BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis - Digital Repository

26
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Jenis penelitian ini merupakan jenis penelitian deskriptif untuk karakterisasi
gen virulen dan eksperimental pada uji patogenesitas dengan menggunakan LD50
96 jam (Reed & Muench, 1983).
B. Subjek dan Sampel Populasi
Populasi yang digunakan dalam penelitian adalah isolat bakteri Aeromonas
hydrophila yang terdapat di Balai Riset Budidaya Air Tawar (BRBAT) Bogor.
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat terpilih bakteri
Aeromonas hydrophila strain A2 berasal dari ikan botia.
C. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dimulai pada bulan Maret 2012 sampai dengan Agustus 2012
yang dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Universitas Pendidikan
Indonesia, Jalan Dr. Setiabudhi No.299 Bandung.
D. Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdapat di Laboratorium
Mikrobiologi Universitas Pendidikan Indonesia. Daftar alat dan bahan dapat
dilihat pada lampiran 1 dan 2.
Annisa Syadza, 2012
Karakterisasi Gen Virulen dan Uji Patogenesitas Aeromonas Hydrophila Strain A2 Pada Ikan
Gurami (Osphronemus Gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu
27
E. Prosedur Penelitian
1. Tahap Persiapan
a. Pembuatan Medium sebagai Media Tumbuh Bakteri Aeromonas
hydrophila
Medium yang digunakan adalah medium TSA (Trypic Soy Agar) dan RS
(Rimler Shotts). Alat-alat kaca dan plastik yang akan digunakan dicuci terlebih
dahulu dan dikeringkan. Alat kemudian dibungkus dengan kertas pembungkus
setelah dimasukan ke dalam plastik untuk dilakukan sterilisasi panas lembab
dengan cara dimasukan kedalam autoklaf selama 15-20 menit pada suhu 121°C
dan tekanan 15 lb.
b. Perbanyakan dan Pemeliharaan Kultur Aeromonas hydrophila
Kultur murni Aeromonas hydrophila yang telah didapatkan dari Balai Riset
Budidaya Air Tawar (BRBAT) Bogor, di sub kultur dengan cara mengambil satu
ose kultur murni Aeromonas hydrophila, kemudian di tanam ke dalam medium
TSA miring dan diinkubasi pada suhu 28°C.
2. Tahap Penelitian
a. Karakterisasi Isolat A. hydrophila
Karakterisasi isolat bakteri Aeromonas hydrophila dilakukan dengan cara
biokimia dan biologi molekuler. Secara biokimia dilakukan dengan Standar
Nasional Indonesia (2009) untuk Aeromonas hydrophila dan secara biologi
molekuler dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan
primer spesifik untuk Aeromonas hydrophila yang di disain oleh Dorsch,et.al,.
Annisa Syadza, 2012
Karakterisasi Gen Virulen dan Uji Patogenesitas Aeromonas Hydrophila Strain A2 Pada Ikan
Gurami (Osphronemus Gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu
28
(1994). Primer spesifik ini pun telah banyak digunakan oleh beberapa peneliti
seperti Gardenia, et.al,.(2010), Nielsen, et.al., (2001) dan Delabre, et.al.,(1998).
1) Karakterisasi Biokimia
a) Uji Motilitas
Isolat diambil dengan jarum ose lurus, kemudian diinokulasikan dengan
menggunakan media semi solid (SIM Agar) lalu diinkubasikan pada suhu 28°C
selama 18-24 jam.
b) Uji Oksidase
Kertas saring dibasahi dengan pereaksi oksidasi, lalu diambil satu loop isolat
bakteri, goreskan pada kertas saring yang sudah dibasahi pereaksi oksidasi. Reaksi
oksidasi positif ditandai dengan munculnya warna biru keunguan pada goresan.
c) Uji Oksidatif- fermentatif (O/F)
Tabung berisi media O/F disiapkan untuk diinokulasikan bakteri dengan
cara ditusukkan. Satu tabung diisi dengan parafin cair steril hingga ketinggian
1cm diatas permukaan media O/F sedangkan tabung lainnya tanpa parafin cair.
