Analisis Keragaman Genetik Kelapa Sawit

6
et al. (1986) ini akan mengamplifikasi daerah
target tunggal sehingga menghasilkan satu
pita pada proses elektroforesis.
Teknik RAPD juga dikenal sebagai
Arbitrarily Primed PCR (AP-PCR) banyak
digunakan dalam deteksi sidik jari genomik.
Primer akan berikatan dengan banyak situs
pengikatan pada genom dan fragmen
teramplifikasi dari pengikatan tersebut.
Kekuatan
pengikatan
primer
dapat
ditingkatkan setelah beberapa siklus secara
efektif. Hal ini berarti bahwa hanya best
mismatches yang teramplifikasi secara
sempurna. Reprodusibilitas teknik ini sulit
diperoleh pada level yang sama dari
pengikatan primer pada percobaan yang
berbeda (Crouch et al. 2000).
Penggunaan penanda RAPD relatif
sederhana dan mudah dalam hal preparasi.
Teknik RAPD memberikan hasil yang lebih
cepat dibandingkan dengan teknik molekuler
lainnya. Teknik ini juga mampu menghasilkan
jumlah karakter yang relatif tidak terbatas,
sehingga sangat membantu untuk keperluan
analisis keanekaragaman organisme yang
tidak diketahui latar belakang genomnya.
RAPD pada tanaman tahunan dapat digunakan
untuk meningkatkan efisiensi seleksi awal
(Primrose dan Twyman 2006).
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan dalam isolasi
DNA adalah mortar, tabung sentrifus,
sentrifus Beckman Coulter AllegraTM 64R
Centrifuge, penangas air, pipet mikro, pipet
Mohr, bulp, sudip, tabung mikro, neraca
analitik Scaltec, dan dan spektrofotometer
UV-VIS Beckman Coulter DU 530.
Amplifikasi DNA dilakukan dengan alat PCR
(Biometra T-personal dan PCR ESCO
APBIO). Alat-alat untuk elektroforesis terdiri
atas perangkat elektroforesis Toylab, parafilm,
cetakan gel, sisir, power supply, dan alat
untuk
dokumentasi
hasil
pengamatan
elektroforesis UV (UV Transilluminator 2201
Sigma dan kamera Power Shot A640 Canon).
Selain itu digunakan juga autoklaf, gelas
piala, labu Erlenmeyer, gelas ukur, mesin
DNA speed vac (Savant DNA Speed Vac
110), dan program statistik khusus NTSYS
versi 2.02 dengan menggunakan metode
UPGMA (Unweighted Pair Group Method
Arithmatic Mean).
Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi
DNA adalah daun 58 sampel kelapa sawit asal
Jawa Barat, polyvinyl-pyrolidone (PVP) 1.5%,
nitrogen cair, β-merkaptoetanol, bufer
ekstraksi, kloroform : isoamilalkohol (24:1),
isopropanol, bufer TE, Na-asetat 3 M pH 5.2,
etanol absolut, dan etanol 70%. Bufer
ekstraksi merupakan campuran akuades steril,
Tris-HCl 1 M pH 8.0, Ethyline Diamine
Tetraacetic Acid (EDTA) 0.5 M pH 8.0, NaCl
5 M, dan Cetyl trimethylammonium bromide
(CTAB) 10%. Bufer TE terdiri atas akuades
steril, Tris-HCl 1 M pH 8.0, dan Ethyline
Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) 0.5 M pH
8.0. Bahan untuk elektroforesis yaitu loading
buffer (bromfenol blue 2.5% : sukrosa 40%),
agarosa, Ethidium bromide (EtBr) 1% (w/v),
bufer TBE (Tris Base EDTA) 0.5X, dan
marker 1 kb plus DNA ladder. Bahan untuk
amplifikasi meliputi complete buffer, dNTPs,
molecular water (MW) Taq DNA polimerase
(Fermentas), dan primer acak RAPD (OPC,
OPD, OPM, dan OPN).
Metode
Isolasi DNA (Castillo 1994)
Sampel daun kelapa sawit sebanyak 1 g
digerus hingga halus dengan menggunakan
250 ml N2 cair dalam mortar dan PVP 1.5%.
Selanjutnya ditambahkan 1 ml bufer ekstraksi
dan 200 µL β-merkaptoetanol bersuhu 650C.
Lalu dikocok kuat hingga homogen dan
diinkubasi selama 30 menit pada suhu 650C.
Setelah itu, didiamkan hingga suhunya sama
dengan suhu ruang dan ditambahkan 1 ml
kloroform : isoamilalkohol (KI). Kemudian
dikocok dan disentrifugasi 11.000 rpm selama
10 menit pada suhu 250C.
Supernatan yang dihasilkan ditambah 1
volum kloroform : isoamilalkohol (KI) dan
disentrifugasi pada 11.000 rpm selama 10
menit dengan suhu 250C. Kemudian
supernatan ditambah 1 volum isopropanol dan
dikocok perlahan. Campuran tersebut
disimpan pada suhu 40C selama 30 menit.
Setelah itu, dilakukan sentrifugasi pada
11.000 rpm selama 10 menit dengan suhu
250C. Pelet yang dihasilkan dikeringanginkan
selama 10 menit dengan membalikkan tabung.
Pelet lalu ditambahkan dengan 500 µL
bufer TE, 1/10 volum Na-asetat 3 M pH 5.2,
dan 2 volum etanol absolut. Setelah
dihomogenkan, campuran tersebut disimpan
pada suhu -200C selama 30 menit. Proses
selanjutnya yakni sentrifugasi dengan
kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit pada
suhu 40C. Pelet yang dihasilkan ditambah
etanol 70% dan disentrifugasi kembali dengan
kecepatan dan suhu yang sama selama 2
menit. Terbentuknya pelet hasil sentrifugasi
7
dikeringkan dengan speed vacuum. Setelah
itu, pelet ditambah 30 µL bufer TE. DNA
yang diperoleh kemudian dianalisis secara
kuantitatif
dengan
menggunakan
spektrofotometer. Analisis DNA secara
kualitatif dilakukan dengan elektroforesis gel
agarosa 1 %.
