuatan Larutan Uji .................................................................................. . 3 Panen Sel ........................................................................................................ . 3 Uji Sitotoksik dengan MTT ........................................................................... . 4 Uji Apoptosis dengan Flowcytometry ........................................................... . 4 Uji Imunositokimia ........................................................................................ . 4 Analisis Hasil ................................................................................................. . 5 Analisis Nilai IC50 ..................................................................................... . 5 Analisis Uji Apoptosis............................................................................... . 5 Analisis Uji Imunositokimia ..................................................................... . 6 HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................... 6 Determinasi dan Ekstraksi Bunga Krisan ...................................................... . 6 Uji sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker serviks HeLa dengan MTT ......... . 7 Uji apoptosis dengan Flowcytometry ............................................................. . 9 ! xi! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Uji Imunositokimia ........................................................................................ . 11 KESIMPULAN ................................................................................................... 13 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 14 LAMPIRAN........................................................................................................ 17 BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................ 26 !! ! ! xii! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR TABEL Tabel I. Hasil Uji Apoptosis Menggunakan Flowcytometry dengan Pewarnaan Annexin V Flous ........................................................... Tabel II. Distribusi Ekpresi Bcl-2 pada Sel HeLa dengan Berbagai perlakuan .......................................................................................... ! 9 xiii! 11 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Morfologi sel HeLa ......................................................................... 7 Gambar 2. Efek sitotoksik cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan terhadap sel HeLa ........................................................................................... 7 Gambar 3. Hasil induksi apoptosis cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan terhadap sel HeLa............................................................................. 9 Gambar 4. Efek perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan terhadap ekspresi Bcl-2 terhadap sel HeLa..................................................... ! xiv! 10 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Gambar bunga krisan yang digunakan dan proses ekstraksi .......... 18 Lampiran 2. Pengolahan data uji MTT assay...................................................... 19 Lampiran 3. Dokumentasi Uji Apoptosis ........................................................... 20 Lampiran 4. Dokumentasi Uji Imunositokimia .................................................. 23 Lampiran 5. Surat keterangan hasil determinasi tanaman krisan ........................ 24 Lampiran 6. Surat Ethical Clearance.................................................................. 25 ! xv! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PENDAHULUAN Kanker serviks berkembang menjadi masalah kesehatan bagi wanita di Indonesia yaitu dengan prevalensi kedua tertinggi setelah kanker payudara. (Nuranna et al., 2015). WHO (2015) juga menyebutkan bahwa kanker serviks menduduki urutan keempat pada kanker yang sering terjadi pada wanita di belahan benua Australia, Eropa, Asia dan Afrika. Kanker serviks disebabkan oleh infeksi HPV (Human Papiloma Virus) 18 dan 16 sehingga terjadi gangguan pada regulasi sel. HPV 16 dan 18 mengekspresikan protein E6 dan E7 yang memiliki kemampuan untuk menekan aktivitas p53 sebagai tumor suppressor gen. Hal itu menyebabkan protein pro-apoptosis (Bax dan Bad) yang di aktivasi oleh sinyal dari p53 menjadi tidak aktif, sehingga muncul ekspresi berlebih dari protein anti-apoptosis (Bcl-xL dan Bcl-2) yang menyebabkan terjadinya kanker (Kho et al., 2013) Pengobatan kanker serviks yang dilakukan selama ini adalah dengan terapi radiasi, kemoterapi, dan terapi dengan antibodi monoklonal. (National Cancer Institute, 2015). Cisplatin merupakan salah satu agen kemoterapi untuk kanker serviks, namun dewasa ini dengan meningkatnya resistensi cisplatin sering menyebabkan kegagalan pada kemoterapi. Peningkatan dosis cisplatin untuk mengatasi resistensi terbukti tidak efektif karena pasien akan mengalami dose-dependent toxicity dan kerusakan jangka panjang pada ginjal serta menyebabkan terjadinya ototoksisitas yang akan menyebabkan penurunan kualitas hidup pada pasien (Leisching et al., 2015). Maka dibutuhkan agen kemopreventif untuk mencegah berkembangnya kanker serviks sedini mungkin. Kemopreventif merupakan senyawa alami atau sintesis yang dapat menghambat dan mencegah perkembangan kanker. Tujuan utama dari penggunaan agen ini adalah menurunkan angka kejadian kanker dan mencegah terjadinya kanker. Agen kemopreventif juga memliki target molekuler, yaitu protein anti apoptosis, jalur aktivasi angiogenesis, dan protein inflamasi seperti COX-2. (Sharma et al., 2012). Bunga krisan (Chrysanthemum indicum L.) berpotensi untuk dikembangkan menjadi agen kemopreventif pada kanker serviks karena mengandung myricetin, salah satu flavonoid yang dapat menurunkan regulasi dari protein anti-apoptosis yaitu Bcl-2, dan meningkatkan regulasi dari protein pro-apoptosis yaitu Bax (Kim et al., 2014). Bcl-2 merupakan protein membran intraseluler yang mencegah terjadinya apoptosis sehingga dapat memperpanjang masa hidup sel dan mengakibatkan terjadinya kanker (Chipuk et al, 2008). Li et al (2009) berhasil mengekstrak bunga krisan dengan etanol 95% dan ekstrak tersebut mampu menghambat proliferasi pada sel kanker hepar manusia (MHCC97H) dengan selektif, yaitu tidak bersifat toksik terhadap sel ! 1! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI hepatosit tikus dan sel endothelial manusia (ECV304). Penelitian ini dirancang untuk mengetahui potensi kemoprevensi bunga krisan yang diekstrak dengan etanol 95% pada sel kanker serviks HeLa, yaitu sel serviks yang memiliki gen p53 dengan tipe wild type. Infeksi HPV 18 pada sel HeLa meyebabkan penurunan pada fungsi p53 pada HeLa sehingga aktivitas induksi apoptosis pada sel HeLa menjadi terganggu (Kho et al., 2013). Mekanisme aksi ekstrak bunga krisan diamati melalui uji sitotoksik, induksi apoptosis dan imunositokimia pada protein regulator apoptosis Bcl-2. Hasil dari penelitian ini diharapkan peneliti mendapatkan bukti ilmiah untuk mengembangkan ekstrak etanol bunga krisan sebagai agen kemopreventif terhadap kanker serviks. METODE PENELITIAN Bahan Penelitian Senyawa uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah bunga krisan yang diperoleh dari Asta Bunda, Kaliurang, Yogyakarta, ekstrak etanol bunga krisan, sel kanker serviks HeLa yang didapat dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada. Bahan kimia yang digunakan adalah etanol 95% (teknis), Media Kultur Medium DMEM 10% (Gibco), Tripsin EDTA 0,25%, PBS (Phosphat Buffer Saline), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 10% dalam HCl 0,01 N, DMSO (Merck) 0,5%, akuades, Cisplatin (10mg/10mL) sebagai kontrol positif yang didapat dari Kalbe Farma, metanol 70%, reagen Annexin V Fluos staining kit (Roche) (100 mL, binding buffer 2 mL Annexin V : 2 mL propium iodide (PI)), reagen MTT (Sigma) 5 mg/mL, primary monoclonal antibody mouse anti human Bcl-2 Oncoproteini (Dako), biotinylated universal secondary antibody (Biocare), Mayer Hematoxylin (Dako), xylol, substrat DAB. Alat Penelitian Alat- alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas steril (Pyrex), blender, neraca digital, rotary evaporator (buchi Labortechnik AG CH-99230), waterbath (Memmert), alumunium foil, conical tube, autoklaf (Hirayama), 96 well-plate (Iwaki), 24 well-plate (Iwaki), cover slip, object-glass, inkubator CO2 (Thermo Heraeus HeraCell 150), Laminar air flow cabinet (Labconco), pinset (Gilson), mikropipet, hemositometer (Neubauer), ELISA reader (Bio-Rad), kamera digital (Canon 550D), mikroskop cahaya (Olympus), mikroskop inverter (Olympus), flowcytometry (FACS Calibur) ! 2! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Determinasi dan Ekstraksi Determinasi dilakukan di laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada. Bagian yang di determinasi adalah tanaman utuh mulai dari akar hingga bunga. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan adalah bunga krisan (Chrysanthemum indicum L.) (Lampiran 1). Bunga krisan yang dipilih berwarna kuning dengan usia 13 minggu kemudian dipisahkan dari tangkainya dicuci dengan air mengalir, lalu dikeringkan dengan oven dalam suhu 400C selama 2 minggu. Bunga yang sudah kering dihancurkan dengan blender hingga berbentuk serbuk. Serbuk bunga krisan sebanyak 80 gram diekstraksi dengan metode refluks menggunakan 150 mL etanol 95% selama 3 jam. Proses ini diulang dua kali, ektrak etanol bunga krisan krisan dipekatkan menggunakan rotary evaporator, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan waterbath pada suhu 80OC sampai etanol menguap dan mencapai bobot tetap (Li et al., 2009). Pembuatan larutan uji Ekstrak etanol kental ditimbang sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan kedalam 100 µl DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan stok sampel adalah 100.000 µg/ mL. Selanjutnya dibuat lima seri kadar yaitu 1000, 500, 250, 125, 62 µg/ mL. Cisplatin dengan konsentrasi 10 mg/10mL diambil sebanyak 1 mL sehingga diperoleh Cisplatin dengan konsentrasi 1000 µg/mL. Kemudian diencerkan dengan media kultur DMEM dan dibuat seri kadar pengenceran 5, 10, 20, 39, 78 µg/mL (CCRCa, 2009 ; Li et al., 2009). Panen sel Sel HeLa ditanam dan diinkubasi dalam tissue culture dish hingga konfluen, kemudian media kultur dibuang terlebih dahulu menggunakan mikropipet. PBS ditambahkan ke dalam cawan petri untuk mencuci, kemudian dibuang dan ditambahkan tripsin 0,5 mL secara merata dalam cawan petri. Cawan petri ditutup dan didiamkan di dalam inkubator selama 3 menit hingga sel terlepas. Sel ditampung pada conical tube, disentrifugasi 10 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan dibuang diberi media DMEM 2 mL, dicuplik sedikit diamati di bawah mikroskop dengan haemocytometer untuk menghitung jumlah sel yang diperlukan selama pengujian. Perhitungan+jumlah+sel = ! Jumlah+sel+kuadran+1 + 2 + 3 + 4 +9+10;+ /=> 4 3! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Setelah diketahui jumlah sel, sel diambil sesuai dengan jumlah sel yang diperlukan untuk masing-masing uji (CCRCb, 2009 ; Ham et al., 2014). Uji Sitotoksik ekstrak bunga krisan pada sel HeLa Sel dengan populasi 1.104 sel/well ditanam pada sumuran 96 well plate (Iwaki), masing-masing 100 µL. Sisakan 3 sumuran kosong untuk kontrol sel, kontrol pelarut dan kontrol media. Kemudian inkubasi sel pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C selama 24 jam. Setelah 24 jam, media dibuang dan sel diberi ekstrak etanol bunga krisan 100 µL (konsentrasi 1000, 500, 250, 125, 62 µg/mL) dan cisplatin 100 µL (konsentrasi 78, 39, 20, 10, 5, 2,5 µg/mL) lalu diinkubasi selama 24 jam. Setelah inkubasi, media kultur dibuang lalu diberi MTT 100 µL dengan konsentrasi 5 mg/mL dan diinkubasi selama 4 jam pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C, setelah itu diberi reagen stopper SDS 10% dalam 0,1 N HCl kemudian plate dibungkus dengan alumunium foil dan diinkubasi pada suhu ruangan selama 24 jam setelah itu dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm (CCRCc, 2009 ; Huang et al., 2015). Uji Apoptosis Sel dengan populasi 1.106 sel/well ditanam pada sumuran 6 well plate (Iwaki), masing-masing 2 mL, diinkubasi 24 jam pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C. Sel diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan 2 mL dengan konsentrasi 125 µg/mL, lalu diinkubasi 24 jam. Well-plate dicuci dengan 10% PBS 1 mL dan ditampung pada conical tube, lalu diberi 200 µL tripsin, inkubasi selama 3 menit dan amati dibawah mikroskop apakah sel sudah terlepas. Apabila sudah terlepas, tambahkan media kultur 1 mL pada well plate lalu ditampung kembali ke dalam conical tube kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan dibuang, sisa endapan diberi PBS dingin 1 mL kemudian resuspensi campuran dan dipindahkan ke dalam microtube 1 mL kemudian diberi reagen Annexin V Fluos staining kit (Roche) (100 mL binding buffer, 2 mL Annexin V : 2 mL propium iodide (PI)), kemudian sampel dianalisis mengunakan flowcytometry (FACS Calibur) (CCRCd, 2009 ; Huang et al., 2015). Imunositokimia Sel dengan populasi 2.105sel/well dengan volume 200 µL ditanam pada sumuran 24 well plate (Iwaki) yang telah diberi cover slip lalu diinkubasi selama 30 menit, setelah itu tambahkan 800 µL media kultur kedalam sumuran secara perlahan dan diinkubasi 24 jam pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C. Sel diberi perlakukan dengan menambahkan 1 mL sampel konsentrasi 125 µg/mL dan diinkubasi selama 24 jam pada inkubator CO2 5% ! 4! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI dengan suhu 370C. Cover slip diberi PBS lalu dibuang, dilakukan dua kali kemudian difiksasi menggunakan metanol 300 µL selama 10 menit lalu dibuang dan diberi PBS 1 mL, diamkan 5 menit kemudian dibuang. Cover slip, diberi hidrogen peroksida 1 mL selama 10 menit lalu dibuang dan cuci dengan aquadest kemudian diberi PBS. Cover slip diberi larutan blocking 20 µL selama 10 menit lalu dibuang, diberi antibodi primer 50 µL selama 1 jam setelah itu dibuang dan diberi PBS, diulang dua kali. Kemudian cover slip diberi antibodi sekunder 30 µL selama 20 menit lalu dibuang dan diberi PBS. Setelah itu diberi streptavidin 30 µL selama 10 menit lalu tambahkan PBS lalu inkubasi 2 menit dan diulang dua kali. Cover slip diberi larutan DAB (diaminobenzidin) 50 µL diinkubasi 7 menit dan diberi aquadest lalu dibuang setelah itu ditambahkan dengan MayeHematoxylin selama 3 menit dan diberi aquadest lalu dibuang. Cover slip diangkat dengan pinset, dicelupkan kedalam xylol dan alkohol kemudian dikeringkan dan diletakkan di atas object glass lalu di tetesi dengan lem dan ditutup dengan cover slip kotak dan diamati dengan mikroskop cahaya (CCRCe, 2009 ; Guimarães et al., 2005) Analisis hasil Analisis IC50 Data absorbansi pada tiap sumuran dari hasil uji MTT diperlukan untuk dikonversi menjadi presentase sel yang hidup. Presentase sel yang hidup (% viabilitas) dihitung menggunakan rumus: %+Viabilitas = Absorbansi+perlakuan − Absorbansi+kontrol+media +x+100% Absorbansi+kontrol+sel − Absorbansi+kontrol+media Data yang diperoleh diolah untuk mendapatkan nilai IC50 dengan membuat regresi linear konsentrasi versus persen viabilitas sel dengan menggunakan program Microsoft Excel (CCRCc, 2009, Nobakht et al., 2014). Analisis Apoptosis Sel Pengamatan kuantitatif dilakukan menggunakan alat FACS Calibur yang terhubung dengan software untuk membaca hasil analisis. Hasil yang didapatkan, kemudian dikonversikan dalam diagram menjadi warna sel. Sel yang hidup ditunjukkan dengan warna hijau (Annexin-/PI-), warna kuning menunjukkan sel mengalami early apoptosis (Annexin+/PI-), dan merah muda menunjukkan sel mengalami late apoptosis (Annexin+/PI+), dan warna merah menunjukkan sel mengalami nekrosis (Annexin-/PI+) (Hingorani et al., 2011). ! 5! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Analisis Imunositokimia Pengamatan kualitatif digunakan untuk mengetahui ekspresi protein Bcl-2. Warna coklat menunjukkan ekspresi protein Bcl-2 dan warna biru menunjukkan tidak terdapat ekspresi protein Bcl-2. Pengamatan seacara semikuantitatif dilakukan dengan level scoring. Pembacaan data dilakukan dengan bantuan tiga responden blind reader untuk menghitung jumlah sel yang mengekspresikan Bcl-2 pada preparat yang terdiri dari tiga bagian tiap preparatnya. %+Ekspresi+Bcl2 = jumlah+sel+berwarna+coklat x100% jumlah+total+sel+satu+lapang+pandang Level scoring ekspresi Bcl-2 ditentukan dengan : 0 : kurang dari 5% (Sangat Kuat), 1+ : 6% - 25% (Kuat), 2+: 26% - 50% (Sedang), 3+ : 51% - 75% (Lemah), 4+ : 76% - 100% (Sangat Lemah) (Jing et al., 2015). HASIL DAN PEMBAHASAN Determinasi dan Ekstraksi Bunga Krisan Determinasi tanaman dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan kebenaran dari tanaman yang digunakan sebagai sampel. Determinasi dilakukan untuk memastikan bahwa bunga yang digunakan dalam penelitian ini benar berasal dari tanaman krisan (Chrysanthemum indicum L.). Bunga dipetik dan dipisahkan dari tangkainya lalu dicuci dan dikeringkan pada oven dengan suhu 40-500C. Pengeringan bertujuan untuk menghilangkan kadar air dalam bunga karena air dapat menimbulkan tumbuhnya jamur pada bunga. Serbuk bunga krisan sebanyak 80 gram diekstraksi dengan metode refluks menggunakan 150 mL etanol 95% selama 3 jam, proses ini dilakukan selama dua kali. Hasil refluks yang sudah ditampung dan disaring kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator kemudian diuapkan diatas waterbath pada suhu 80OC sampai etanol menguap dan mencapai bobot tetap dengan berat 12,4 gram, setelah itu ekstrak disimpan pada suhu 40C (Li et al., 2009). Pada penelitian ini tidak dilakukan uji kandungan kimia pada bunga krisan, namun diharapkan ekstrak bunga krisan dapat menghambat proliferasi pada sel HeLa karena menurut penelitian Li et al (2009), bunga krisan yang diekstrak dengan etanol 95% dapat menghambat proliferasi pada sel kanker hati dengan nilai IC50 1200 µg/mL, dengan hasil selektif yaitu tanpa menunjukkan toksisitas pada sel normal. Selain itu Wu et al (2008) menunjukkan bahwa bunga krisan yang diekstraksi dengan etanol 70% mengandung dua ! 6! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI flavonoid utama yaitu quercitrin dan myericetin, dimana myericetin mampu menginduksi apoptosis pada sel kanker ovarium A2780/CP70 dan OVCAR-3 dengan nilai IC50 yaitu 30 µM dan 20 µM , namun tidak memiliki aktivitas terhadap sel ovarium normal IOSE-364 (Huang et al., 2015). Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengidentifikasi kandungan kimia pada bunga krisan yang diekstraksi dengan etanol 95% karena perbedaan usia tanaman, tempat tumbuh, waktu panen dan kondisi lingkungan serta perbedaan metode dan pelarut ekstraksi menyebabkan kandungan yang tersari dari bunga krisan menjadi berbeda-beda. Uji sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker serviks HeLa dengan MTT MTT merupakan uji reduksi warna kuning dari 3-(4,5-dimethythiazol- 2-yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromide dengan enzim suksinat dehydrogenase pada mitokondria. MTT akan masuk kedalam sel dan melewati mitokondria dan direduksi oleh enzim suksinat dehydrogenase menjadi senyawa yang tidak larut dan membentuk formazan berwarna ungu. Reduksi pada MTT hanya terjadi pada sel yang masih hidup (mengalami metabolisme secara aktif) sehingga metode ini dapat digunakan untuk mengukur viabilitas sel. Formazan yang terbentuk sebanding dengan jumlah sel yang hidup kemudian diukur dengan menggunakan ELISA reader dengan panjang gelombang 595nm (Riss, et al., 2013). A B C D Gambar 1. Morfologi sel HeLa secara mikroskopis dengan perbesaran 100x setelah diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan dan cisplatin dengan waktu inkubasi 24 jam pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C. (A) Morfologi kontrol sel HeLa. (B) Morfologi sel pada perlakuan cisplatin dengan konsentrasi 39 µg/mL. (C) Morfologi sel pada perlakuan ekstrak etanol bunga krisan dengan konsentrasi 250 µg/mL. (D) Morfologi sel pada perlakuan ekstrak etanol bunga krisan dengan konsentrasi 500 µg/mL. Panah warna biru menunjukkan morfologi sel yang masih utuh, menunjukkan sel yang sudah tidak utuh. Hasil menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga krisan mampu memberikan efek sitotoksik terhadap sel HeLa secara dose-dependent, dimana seiring dengan meningkatnya ! 7! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI konsentrasi ekstrak etanol bunga krisan, maka jumlah sel HeLa yang hidup juga semakin berkurang (Gambar 1), begitu juga dengan cisplatin. Pada uji ini terlihat perbedaan morfologi sel yang diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan, dimana bentuk sel menjadi tidak utuh, terlihat bahwa ada beberapa sel yang hanya berbentuk bulat dan setelah diberi perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan (gambar 2B, 2C dan 2D). Uji sitotoksik dilakukan sebanyak tiga kali secara independent eksperimen, dimana pada masing-masing eksperimen terdapat tiga replikasi. Nilai IC50 ekstrak etanol bunga krisan adalah 700 µg/mL (Gambar 2A), sehingga potensi ekstrak etanol bunga krisan digolongkan sebagai agen sitotoksik lemah dimana nilai IC50 > 50 µg/mL (Ellithey et al., 2014). Nilai IC50 dari cisplatin sebagai kontrol positif adalah 36 µg/mL. (Gambar 2B). Berdasarkan grafik yang diperoleh dari regresi linier menunjukkan bahwa baik perlakuan cisplatin (Gambar 2A) dan ekstrak etanol bunga krisan (Gambar 2B) mampu menurunkan viabilitas sel. Sebagai agen sitotoksik lemah, ekstrak etanol bunga krisan dapat ditingkatkan efikasinya dengan dikombinasikan dengan cisplatin. Diharapkan dengan diturunkannya dosis cisplatin yang dikombinasikan dengan ekstrak etanol bunga krisan, mampu menghasilkan efek yang sama dengan dosis awal cisplatin. Namun sebelum melakukan kombinasi ini diperlukan preformulasi untuk melihat kompatibilitas antara cisplatin dengan ekstrak etanol bunga krisan Viabilitas(sel((%) Viablitas sel (%) 120 100 80 60 40 20 0 A 0 20 40 60 Cisplatin (µg/mL) 140 120 100 80 60 40 20 0 80 100 B 0 200 400 600 800 1000 1200 Ekstrak(etanol(bunga(krisan((µg/mL)(( Gambar 2. Efek sitotoksik cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan terhadap sel HeLa. Sel HeLa (1.104 sel/well) yang ditanam pada 96 well-plate diinkubasi selama 24 jam pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C, kemudian diberi seri konsentrasi ekstrak etanol bunga krisan dan seri konsentrasi cisplatin. Viabilitas sel ditentukan dengan metode MTT. (A) Viabilitas sel setelah diberi seri konsentrasi cisplatin. (B) Viabilitas sel setelah diberi seri konsentrasi ekstrak etanol bunga krisan. ! 8! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Uji apoptosis dengan Flowcytometry Annexin V merupakan protein yang dapat berikatan secara spesifik dengan fosfolipid seperti fosfatidilserine yang biasanya tidak ada di luar permukaan membrane. Pada tahap early apoptosis, fosfatidilserin akan berpindah ke permukaan membran sehingga Annexin dapat berikatan dengan fosfatidilserin dan mendeteksi jumlah sel yang mengalami early apoptosis. Pada tahap late apoptosis, terjadi disintegrasi pada membran sel, sehingga reagen PI dapat masuk kedalam sel dan berikatan dengan DNA sel, sehingga pada keadaan late apoptosis, baik Annexin maupun PI akan berikatan dengan membrane dan DNA sel. Pada tahap nekrosis akan terjadi kebocoran plasma pada sel, kondisi ini menyebabkan reagen PI yang akan berikatan langsung dengan DNA sel (Hingorani et al., 2011). Flowcytometry digunakan untuk mendeteksi sel yang sudah diberi label dengan annexin maupun PI. Pada flowcytomery sel akan ditembakkan dengan sumber cahaya dan menghasilkan fluoresensi yang berbeda-beda berdasarkan label yang ada pada sel tersebut, sehingga sel dapat dikelompokkan dan dihitung sesuai populasinya lalu dikonversikan menjadi sebuah grafik dengan suatu program yang ada pada flowcytometry (Macey, 2007). Hasil flowcytometry dengan Annexin menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga krisan mampu meningkatkan peristiwa apoptosis dibandingkan dengan kontrol sel HeLa. Ekstrak etanol bunga krisan dengan nilai ½ IC50 (350 µg/mL) mampu menginduksi apoptosis sebesar 58,62%, dimana 14,64% mengalami nekrosis dan jumlah sel yang hidup sebesar 27,01% (Gambar 3C ; Tabel 1) Sel yang mengalami nekrosis diasumsikan mengalami nekrosis sekunder karena ketika percobaan tidak dilakukan secara in vitro, tidak ada peristiwa fagositosis dari badan golgi yang merupakan tahap kelanjutan dari peristiwa apoptosis, sehingga sel yang apoptosis menjadi terdeteksi sebagai nekrosis sekunder (Demoy et al., 2000). Hal ini dapat diteliti lebih lanjut dengan menguji apoptosis menggunakan flowcytometry dengan pewarnaan FLICA, dimana FLICA akan berikatan dengan caspase sehingga jika terjadi lisisnya dinding sel tanpa adanya aktivitas caspase, maka dipastikan bahwa jalur induksi pada sel yang diuji adalah melalui jalur nekrosis (Immunochemistry Technologist, 2015). Selain itu menurut penelitian Li et al (2009) ekstrak etanol bunga krisan memiliki mekanisme penghambatan secara time dependent, dimana pada dosis yang sama kematian sel akan meningkat seiring dengan lamanya waktu inkubasi, sehingga pada penelitian selanjutnya diapat dilakukan optimasi terhadap waktu inkubasi sel HeLa yang ! 9! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan, yaitu beberapa titik waktu sebelum 24 jam untuk memastikan apakah sel mengalami kematian melalui jalur apoptosis. Pada cisplatin, sel yang mengalami early apoptosis adalah 25,44%, late apoptosis 10,62%, nekrosis 2,68% dan sel yang masih hidup adalah 2,69% (tabel 1 ; gambar 3B). Hal File: cisplatin HeLa.006 Gate: No Gate Total E vents: 20000 File: KS HeLa.001 Gate: No Gate Total E vents: 20000 ini menunjukkan bahwa cisplatin menginduksi kematian sel melalui jalur apoptosis, dimana Quad % Gated % Total UL 2.54 2.54 UR 10.54 10.54 LL 61.02 61.02 LR 25.91 25.91 Quad % Gated % Total UL 5.05 5.05 UR 2.50 2.50 LL 88.72 88.72 LR 3.74 3.74 cisplatin meningkatkan aktivitas dari caspase-3 dan-7 (Leisching et al., 2015) Caspase-3 menyebabkan fragmentasi pada sitoskeleton sehingga terjadi kematian sel secara apoptosis (Elmore, 2008). R4 R3 File: krisan I HeLa.005 Gate: No Gate Total E vents: 20000 R4 A File: KS HeLa.001 Gate: No Gate Total E vents: 20000 Re gion % Gated % Total R1 88.28 88.28 R2 3.55 3.55 R3 2.58 2.58 R4 5.67 5.67 R2 R1 B Quad % Gated % Total UL 13.64 13.64 UR 41.06 41.06 LL 26.80 26.80 LR 18.50 18.50 R2 File: cisplatin HeLa.006 Gate: No Gate Total E vents: 20000 Re gion % Gated % Total R1 61.80 61.80 R2 25.44 25.44 R3 10.62 10.62 R4 2.69 2.69 R1 R4 C R2 File: krisan I HeLa.005 Gate: No Gate Total E vents: 20000 Re gion % Gated % Total R1 27.01 27.01 R2 17.82 17.82 R3 41.34 41.34 R4 14.64 14.64 R1 Gambar 3. Hasil induksi apoptosis cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan. Sel HeLa (1.106 sel/well) yang ditanam pada 6 well-plate dan diberi perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan dengan inkubasi 24 jam pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C. Sel diwarnai dengan reagen annexin V dan PI. Sel yang hidup ditunjukkan dengan warna hijau, early apoptosis ditunjukkan dengan warna kuning, late apoptosis dengan warna merah muda dan nekrosis ditunjukkan dengan warna merah. Hasil dibaca dengan flowcytometer. (A) Kontrol sel. (B) Sel HeLa dengan perlakuan cisplatin konsentrasi ½ IC50 (18 µg/mL). Sel HeLa dengan perlakuan ekstrak etanol bunga krisan ½ IC50 (350 µg/mL) Tabel I. Hasil Uji Apoptosis Menggunakan Flowcytometry dengan Pewarnaan Annexin V Flous Total Sel (%) Radian 1 Radian 2 Radian 3 Radian 4 Hidup Awal Apoptosis Akhir Apoptosis Nekrosis Kontrol Sel 88,28 3,55 2,58 5,67 Cisplatin 61,80 25,55 10,62 2,69 Ekstrak Etanol Bunga 27,01 17,82 41,34 14,64 Krisan ! ! 10! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Uji imunositokimia Imunositokimia merupakan teknik untuk memvisualisasikan keberadaan protein di dalam sel dengan menggunakan biomolekul berupa antibodi yaitu berdasarkan pada kemampuan antibodi tersebut untuk mengikat protein dalam sel yang dikenali sebagai antigen. Ada dua jenis imunostitokimia yaitu imunositokimia langsung dan imunositokimia tidak langsung. Imunositokimia langsung hanya menggunakan satu antibodi, metode ini cepat namun tidak cukup sensitif untuk mendetiksi protein karena jumlah protein yang dideteksi biasanya terlalu kecil untuk menghasilkan sinyal yang kuat. Sensitivitas akan meningkat dengan menggunakan metode tidak langsung yaitu dengan adanya ikatan pada antibodi sekunder terhadap komples antibodi primer dan antigen. Peristiwa ini akan memperkuat sinyal yang ada (Uhlen et al., 2016) Gambar 4. Efek perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan terhadap ekspresi Bcl-2 terhadap sel HeLa dengan perbesaran 400x. Sel HeLa (2.105 sel/well) ditanam pada 6 well plate yang diberi cover slip, kemudian diberi perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan dengan inkubasi 24 jam pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C. Antibodi primer yang digunakan adalah mouse anti human Bcl-2 Oncoproteini (Dako), ekspresi Bcl-2 diamati dibawah mikroskop cahaya. (A) Kontrol sel tanpa antibodi Bcl-2. (B) Kontrol sel dengan antibodoi Bcl-2. (C) Sel HeLa dengan perlakuan ekstrak etanol bunga krisan ¼ IC50 (175 µg/mL). (D) Sel HeLa dengan perlakuan cisplatin ½ IC50 (18 µg/mL). Panah warna hitam menunjukkan adanya ekspresi Bcl-2, sedangkan panah warna biru menunjukkan tidak adanya ekspesi Bcl-2 pada sel HeLa. Uji imunositokimia bertujuan untuk melihat ekspresi dari protein anti-apoptosis Bcl2, yaitu salah satu mekanisme sitotoksik dari ekstrak etanol bunga krisan terhadap sel HeLa. Warna coklat pada sitoplasma menunjukan adanya ekspresi protein Bcl-2 pada sel, sedangkan warna biru menunjukkan tidak adanya ekspresi Bcl-2 pada sel. Intensitas warna coklat digunakan sebagai parameter semi-kuantitatif untuk menilai ekspresi Bcl-2 dan menghitung jumlah sel yang mengekspresikan protein Bcl-2. Ekspresi Bcl-2 pada sel HeLa dapat dilihat pada gambar 4. Ekstrak etanol bunga krisan dengan konsentrasi ¼ IC50 (125 ! 11! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI µg/mL) mampu menekan ekspresi Bcl-2 dengan kuat (level ekspresi 1+) dan cisplatin dengan konsentrasi ½ IC50 (18 µg/mL) mampu menekan ekspresi Bcl-2 dengan sangat kuat (level ekspresi 0). Tabel II. Distribusi Ekspresi Bcl-2 pada Sel HeLa dengan Berbagai Perlakuan Lapang Pandang Ekspresi Bcl-2 pada Kontrol Sel tanpa Lapang Level Pandang Antibodi Ekspresi Bcl-2 pada Kontrol Sel dengan Level Antibodi 1 (n = 128) 1 (0,78%) 0 1 (n = 105) 105 (100%) 4+ 2 (n = 125) 3 (2,4%) 0 2 (n = 97) 97 (100%) 4+ 3 (n = 107) 0 (0%) 0 3 (n = 106) 106 (100%) 4+ ! ! Lapang Ekspresi Bcl-2 pada Pandang Perlakuan Cisplatin Level Ekspresi Bcl-2 pada Lapang Perlakuan Ekstrak Pandang Etanol Bunga Level Krisan ! 1 (n = 128) 1 (0,78%) 0 1 (n = 350) 21 (6%) 1+ 2 (n = 125) 3 (2,4%) 0 2 (n = 345) 23 (6.6%) 1+ 3 (n = 107) 0 (0%) 0 3 (n = 300) 20 (6.6%) 1+ ! Menurunnya fungsi p53 pada sel HeLa menyebabkan sel tersebut kehilangan fungsi supresifnya, akibatnya terjadi ekspresi berlebih pada protein anti-apoptosis, yaitu Bcl-2. Strategi untuk mengatasi hal ini adalah meningkatkan protein-protein yang bersifat proapoptosis yaitu p21, Hdm2, PUMA, NOXA dan Bax. Bax adalah salah satu protein proapoptosis, dimana meningkatnya Bax akan menurunkan ekspresi dari Bcl-2 sebagai protein anti-apoptosis (Kroemer et al., 2007). Ekstrak etanol bunga krisan yang pada penelitian sebelumnya dilaporakan memiliki efek sitotoksik diharapkan mampu menurunkan ekspresi Bcl-2 sehingga dapat meningkatkan peristiwa apoptosis dan menyebabkan terjadinya penurunan viabilitas sel akibat dari pemberian ekstrak etanol bunga krisan pada sel HeLa. Ekstrak etanol bunga krisan dengan konsentrasi ¼ IC50 (125 µg/mL) mampu menekan ekspresi Bcl-2 dengan kuat. Hal ini disebabkan karena kemungkinan dari mekanisme induksi apoptosis bunga krisan adalah melalui jalur caspase-3, dimana aktivasi dari caspase-3 melalui jalur ekstriksik apoptosis akan menyebabkan terjadinya aktivasi protein yang menyebabkan transduksi sinyal cascade, sehingga menyebabkan aktivasi apoptosis secara intrinsik yaitu induksi keluarnya sitorom-c dari mitokondria. Keluarnya sitokrom-c dari sitoplasma diperantarai dengan aktivitas Bax/Bax sebagai protein proapoptosis. Meningkatnya Bax akan menekan ekspresi Bcl-2 sebagai protein anti-apoptosis. ! 12! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Sitokrom-c akan berikatan dengan Apaf-1, hal ini akan mengaktivasi caspase-9. Caspase-9 menjadi pemicu terjadinya aktivasi caspase-3 dan-7 sehingga akan terjadi fragmentasi dan menyebabkan kematian sel secara apoptosis (Weyhenmeyer et al., 2012). Namun perlu diuji lebih lanjut untuk mengetahui hal tersebut, yaitu untuk menghitung jumlah ekspresi Bcl-2 secara kuantitatif pada sel HeLa yang diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan terhadap sel HeLa. Pada gambar 4A yaitu kontrol sel tanpa antibodi, morfologi sel terlihat berbeda-beda. Hal ini disebabkan karena tanpa adanya ikatan antibodi dengan sel menyebabkan pewarna streptavidin tidak optimal dalam mewarnai sel tersebut. Pewarnaan streptavidin yang tidak optimal menyebabkan DAB tidak dapat memunculkan reaksi warna coklat dengan jelas, sehingga bentuk morfologi sel menjadi terlihat berbeda-beda antara satu dengan yang lain (Colby, 2014). Kesimpulan Ekstrak etanol bunga krisan mempunyai efek sitotoksik lemah pada sel kanker serviks HeLa dengan nilai IC50 sebesar 700 µg/mL serta mampu menginduksi apoptosis dengan konsentrasi 350 µg/mL dan menekan ekspresi protein Bcl-2 secara kuat pada konsentrasi 175 µg/mL. Saran untuk penelitian berikutnya adalah dilakukan uji kandungan senyawa dalam ekstrak etanol bunga krisan, melihat efek sitotoksik ekstrak etanol bunga krisan terhadap sel normal serta efek sinergis dari kandungan ekstrak etanol bunga krisan dan agen kemoterapi. Selain itu mekanisme induksi apoptosis perlu dikonfirmasi dengan melakukan time course assay dengan waktu inkubasi kurang dari 24 jam dan perlu dilakukan uji untuk mendeteksi adanya ekspresi Bcl-2 secara kuantitatif serta penelitian lebih lanjut untuk mengetahui regulasi mediator lainnya setelah terjadi penekanan ekspresi Bcl-2. ! 13! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Daftar Pustaka ATCC, 2014, HeLa (ATCC® CCL-2™), American Type Culture Collection, USA, https://www.atcc.org/products/all/CCL-2.1.aspx, diakses tanggal 20 April 2016 Bo, L., Gao, Y., Rankin, G. O., Rojanasakul, Y., Cutler, S. J., Tu, Y., Chen, Y. C., 2015. Chaetoglobosin K Induces Apoptosis and G2 Cell Cycle Arrest through p53Dependent Pathway in Cisplatin-Resistant Ovarian Cancer Cells. HHS Public Access, 33(4), 395–401. Cancer Chemoprevention Research Centera, 2009. Prosedur Tetap: Preparasi Sampel, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wpcontent/uploads/03.009.-Preparasi-sampel.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016. Cancer Chemoprevention Research Centerd, 2009. Prosedur TetapPanen Sel, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wpcontent/uploads/03.005.-Panen-Sel.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016. Cancer Chemoprevention Research Centerd, 2009. Prosedur Tetap: Uji sitotoksik MTT, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wpcontent/uploads/03.010.02-uji-sitotoksik-MTT.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016. Cancer Chemoprevention Research Centerd, 2009. Prosedur Tetap: Flowcytometry, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wpcontent/uploads/03.014.02-flowcytometry.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016. Cancer Chemoprevention Reasearch Centere, 2009. Prosedur tetap pengamatan ekspresi protein dengan metode imunositokimia, Universitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.012.-Imunositokimia.pdf, diakses tanggal 14 April 2016. Colby, D., 2014. A Guide to Successful Immunohistochemistry, Cell Signalling Technology, http://kromat.hu/UserFiles/files/patologia/Dako_IHC_metodikai_kézikönyv_I.pdf, diakses tanggal 22 Februari 2017 Chipuk, J. E., Green, D. R., 2008. How do BCL-2 proteins induce mitochondrial outer membrane permeabilization. Trends Cell Biology, 18(4), 157–164. Comalada, M., Camuesco, D., Sierra, S., Ballester, I., Xaus, J., Gálvez, J., & Zarzuelo, A., 2005. In vivo quercitrin anti-inflammatory effect involves release of quercetin, which inhibits inflammation through down-regulation of the NF-κB pathway. European Journal of Immunology, 35(2), 584–592. Demoy, M., Minko, T., Kopenckova, P., Kopecek, J., 2000. Time and concentration dependent apoptosis and necrosis induced by free and HPMA copolymerbound doxorubicin in human ovarian carcinoma cells. J Control Release, 69(1): 185-96 ! 14! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Ellithey, M. S., Lall, N., Hussein, A. A., Meyer, D. 2014. Cytotoxic and HIV-1 enzyme inhibitory activities of Red Sea marine organisms. BMC Complementary and Alternative Medicine, 14 (77). Elmore, S., 2008. Apoptosis%: A Review of Programmed Cell Death. NIH Public Access, 381(1) 143–154. Guimarães, M. C. M., Gonçalves, M. A. G., Soares, C. P., Bettini, J. S. R., Duarte, R. A., Soares, E. G., 2005. Immunohistochemical Expression of p16INK4A and bcl-2 According to HPV Type and to the Progression of Cervical Squamous Intraepithelial Lesions. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 53(4): 509–516. Hingorani, R., Deng, J., Elia, J., McIntyre, C., Mittar, D., 2011. Detection of Apotosis using the BD Annexin V FITC Assay on the BD FACSVerseTM System, BD Biosciences, 112. Huang, H., Chen, A. Y., Ye, X., Li, B., Rojanasakul, Y., Rankin, G. O., & Chen, Y. C., 2015. Myricetin inhibits proliferation of cisplatin-resistant cancer cells through a p53dependent apoptotic pathway. International Journal of Oncology, 47(4), 1494–1502. Immunochemistry Technologist, 2015. FAM-FLICA® Caspase Assay Kits, Immunochemistry Technologist LCC, USA, https://www.bio-radantibodies.com/caspases-flica.html, diakses tanggal 22 Februari 2017. Jing, Z., Heng, W., Xia, L., Ning, W., Yafei, Q., Yao, Z., Shulan, Z., 2015. Downregulation of phosphoglycerate dehydrogenase inhibits proliferation and enhances cisplatin sensitivity in cervical adenocarcinoma cells by regulating Bcl-2 and caspase-3. Cancer Biology and Therapy, 16(4) Kho, E. Y., Wang, H. K., Banerjee, N. S., Broker, T. R., Chow, L. T., 2013. HPV-18 E6 mutants reveal p53 modulation of viral DNA amplification in organotypic cultures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 110(19), 7542–9. Kim, M. E., Ha, T. K., Yoon, J. H., & Lee, J. S., 2014. Myricetin induces cell death of human colon cancer cells. Anticancer Research, 34(2), 701 – 706. Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C., 2007. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiology Reveiw, 99–163 Leisching, G., Loos, B., Botha, M., Engelbrecht, A.-M., Benedetti-Panici, P., Bermudez, A., Albertyn, G., 2015. Bcl-2 confers survival in cisplatin treated cervical cancer cells: circumventing cisplatin dose-dependent toxicity and resistance. Journal of Translational Medicine 2015 13:1, 13(1), 2470–2486. Li, Z. F., Wang, Z. D., Ji, Y. Y., Zhang, S., Huang, C., Li, J., & Xia, X. M., 2009. Induction of apoptosis and cell cycle arrest in human HCC MHCC97H cells with Chrysanthemum indicum extract. World Journal of Gastroenterology, 15(36), 4538–4546. ! 15! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Macey, M., 2007. Flow cytometry: Principles and Applications, Springer Science & Business Media, Totowa, pp. 1-2 National Cancer Institute, 2015. Cervical Cancer Treatment-Patient Version (PDQ) General Information About Cervical Cancer, U.S Departement of Health and Human Services, USA, https://www.cancer.gov/types/cervical/patient/cervical-treatment-pdq, diakses tanggal 4 April 2016 Nuranna, L., Aziz, M.F., Cornain, S., Purwoto, G., Purbadi, S., Budiningsih, S., Budiningsih, S., Peters, A. A. W., 2012. Cervical Cancer Prevention Program in Jakarta, Indonesia: See and Treat Model in developing country, J Gynecol Oncol, 23 (3): 147-152. Nobakht, G. M., Kadir, M., Stanslas, J., Charng, C. W. 2014. Cytotoxic effect of Typhonium flagelliforme extract. Journal of Medicinal Plants Research, 8(31), 1021–1024. Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L., 2015. Cell viability assays, 1–31. Sharma, R., 2012. Cancer Chemoprevention: Prevention is Better than Cure. Journal of Cancer Science & Therapy, 01(S3), 5956 Uhlen, M., Ponten, F., Tegel, H., Nilson, P., Feilitzen, K., Lundberg, E., 2016, Immunocytochemistry, Uppsala University, Sweden, www.proteinatlas.org/learn/method/immunocytochemistry, diakses tanggal 24 April 2016. Weyhenmeyer, B., Murphy, A. C., Prehn, J. H. M., Murphy, B. M., 2012. Invited Review Targeting the Anti-Apoptotic Bcl-2 Family Members for the Treatment of Cancer, Exp Oncol 2012, 192–199. Wu, L., Gao, H., Wang, X., Ye, J., Lu, J., Liang, Y. 2010. Analysis of chemical composition of Chrysanthemum indicum flowers by GC/MS and HPLC. J Med Plants Res, 4(5), 421–426. WHO, 2015. Cervical Cancer Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012, http://globocan.iarc.fr/old/FactSheets/cancers/cervix-new.asp, diakses 20 April 2016. ! 16! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI LAMPIRAN ! 17! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 1. Gambar bunga krisan yang digunakan dan proses ekstraksi Gambar A. Bunga krisan yang sudah dikeringkan Gambar B. Ekstraksi dengan metode refluks dan pemekatan dengan vaccum rotary evaporator Gambar C. Ekstrak etanol bunga krisan ! 18! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 2. Pengolahan data uji MTT assay Data Konsentrasi Ekstrak Etanol Bunga Krisan vs Viablitias Sel Viabilitas sel (%) Konsentrasi SD ekstrak (µg/mL) 1 2 3 Rata-rata 0 102,168 106,378 91,454 100,000 7,694 15,63 117,092 110,587 81,314 102,997 19,058 31,25 118,048 104,847 87,054 103,316 15,554 62,5 106,569 92,028 81,505 93,367 12,585 125 55,293 57,589 73,469 62,117 9,898 250 36,543 30,038 19,898 28,827 8,389 500 117,092 110,587 81,314 102,997 19,058 Data Konsentrasi Cisplatin vs Viablitias Sel Konsentrasi Cisplatin SD 1 2 3 Rata-rata 0 100 100 100 100 0 5 73,003 90,551 105,062 89,539 16,053 10 56,468 78,909 101,181 78,853 22,357 20 39,258 49,888 64,398 51,181 12,62 39 31,159 31,834 37,402 33,465 3,426 78 25,253 9,393 15,804 16,817 7,979 (µg/mL) ! Viabilitas sel (%) 19! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 3. Dokumentasi uji apoptosis File: KS HeLa.001 Gate: No Gate Total E vents: 20000 Quad % Gated % Total UL 5.05 5.05 UR 2.50 2.50 LL 88.72 88.72 LR 3.74 3.74 R4 R3 File: KS HeLa.001 Gate: No Gate Total E vents: 20000 R2 R1 ! 20! Re gion % Gated % Total R1 88.28 88.28 R2 3.55 3.55 R3 2.58 2.58 R4 5.67 5.67 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI File: cisplatin HeLa.006 Gate: No Gate Total E vents: 20000 Quad % Gated % Total UL 2.54 2.54 UR 10.54 10.54 LL 61.02 61.02 LR 25.91 25.91 R4 File: cisplatin HeLa.006 Gate: No Gate Total E vents: 20000 R2 R1 ! 21! Re gion % Gated % Total R1 61.80 61.80 R2 25.44 25.44 R3 10.62 10.62 R4 2.69 2.69 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI File: KS HeLa.001 Gate: No Gate Total E vents: 20000 Quad % Gated % Total UL 5.05 5.05 UR 2.50 2.50 LL 88.72 88.72 LR 3.74 3.74 R4 R3 File: KS HeLa.001 Gate: No Gate Total E vents: 20000 R2 R1 ! 22! Re gion % Gated % Total R1 88.28 88.28 R2 3.55 3.55 R3 2.58 2.58 R4 5.67 5.67 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 4. Dokumentasi uji Imunositokimia A.! Kontrol sel tanpa antibodi B.! Kontrol sel dengan antibodi C.! Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan cisplatin D.! Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan ekstrak etanol bunga krisan ! 23! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 5. Surat keterangan hasil determinasi sampel tanaman krisan UNIVERSITAS GADJAH MADA FAKULTAS BIOLOGI LABORATORIUM SISTEMATIKA TUM BUHAN Jalan Teknika Sefatan Sekip Utara Yogyakarta 55281Telpon(O27416/,922621il92272; Fax: (0274580839 SURAT KETERANGAN Nomer: O924lS.rb. / tX / 2076 Yang bertanda tangan dibawah ini, Kepala Laboratorium Sistematika Tumbuhan Fakultas Biologi UGM, menerangkan dengan sesungguhnya bahwa, Nama NIM Asal instansi : Maria Nareswari : 138114002 : Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma telah melakukan identifikasitumbuhan dengan hasil sebagai berikut, SAMPEL I FAMILIA GENUS SPESIES Asteraceae Chrysonthemum Chryso nthe m um i ndicu NAMA DERAH m L. Bunga krisan identifikasitersebut dibantu oleh Dr. Purnomo, M.S. Demikian surat keterangan ini diberikan untuk dapat dipergunakan seperlunya. Yogyakarta, 26 September 2016 Kepala Laboratorium Sistematika Tumbuhan Fakultas Biologi UGM rno naif,usanto, ! Dr. Purnomo, N rP. 19s5042 1 L98203 1005 24! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 6. Surat ethical clearance ! 25! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi dengan judul “Ekstrak Etanolik Bunga Krisan (Chrysanthemum indicum L.) sebagai Agen Kemopreventif terhadap Sel Kanker Serviks (HeLa) melalui Regulasi Bcl-2” memiliki nama lengkap Maria Nareswari. Anak pertama dari pasangan Bapak Angelo dan Ibu Maudy Maria. Penulis lahir di Jakarta, 17 April 1995. Pendidikan formal yang ditempuh penulis dimulai di TK Teruna Bangsa Yogyakarta (2000-2001). Pendidikan dilanjutkan ke SD Teruna Bangsa Yogyakarta (20012007). Pendidikan dilanjutkan ke SMP Stella Duce 1 Yogyakarta (2007-2010), pendidikan menengah atas di SMA Stella Duce 1 Yogyakarta (2010-2013). Kemudian pendidikan dilanjutkan hingga perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis terlibat dalam organisasi dan kepanitiaan di dalam kampus, antara lain menjadi Bendahara acara Donor Darah JMKI (2014), anggota Media Farmasi (2014), anggota seksi acara Seminar Nasional JMKI (2014), koordinator divisi acara Inisiasi Sanata Dharma (2015), Ketua Seminar Nasional JMKI (2015). Selain itu, penulis juga pernah menjadi delegasi fakultas dalam kegiatan seminar internasional 14th IPSF Asia Pasific Pharmaceutical Symposium in Pattaya, Bangkok (2015) dan mengikuti menjadi asisten praktikum Biologi Sel dan Molekuler (2015/2016). ! 26!