Reaksi fermentatif ditandai dengan perubahan warna media pada tabung yang
diisi parafin cair dari hijau menjadi kuning.
d) Uji Rimmler-Shoots (RS)
Kultur bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose, bakteri
diinokulasikan ke dalam media RS lalu diinkubasi pada suhu 37° selama 18-24
jam. Penampakan koloni dilihat dengan hasil positif menunjukan berwarna kuning
tanpa warna hitam di tengah koloni.
Annisa Syadza, 2012
Karakterisasi Gen Virulen dan Uji Patogenesitas Aeromonas Hydrophila Strain A2 Pada Ikan
Gurami (Osphronemus Gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu
29
e) Pewarnaan gram
Gelas objek yang telah dibersihkan dari lemak dengan alkohol 70% dan
diberi label. Teteskan aquades steril pada permukaan gelas objek. Kemudian isolat
diambil dengan jarum ose steril, dicampur dengan aquades dan diulas merata pada
permukaan gelas objek. Dilakukan fiksasi panas dengan melewatkan preparat di
atas api. Sediaan mikroskop yang sudah kering ditetesi dengan kristal violet
secara merata dan didiamkan selama satu menit. Kemudian teteskan larutan
alkohol aseton pada preparat sampai merata dan diamkan maksimal 30 detik.
Preparat di cuci dengan aquades dan dikeringkan. Kemudian teteskan larutan
safranin pada preparat sampai merata dan diamkan selama dua menit. Dicuci
kembali dengan aquades dan dikeringkan.
2) Karakterisasi Biologi Molekuler
a) Kultivasi bakteri sampel
Isolat bakteri yang telah didapatkan dari BRBAT Bogor yang berasal dari
ikan botia, ditumbuhkan kembali atau di sub kultur ke dalam medium TSA
(Trypic Soy Agar) di cawan petri untuk mendapatkan biakan murni dari isolat
Aeromonas hydrophila. Kemudian diinkubasikan pada suhu 28°C selama 24 jam
pada kondsi aerob. Keesokan harinya, bakteri yang telah tumbuh pada media TSA
dipindahkan ke media TSB (Trypic Soy Broth) dengan dimasukkan sebanyak satu
ose kultur padat ke dalam TSB kemudian diinkubasikan pada suhu 28°C dengan
lama inkubasi selama 14 jam. Koloni bakteri tunggal yang tumbuh pada medium
cair tersebut kemudian diisolasi DNAnya.
Annisa Syadza, 2012
Karakterisasi Gen Virulen dan Uji Patogenesitas Aeromonas Hydrophila Strain A2 Pada Ikan
Gurami (Osphronemus Gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu
30
b) Isolasi DNA Bakteri
Isolasi DNA mengacu pada proses Isolasi DNA dengan beberapa modifikasi
pada beberapa langkah proses isolasi.
Hasil kultivasi bakteri yang merupakan kultur cair diambil sebanyak 1,5 ml
dan dimasukkan ke tabung ependorf kemudian disentrifugasi pada kecepatan
5.000 rpm selama dua menit. Supernatan pada tabung ependorf dibuang dan pada
pelet yang terbentuk ditambahkan 500µl TE pH 8,0 dan 100µl SDS, pelet tersebut
dihomogenkan dengan cara dibolak balik pelan. Hal ini dimaksudkan untuk
mendenaturasi protein sehingga membran sel akan mengalami lisis. Setelah pelet
tersebut homogen kemudian ditambahkan 10µl proteinase-K dan diinkubasi pada
suhu 37°C selama satu jam. Selama proses inkubasi, tabung dibolak balik setiap
15 menit sekali.
Selanjutnya, pada pelet ditambahkan NaCl 5 M sebanyak 100 µl. Kemudian
ditambah 100µl CTAB yang telah dipanaskan pada suhu 65°C selama lima menit
untuk menghancurkan makromolekul dalam sel. Kemudian isolat DNA
diinkubasikan pada suhu 65°C selama 20 menit. Setelah proses inkubasi selesai
dilanjutkan dengan penambahan 500µl Chloroform:Isoamil alkohol untuk
membantu proses denaturasi protein. Selain itu Cl ini juga berfungsi sebagai
antibuih ketika dikocok. Kemudian, sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm
selama lima menit, setelah itu dikocok cepat kemudian supernatan dibuang dan
ditambahkan kembali 500µl Chloroform:Isoamil alkohol. Sentrifugasi kembali
pada kecepatan dan waktu yang sama sampai cukup bersih dari protein.