Hasil isolasi diuji kemurniannya melalui
elektroforesis gel agarosa 1% dengan aliran
tegangan listrik sebesar 75 V. Adanya
kontaminan yang tampak dari band hasil
elektroforesis
kemudian
dimurnikan.
Pemurnian
dilakukan
dengan
cara
ditambahkan RNase 2 µg/mL. Selanjutnya
dilakukan inkubasi di waterbath bersuhu 370C
selama 60 menit.
Uji kualitatif DNA
Tujuan pengujian ini yakni untuk
mengetahui DNA kelapa sawit yang berhasil
diisolasi sehingga dapat diketahui kualitas
DNA yang diperoleh. Mulanya dibuat gel
agarosa 1% untuk elektroforesis dengan
dilarutkannya agarosa 0.6 g dalam 60 ml
larutan TBE 0.5X. Kemudian dipanaskan
hingga larut dan didinginkan pada suhu kamar
hingga hangat. Selanjutnya ditambahkan 3 µl
EtBr dan dituang ke dalam cetakan gel
elektroforesis yang telah dipasangi sisir
(cetakan sumur) hingga gel memadat. Gel
yang sudah padat dipindahkan ke dalam bak
elektroforesis yang berisi TBE 0.5X. Sampel
yang akan dielektroforesis dicampur dengan
loading buffer dengan perbandingan 1:5 pada
parafilm. Setelah tercampur maka diinjeksi ke
dalam sumur gel agarosa. Marker yang
digunakan adalah 1 kb plus DNA ladder
sebanyak 0.8 µL. Setelah semua sampel
selesai diinjeksi maka alat elektroforesis
dihubungkan pada power supply yang dialiri
tegangan listrik 75 volt selama ± 1 jam. Hasil
elektroforesis diamati dengan bantuan lampu
UV dalam transilluminator.
Uji kuantitatif DNA
Pengujian dilakukan dengan metode
spektrofotometri. Suspensi DNA hasil isolasi
sebanyak 2 µl diencerkan menjadi 200 µl
dengan ditambahkannya MW. Hal ini untuk
menghindari kesalahan pembacaan yang
timbul akibat sampel yang terlalu pekat.
Selanjutnya dibaca absorban pada panjang
gelombang (λ) 260 nm, 280 nm, dan 230 nm.
Pengukuran pada panjang gelombang 280 nm
dilakukan
untuk
mengetahui
adanya
kontaminasi protein sedangkan pada panjang
gelombang 230 nm untuk mengetahui
kontaminasi polisakarida dan fenol. Tingkat
kemurnian DNA ditentukan dengan nilai
perbandingan A260/A280. Nilai perbandingan
A260/A280 yang baik sekitar 1.6-1.8. Serapan
maksimum radiasi UV oleh DNA berada pada
panjang gelombang 260 nm. Konsentrasi
DNA yang baik belum sepenuhnya menjamin
kualitas DNA juga baik.
PCR RAPD DNA Kelapa Sawit (Williams
et al. 1990)
Pembuatan
campuran
reaksi
PCR
dilakukan pada tabung mikro dengan
komposisi antara lain 1 µL sampel DNA (50
ng), 2.5 µL buffer complette 10X, 1 µL
dNTPs 10 mM, 1 µL primer acak (OPC, OPD,
OPM, OPN) RAPD 10 µM, 0.5 µL Taq DNA
polimerase, 19 µL MW (Molecular Water)
sehingga volume total menjadi 25 µL.
Campuran tersebut kemudian dihomogenisasi
dengan menggunakan speed vac selama
beberapa saat kemudian dimasukkan ke dalam
mesin PCR.
Program suhu yang digunakan pada PCR
terdiri atas dua tahap siklus. Tahap pertama
berlangsung selama satu kali siklus dengan
suhu 92°C selama 2 menit untuk denaturasi
awal, 92°C selama 3 menit 30 detik untuk
penyempurnaan proses denaturasi DNA, 35°C
selama 1 menit untuk penempelan primer, dan
72°C selama 1 menit untuk tahapan
perpanjangan rantai. Untuk siklus berikutnya
program suhu yang digunakan 92°C selama 1
menit untuk denaturasi DNA, 35°C selama 1
menit untuk penempelan primer, 72°C selama
2 menit untuk tahapan perpanjangan rantai
hingga sebanyak 44 kali siklus, serta 72°C
selama 7 menit terakhir untuk memastikan
DNA yang diamplifikasi terdenaturasi
seluruhnya. Hasil PCR kemudian dilihat dan
dipisahkan
dengan
menggunakan
elektroforesis gel agarosa.
Elektroforesis hasil amplifikasi
Elektroforesis hasil amplifikasi dilakukan
menggunakan gel agarosa 1.5%. Sebelum
dilakukan elektroforesis, hasil amplifikasi
dicampurkan dengan loading buffer terlebih
dahulu dengan perbandingan 1:5. Marker
yang digunakan adalah 1 kb plus DNA ladder
sebanyak 0.8 µL. Elektroforesis dialiri
tegangan listrik 75 volt selama ± 60 menit.
Hasil elektroforesis diamati dengan bantuan
lampu UV dalam transilluminator.
Analisis hasil elektroforesis
Fragmen hasil amplikasi yang dilakukan
merupakan lokus DNA yang bersifat
dominan. Evaluasi dari pita-pita yang