hasil dan pembahasan

29
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi RNA Total
RNA total telah berhasil diisolasi dari akar M. malabathricum. Kuantifikasi
RNA total dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm
menunjukkan bahwa rendemen isolasi RNA adalah 250 µg tiap gram akar segar.
Nilai rasio OD260/OD280 dari RNA total pada hasil penelitian adalah 1,9. Hal ini
menunjukkan bahwa RNA total yang diisolasi dalam penelitian ini murni, tidak
terkontaminasi oleh protein. Manchester (1996) menyatakan bahwa rasio
OD260/OD280 dengan nilai antara 1,8 sampai 2,0 menunjukkan RNA total yang
diisolasi mempunyai kemurnian yang tinggi , bebas dari kontaminan protein.
Integritas RNA total dianalisis dengan melakukan elektroforesis pada gel
agarosa terdenaturasi oleh formaldehid. Hasil elektroforesis RNA total
menunjukkan adanya 2 pita RNA yang merupakan RNA ribosomal (rRNA) 28S
dan 18S (Gambar 1). Adanya pita rRNA pada RNA total akar berhubungan
dengan keutuhan rRNA yang tinggi. Kuantitas rRNA di dalam suspensi RNA total
adalah yang tertinggi dibandingkan dengan tRNA dan mRNA, sehingga rRNA
lebih mudah terdeteksi bilamana RNA total dimigrasikan di gel agarosa.
Gambar 3 Hasil elektroforesis RNA total dari akar M. malabathricum di gel
agarosa
Sintesis cDNA Total
RNA total yang telah berhasil diisolasi selanjutnya digunakan sebagai
cetakan cDNA melalui proses transkripsi balik (reverse transcription).
Transkripsi balik menggunakan primer oligo(dT) sehingga hanya mRNA yang
dapat disintesis menjadi cDNA, karena mempunyai ekor poly(A), sedangkan
rRNA dan tRNA tidak mempunai ekor poly(A). Keberhasilan sintesis cDNA
dikonfirmasi oleh hasil PCR dengan menggunakan primer spesifik untuk ekson1-
30
ekson2 dari gen aktin (actF dan actR), yang berukuran 450 pb (Gambar 4). Hasil
ini menunjukkan bahwa daerah yang diamplifikasi adalah cDNA ekson1-ekson2
dan bukan ekson1-ekson2 dari DNA genom. Amplifikasi ekson1-ekson2 dari
DNA genom akan menghasilkan pita dengan ukuran lebih besar dari 450 pb
karena diantara ekson1 dan ekson 2 terdapat daerah intron. Pita yang
menggunakan DNA genom sebagai cetakan akan menghasilkan pita berukuran
540 pb, karena adanya intron dengan ukuran 90 pb seperti pada kedelai (Shah et
al., 1982).
M
aktin
Gambar 4 Hasil elektroforesis PCR aktin dengan menggunakan cDNA sebagai
cetakan
Teramplifikasinya cDNA dengan primer actF
dan actR yang hanya
berukuran 450 pb menunjukkan bahwa sintesis cDNA total melalui proses
transkripsi balik telah berhasil dengan baik. Selain itu, hasil ini juga membuktikan
bahwa RNA total yang telah diisolasi mempunyai kualitas yang sangat bagus,
karena selain dapat digunakan untuk menyintesis cDNA juga terbebas dari
kontaminasi DNA genom.
Isolasi Fragmen Gen Sitrat Sintase
PCR dengan cDNA total sebagai cetakan dan primer spesifik cspF dan cspR
menghasilkan fragmen berukuran sekitar 900 pb (Gambar 5). Fragmen tersebut
selanjutnya disebut MmFCS (Melastoma malabathricum Fragmen Citrate
Synthase) yang merupakan kandidat fragmen gen penyandi itrat sintase dari M.
malabathricum. Adanya DNA yang berukuran sekitar 900 pb yang dihasilkan
oleh PCR menunjukkan bahwa sitrat sintase diekspresikan pada akar.