Annisa Syadza, 2012
Karakterisasi Gen Virulen dan Uji Patogenesitas Aeromonas Hydrophila Strain A2 Pada Ikan
Gurami (Osphronemus Gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu
31
Pada tabung ependorf akan terbentuk tiga fasa, yaitu fasa atas, tengah dan
bawah. Kemudian fasa atas tersebut diambil dengan ujung tips yang steril. Lalu
fasa ini dipindahkan ke tabung ependorf yang baru, dan ditambahkan Etanol
absolut dingin sebanyak dua kali volume fasa tersebut. Tabung ependorf digoyang
pelan dengan cara dibolak-balik minimal 50 kali lalu disimpan pada suhu -20°C
selama 20 menit untuk melepas molekul air. Setelah proses pendinginan
kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama lima menit sehingga
terbentuk dua fasa yaitu supernatan dan pelet.
Selanjutnya supernatan dibuang sehingga yang tersisa hanya pelet DNA. Pelet
ini kemudian ditambahkan satu ml Etanol 70% dingin, lalu disentrifugasi pada
13.000 rpm selama lima menit. Setelah sentrifugasi supernatan dibuang, dan
dikeringkan untuk menguapkan sisa-sisa etanol. Ditambahkan ke dalam tabung
Ependorf yang berisi pelet tersebut sebanyak 20µl TE steril untuk melarutkan
DNA kemudian diinkubasikan pada suhu 37°C selama 5 menit. Simpan pada suhu
-20°C.
c) Karakterisasi Primer Spesifik dan Gen Virulen dengan Metode PCR
Fragmen DNA gen virulen di amplifikasi menggunakan teknik PCR.
Amplifikasi PCR dilakukan dengan total volume reaksi 25µl yang berisi 12,5 µl
2x KAPA2G Fast ReadyMix; 8 deion steril; 1,25 µl masing-masing primer
(forward dan reverse) gen virulen dan 2 µl DNA template, pada pelaksanaan
dapat digunakan ½ volume. Campuran reaksi tersebut dimasukkan ke dalam
Annisa Syadza, 2012
Karakterisasi Gen Virulen dan Uji Patogenesitas Aeromonas Hydrophila Strain A2 Pada Ikan
Gurami (Osphronemus Gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu
32
thermocycler Ependorf dengan program suhu sesuai dengan gen virulen yang
digunakan.
Program PCR untuk primer spesifik A. hydrophila adalah dengan suhu awal
denaturasi 95°C selama 4 menit terdiri dari 30 siklus, denaturasi 95°C selama 30
detik, Annealing 54°C selama 45 detik, elongasi 72°C selama 30 detik dan
diakhiri dengan final elongasi 72°C selama 10 menit (Gardenia, et.al., 2010).
95° (4’) 95° (30”)
72° (30”) 72° (10’)
54° (45”)
gambar 3.1 Program PCR Primer Spesifik
Program PCR untuk gen virulen dengan metode touchdown suhu
awal
denaturasi 94°C selama 5 menit terdiri dari 45 siklus, denaturasi 94°C selama 30
detik, anneling 54°C (aerA) (Gardenia, et. al.,2010), 58°C (AscV dan aopB)
(Carvalho-Castro,et al.,2010) , 54-62°C (AexT) (Vilches, et al., 2009)
(menggunakan metode PCR touchdown) selama 30 detik, elongasi 72 °C selama
60 detik dan final elongasi 72°C selama 10 menit (Li, et.al. 2010).
94° (5’)
58° (30”)
72° (60”) 72° (10’)
72° (60”)
72° (60”)
72° (60”)
54° (30”)
94° (5’)
94° (5’)
94° (5’)
94° (30”)
58° (30”)
54°-58°(30”)
gambar 3.2 Program PCR touchdown Gen Faktor Virulen
Annisa Syadza, 2012
Karakterisasi Gen Virulen dan Uji Patogenesitas Aeromonas Hydrophila Strain A2 Pada Ikan
Gurami (Osphronemus Gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu
33
Hasil PCR ini dianalisis dengan elektroforesis gel agarose 2%. 5µl hasil
amplikon dicampur terlebih dahulu dengan loading buffer sebanyak 2 µl.