M
MmFCS
1.000 pb
850 pb
Gambar 5 MmFCS hasil PCR dengan menggunakan cetakan cDNA
31
Analisis MmFCS
Pengurutan
MmFCS
produk
PCR
menggunakan
primer
spesifik
menunjukkan bahwa cDNA target berukuran 885 nukleotida (Gambar 1,
Lampiran 1 dan Lampiran 2).
CTGTCACTGC TCATCCAATG ACTCAATTTG CATCTGGAGT GATGGCCCTT CAGGTTCAAA
GTGAATTCCA GCAAGCTTAT GAAAAGGGTA TTGCTAAATC CAAGTACTGG GAACCAACAT
ATGAAGATTC TCTTAATCTA ATTGCACGGC TTCCGTTGGT TGCTGCTTAT GTCTATCGGA
GGATATATAA GGGAGGTCAA TCTGTCCCGG TTGATGATTC CTTGGATTAT GGAGCGAATT
TCGCGCAAAT GTTAGGATTA GATGATCCGG TAATGCATGA GCTGATGAGA CTTTATGTCA
CGATCCACAG CGATCATGAG GGTGGTAATG TCAGTGCACA CACTGGCCAT CTTGTTGCTA
GTGCACTGTC AGATCCTTAT CTTTCATTTG CAGCTGCATT GAATGGTTTA GCTGGGCCAC
TGCATGGGTT AGCTAATCAG GAGGTTCTGC TTTGGATAAA GTCTGTTGTG GATGAATGTG
GAGAGAACAT TACAAAGGAA CAACTGAAGG ACTATGTTTG GAAGACACTG AATAGTGGCA
AGGTGGTTCC GGGTTTTGGC CATGGCGTTC TTCGTAAAAC AGATCCCAGA TACACATGTC
AGCGAGAATT TGCCCTGAAA CACCTTCCCA ATGACCCGCT TTTCCAGCTG GTTTCAAAGC
TCTACGAAGT GGTGCCTCCT GTACTGACTC AGCTCGGAAA GGTCAAGAAC CCGTGGCCTA
ATGTTGATGC ACACAGTGGA GTCCTGCTAA ATTATTTTGG TTTGACTGAA GCGAGGTATT
ATACTGTCCT TTTCGGTGTC TCGAGGAGCA TCGGAATATG CTCCCAGCTG ATATGGGATA
GAGCGCTAGG ATTGCCTTTG GAGAGGCCAA AGAGTGTTAC AATGG
Gambar 6 Hasil pengurutan nukleotida dari fragmen MmFCS. Nukleotida yang
terdapat di dalam kotak menunjukkan primer dan komplemen primer
yang digunakan untuk isolasi MmFCS
Analisis kesejajaran lokal dengan BLASTn menunjukkan bahwa MmFCS
mempunyai kesamaan sebesar 80% dengan bagian sitrat sintase dari Populus
trichocarpa (XM_002330859.1) dan P. hybrid (X84227.1), 79% dengan bagian
sitrat sintase dari Vitis vinifera (XM_002271415.1), Citrus sinensis (G0372880.1),
Citrus junos (AY428532.1) dan Arabidopsis lyrata (XM_002880061.1)
(Lampiran 3).
Berdasarkan urutan nukleotida MmFCS dari berbagai spesies maka dapat
disusun sebuah pohon filogenetik yang didasarkan pada urutan nukleotida baik
pada daerah terkonservasi maupun daerah tervariasi (Gambar 7). Persentase
kesamaan antar nukleotida gen sitrat sintase dari berbagai spesies adalah antara
80,8% hingga 73,7% (Lampiran 4). Analisis kesejajaran MmFCS dengan gen
sitrat sintase dari spesies lain disajikan pada Lampiran 5.