Elektroforesis dilakukan selama 40 menit pada tegangan 100 volt dengan buffer
TBE 1x sebagai running buffer. Gel diwarnai dengan 0,5 µg/ml Ethidium bromida
selama tiga menit dan pembersihan dengan deion steril selama lima menit. Hasil
elektroforesis dilihat dengan alat sinar UV pada panjang gelombang 312 nm dan
didokumentasikan menggunakan kamera digital. Pita yang dilihat adalah yang
tebal dan jelas terlihat. Marker yang digunakan adalah yang berukuran 100 pb.
b. Aklimasi Ikan
Perlu dilakukan penyesuaian diri ikan dengan kondisi di laboratorium dan
akuarium. Akuarium yang digunakan disertai sistem aerasi yang sudah
desinfektan dengan cara menggunakan larutan kalium permanganat (KMnO4) 2,5
mg/L selama 24 jam. Aklimasi dilakukan pada suhu 28°C selama 14 hari di
akuarium aklimasi dan . Pada penelitian kali ini aklimasi dilakukan selama dua
minggu dan ikan yang digunakan adalah ikan gurami untuk uji patogenesitas.
Setiap 2 kali sehari diberi makan sebanyak 72,5 gram untuk 50 ekor ikan.
c. Pembuatan Kurva Pertumbuhan A. hydrophila
Kurva tumbuh menggambarkan pertumbuhan mikroba dalam suatu kultur.
Pertumbuhan kurva tumbuh bertujuan untuk menentukan umur inokulum
Aeromonas hydrophila terbaik dalam medium sebelum diinjeksikan ke gurami.
Annisa Syadza, 2012
Karakterisasi Gen Virulen dan Uji Patogenesitas Aeromonas Hydrophila Strain A2 Pada Ikan
Gurami (Osphronemus Gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu
34
Metode yang digunakan dalam pembuatan kurva ini adalah metode yang
dilakukan Cappuccino (1987) dengan beberapa modifikasi.
1) Kurva tumbuh A. hydrophila
Bakteri uji diaktivasi terlebih dahulu dengan menginokulasikan satu ose
bakteri yang diambil dari biakan murni ke dalam labu erlenmeyer yang berisi 10
ml medium TSB (Trypic Soy Broth) lalu diinkubasikan pada waterbath shaker
dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 28°C selama 24 jam. Kemudian
dipindahkan ke dalam medium TSB 90 ml selama 24 jam dan dilihat setiap dua
jam sekali. Metode yang digunakan untuk membuat kurva tumbuh ini dinamakan
metode turbidimetri. Setiap 2 jam, diambil sebanyak 5ml dari labu kultur, lalu
dimasukkan ke dalam cuvete. Kemudian nilai absorbansi dihitung menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Kurva tumbuh dibuat
berdasarkan hasil hubungan nilai absorbansi dengan waktu. Dari kurva tumbuh ini
dapat diketahui umur biakkan pada saat mencapai fase log. Pada fase log inilah
ditemukan laju pertumbuhan Aeromonas hydrophila sehingga umur inokulum
untuk uji aktivasi dapat ditentukan (Cappuccino, 1987).
2) Penentuan Umur Inokulum
Dalam menentukan umur inokulum dapat dilakukan dengan metode cawan
tuang. Satu ose Aeromonas hydrophila ditumbuhkan dalam medium TSB 10 ml,
dikocok dengan water bath pada kecepatan 120 rpm dengan suhu 28°C selama 24
jam. Kemudian dari medium TSB 10 ml dituangkan ke dalam 90 ml TSB dan
setiap 2 jam sekali di cek OD dan dituangkan ke dalam cawan dengan medium
Annisa Syadza, 2012
Karakterisasi Gen Virulen dan Uji Patogenesitas Aeromonas Hydrophila Strain A2 Pada Ikan
Gurami (Osphronemus Gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu
35
TSA, diinkubasi pada suhu 28°C selama 24 jam dan dikocok pada kecepatan 120
rpm. Kemudian diamati jumlah bakteri dengan kisaran yang dapat dihitung 30300 koloni (Cappuccino, 1987).