32
Gambar 7 Filogenetik berdasarkan cDNA sitrat sintase beberapa spesies. Skala
menunjukkan jarak
Analisis situs restriksi pada MmFCS dengan NEBcutter (Gambar 8)
menunjukkan bahwa MmFCS mengandung situs BpmI, EcoRI, Cac8I, HindIII,
ScaI, BmrI, NdeI, MseI, BceAI, BsmFI, BstUI, BsaWI, NsiI, AhdI, BspHI, MsII,
BsaBI, FokI, BbsI, NoI, BaeI, PciI, AflIII, NspI, AciI, FauI, BanI, DdeI, BspCNI,
DraIII, XhoI, TliI, BsoBI, SmlI, PaeR71, AvaI, TaqI, BseRI, AfeI, dan HaeII,
sehingga situs-situs tersebut tidak dapat digunakan untuk mengeluarkan sisipan
dalam proses kloning selanjutnya.
Informasi situs-situs pemotongan yang ada di dalam MmFCS sangat
bermanfaat untuk proses pengklonan selanjutnya. Informasi situs pemotongan
oleh enzim restriksi akan mempermudah dalam melakukan penyisipan dan
mengeluarkan sisipan MmFCS dari vektor yang digunakan. Situs pemotongan
33
berguna dalam rekayasa gen yaitu dalam memotong urutan nukleotida tertentu
dan menyambungkan kembali.
Gambar 8 Peta situs enzim restriksi yang terdapat dalam MmFCS
Deduksi asam amino dari nukleotida MmFCS ini menghasilkan 295 asam
amino (Gambar 9). Analisis kesejajaran lokal berdasarkan urutan asam amino
menggunakan BLASTp menunjukkan bahwa MmFCS memiliki kesamaan 99%
dengan bagian
sitrat sintase P. trichocarpa (XP_002330895.1), C. sinensis
(ACU42176.1), C. junos (AAR88248.1), V. vinifera (XP_002271451.1), P. hybrid
(CAA59009.1), Prunus persica (AAL11504.1), A. thaliana (AAM62868.1),
B.
vulgaris subsp.vulgaris (CAA59010.1), Sorghum bicolor (XP_002453470.1),
Oryza sativa (AAG28777.1), N. tabacum (CAA59008.1) dan beberapa spesies
yang lain (Lampiran 6). Kesamaan pada tingkat asam amino memiliki nilai lebih
besar dibandingkan pada nukleotida. Hal ini disebabkan beberapa kodon dapat
menyandikan asam amino yang sama. Kesamaan yang tinggi antara asam amino
hasil deduksi MmFCS dengan asam amino sitrat sintase dari spesies lain
memperkuat bukti bahwa MmFCS merupakan fragmen gen yang penyandi sitrat
sintase. Hasil penyejajaran asam amino dari MmFCS dengan sitrat sintase dari
spesies lain disajikan pada Lampiran 7.
34
1
VTAHPMTQFA SGVMALQVQS EFQQAYEKGI AKSKYWEPTY EDSLNLIARL
51
PLVAAYVYRR IYKGGQSVPV DDSLDYGANF AQMLGLDDPV MHELMRLYVT
101 IHSDHEGGNV SAHTGHLVAS ALSDPYLSFA AALNGLAGPL HGLANQEVLL
151 WIKSVVDECG ENITKEQLKD YVWKTLNSGK VVPGFGHGVL RKTDPRYTCQ
201 REFALKHLPN DPLFQLVSKL YEVVPPVLTQ LGKVKNPWPN VDAHSGVLLN
251 YFGLTEARYY TVLFGVSRSI GICSQLIWDR ALGLPLERPK SVTMX
Gambar 9 Deduksi asam amino dari MmFCS. Asam amino di dalam kotak adalah
daerah penanda sitrat sintase.
Analisis Domain MmFCS
Sitrat sintase terdiri dari 2 domain, yaitu sebuah domain alfa-helik besar
(inter-subunit contact) dan sebuah alfa-helik domain kecil (bagian katalitik)
(Arnott et al.,2000, Larson et al., 2009). Urutan deduksi dari 295 asam amino
MmFCS memiliki residu-residu yang diperlukan sebagai domain katalitik, yaitu 3
residu catalytic triad, 11 residu oxaloacetate binding site,18 residu coenzyme A
binding site dan 14 residu cytrilcoA binding site (Gambar 10). Empat macam situs
tersebut adalah situs utama sekaligus penanda sitrat sintase sesuai dengan yang
dijelaskan oleh Roccatano et al. (2001). Ketiga binding site di atas sangat penting
karena merupakan tempat penempelan substrat dan juga produk. Catalytic triad
adalah 3 asam amino kunci yang berada di dalam situs aktif sitrat sintase, yaitu
His274, His320 dan Asp375, berada pada asam amino ke 142, 187 dan 243. Situs
aktif mutlak diperlukan di dalam suatu enzim, supaya dapat mengkatalis proses
perubahan substrat menjadi produk.
Gambar 10 Domain terkonservasi yang berada pada MmFCS
35
Hasil analisis domain dengan menggunakan program scan pada Prosite
menunjukkan bahwa terdapat sekuen penanda atau penciri bagi enzim sitrat
sintase yang terdapat pada asam amino ke 194-206 (Gambar 9).
Daerah penanda sitrat sintase dari hasil scanning pada Prosite selanjutnya
digunakan sebagai acuan untuk membandingkan dengan urutan asam amino sitrat
sintase dari spesies lainnya. Hasil penyejajaran asam amino deduksi MmFCS dan
beberapa asam amino dari spesies lain menunjukkan bahwa penanda sitrat sintase
dari beberapa spesies tersebut juga mengikuti konsensus G-[FYAV]-[GA]-H -x [IV]-x(1,2)-[RKTQ]-x(2)-[DV]-[PS]-R (Gambar 11). Penanda sitrat sintase ini
memiliki konsensus yang sama untuk prokariot dan juga eukariot. Urutan
nukleotida yang menyandikan daerah penanda sitrat sintase terdapat pada
nukleotida antara posisi 549 sampai dengan 588 (Lampiran 6).
Gambar 11. Urutan asam amino sitrat sintase dari berbagai spesies. Asam amino
di dalam kotak adalah daerah.
Analisis Hidrofobisitas
Analisis hidrofobisitas telah dilakukan dengan metode Kyte and Doolittle
(1982). Analisis pola hidrofobisitas sitrat sintase utuh dari P. trichocarpa dan
analisis perbandingan pola hidrofobisitas yang dibentuk oleh MmFCS dan bagian
dari sitrat sintase P. trichocarpa. Analisis hidrofobisitas menunjukkan bahwa
MmFCS, sitrat sintase P. trichocarpa utuh dan fragmennya bersifat hidrofilik
(Gambar 12, Gambar 13). Hal ini sesuai dengan sifat sitrat sintase yang larut di
dalam air serta di dalam reaksinya memerlukan air untuk merubah oksaloasetat
dan asetil-KoA menjadi sitrat. Pola hidrofobisitas dengan bagian tengah sampai
belakang dari sitrat sintase utuh P. trichocarpa dan MmFCS adalah sama (Gambar
13)
36
Sitrat sintase utuh P. trichocarpa
.
.
Gambar 12 Profil hidrofobisitas sitrat sintase utuh P. trichocarpa. Kurva di atas 0
pada sumbu x menunjukkan sifat hidrofobik dan di bawah 0 bersifat
hidrofilik
Fragmen CS P. trichocarpa berwarna merah
MmFCS berwarna biru
Gambar 13 Perbandingan hidrofobisitas antara MmFCS dengan fragmen sitrat
sintase P. trichocarpa. Kurva di atas 0 pada sumbu x menunjukkan
sifat hidrofobik dan di bawah 0 bersifat hidrofilik.