Penentuan umur inokulum yang optimal dapat dilakukan dengan cara
menghitung laju pertumbuhan yang paling pesat menggunakan rumus :
µ = Log Ax –Log Ao
2,031 . Δt
Keterangan :
µ : laju pertumbuhan
Ax : Jumlah populasi bakteri setelah waktu tertentu
Ao : Jumlah populasi awl bakteri
Δt : Selang waktu antara pengukuran jumlah populasi awal bakteri (Ao) dan
populasi setelah waktu tertentu (Ax)
3) Kurva baku A. hydrophila
Pembuatana kurva dilakukan untuk mengetahui jumlah bakteri dalam satu
inokulum. Pertama-tama dilakuakan aktivasi bakteri menggunakan medium TSB
sebanyak 10 ml yang sebelumnya dimasukkan biakan bakteri sebanyak satu ose.
Kemudian kultur diinkubasi pada waterbath shaker dengan kecepatan 120 rpm
dengan suhu 28°C selama 24 jam. Setelah 24 jam, biakan bakteri yang telah
diaktivasi tadi ditambahkan ke dalam labu erlenmeyer lain yang berisi 90 ml
medium TSB lalu diinkubasi lagi dengan kecepatan 120 rpm dan suhu 28°C
selama waktu yang dibutuhkan untuk mencapai fase logaritmik. Fase logaritmik
ini dapat diketahui berdasarkan hasil pembuatan kurva tumbuh bakteri. Pada fase
Annisa Syadza, 2012
Karakterisasi Gen Virulen dan Uji Patogenesitas Aeromonas Hydrophila Strain A2 Pada Ikan
Gurami (Osphronemus Gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu
36
ini kemudian di ambil dengan memasukkan 5 ml inokulum ke dalam cuvete
untuk dihitung nilai absorbansi dengan panjang gelombang 540 nm. Bersamaan
dengan itu, diambil 1 ml biakan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml NaCl
steril untuk pengenceran 10-1 lalu dihomogenkan dengan vortex. Dari tabung
pengenceran kemudian diambil kembali sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam
9 ml NaCl steril lain untuk pengenceran 10-2 hingga 10-9. Pada pengenceran 10-8,
10-7, 10-6 diambil 1 ml biakan, lalu dimasukan ke dalam cawan petri steril,
kemudian dicampurkan dengan 9 ml medium TSA. Biakan diinkubasikan pada
suhu 28°C selama 24 jam. Jumlah koloni bakteri uji yang tumbuh dihitung dengan
menggunakan colony counter.
Kurva baku dibuat berdasarkan hasil regersi linier yang menghubungkan
antara kerapatan optic (Optical Density) sebagai sumbu X dan hasil perhitungan
jumlah koloni bakteri sebagai sumbu Y.
d.
Re-virulensi dengan Medium Agar Darah
Karakter dari bakteri patogen adalah kemampuannya untuk melakukan infeksi
pada inangnya, hal inilah yang menjadi dasar perlu dilakukannya re-virulensi
bakteri A. hydrophila untuk mengaktifkan kembali kemampuan virulensi pada
inangnya. Pada tahap ini digunakan medium agar darah dengan menggunakan
darah kuda ditambahkan antibiotik ampicilin. Satu koloni bakteri yang telah
ditubuhkan dan di purifikasi diambil dengan jarum ose kemudian di purifikasi
pada medium agar darah di cawan petri kemudian disimpan pada suhu 37°C.
Kemudian esok harinya diamati dan dilakukan kembali purifikasi. Hal ini
Annisa Syadza, 2012
Karakterisasi Gen Virulen dan Uji Patogenesitas Aeromonas Hydrophila Strain A2 Pada Ikan
Gurami (Osphronemus Gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu
37
dilakukan sebanyak minimal tiga kali. Sebagai bahan penyuntikan maka diambil
satu koloni dari hasil purifikasi yang terbentuk (BD, 2012).
Dalam pelaksanaan re-virulensi pada agar darah ini dapat diketahui karakter
hemolitik dari bakteri Aeromonas hydrophila dengan munculnya luas zona bening
yang terbentuk.
e. Patogenesitas Bakteri A. hydrophila pada ikan Gurami
Infeksi ikan dilakukan dengan cara melarutkan satu ose inokulum bakteri
Aeromonas hydrophila pada medium TSB 10 ml kultur kemudian diinkubasi pada
waterbath shaker dengan kecepatan 120 rpm dengan suhu 28°C selama 24 jam.
Setelah 24 jam, biakan bakteri yang telah ditumbuhkan tadi ditambahkan ke
dalam labu erlenmeyer lain yang berisi 90 ml medium TSB lalu diinkubasi lagi
dengan kecepatan 120 rpm dan suhu 28°C selama waktu umur inokulum yang
optimal. Kemudian disentrifugasi terbentuk dua fasa, fasa cair dibuang dan pelet
di larutkan dalam NaCl 5 ml. Kemudian, dilakukan pengenceran 100x dan di cek
OD dari bakteri tersbut, hasil OD yang didapat kemudian dimasukan kedalam
persamaan hasil kurva baku.
Sebagai dosis penyuntikan maka perlu diencerkan kembali sesuai dengan hasil
perhitungan dari persamaan dan disesuaikan dengan konsentrasi yang dibutuhkan
yaitu 1x108, 1x106, 1x104.
Sebelum penyuntikan ikan dikondisikan dala keadaan stres dengan cara satu
hari sebelumnya tidak diberi makan dan pada saat penyuntikan dibuang air dalam
air sehingga tersisa sekitar 5 cm tinggi air. Penyuntikan dilakukan dalam air
dengan suhu 25°C dan diambil 0,1ml disuntik di bagian intraperitoneal. Ikan yang
Annisa Syadza, 2012
Karakterisasi Gen Virulen dan Uji Patogenesitas Aeromonas Hydrophila Strain A2 Pada Ikan
Gurami (Osphronemus Gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu
38
telah disuntikan dikembalikan ke dalam akuarium dan diamati selama 96 jam atau
sampai timbul gejala klinis.
f.
Pengamatan
1) Pengamatan dilakukan selama 96 jam dengan melihat angka kematian dari
ikan gurami.
2) Apabila dalam waktu pengamatan terdapat ikan yang mati maka ikan diambil
dan di cek dengan medium RS dan dicatat waktu kematiannya.
3) Pengamatan yang dilakukan dengan melihat gejala klinis yang ditimbulkan
dan ikan yang mati.
4) Isolasi dan identifikasi bakteri pada ikan gurami yang mati ataupun yang
menimbulkan gejala klinis untuk memastikan penyebab kematiannya dengan
menggunakan medium selektif RS yang kemudian diidentifikasi secara
biokimia dan molekuler.
g.
Analisis Data dengan LD50 96 jam
Pengaruh bakteri Aeromonas hydrophila yang diberikan dengan injeksi pada
ikan gurami dilihat dari jumlah persentase jumlah ikan yang hidup pada tiap dosis
yang diberikan dengan perhitungan LD50 (Reed & Muench 1983).
Annisa Syadza, 2012
Karakterisasi Gen Virulen dan Uji Patogenesitas Aeromonas Hydrophila Strain A2 Pada Ikan
Gurami (Osphronemus Gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu
39
h.
Alur Penelitian
Urutan penjelasan mengenai prosedur penelitian yang dilakukan sesuai dengan
alur penelitian adalah sebagai berikut :
Persiapan Penelitian
1. Pembuatan medium
2. Perbanyakan kultur murni
Aeromonas hydrophila
Karakterisasi bakteri
1. Biokimia (SNI, 2009)
2. Biologi molekuler (Li,2010)
Aklimasi ikan gurami
selama minimal 1
minggu
Re-virulensi dengan medium agar
darah
Uji Patogenesitas ke ikan gurami
(Reed, 1983)
Analisis data
Annisa Syadza, 2012
Karakterisasi Gen Virulen dan Uji Patogenesitas Aeromonas Hydrophila Strain A2 Pada Ikan
Gurami (Osphronemus Gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu
40
Annisa Syadza, 2012
Karakterisasi Gen Virulen dan Uji Patogenesitas Aeromonas Hydrophila Strain A2 Pada Ikan Gurami
(Osphronemus Gouramy)
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu