Filogeni berdasarkan sekuens dna mitokondria gen Cytochrome

1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Sapi merupakan hewan ternak dengan
keanekaragaman jenis yang tinggi dan
ditemukan hampir di semua negara termasuk
Indonesia. Sapi (Bos sp.) merupakan
anggota famili Bovidae, subfamili Bovinae,
genus Bos (Geraads 1992; Buntjer 1997).
Subfamili Bovinae dibagi menjadi tiga
kelompok, yaitu Tragelaphini, Boselaphini,
dan Bovini. Kelompok Bovini terdiri atas
spesies sapi dan kerbau, baik liar maupun
yang telah didomestikasi, dan mulai
berdiferensiasi lebih dari 4 juta tahun lalu
(Lenstra & Bradley 1999). Menurut Perkins
(1969), domestikasi sapi pertama kali
ditemukan di Turki dengan dua tipe sapi,
yaitu tipe berpunuk (Zebu) dan tidak
berpunuk (Taurin). Sebagian besar sapi di
wilayah Asia merupakan keturunan tipe Bos
indicus atau dikenal sebagai sapi zebu,
sedangkan sapi yang tersebar di wilayah
Eropa termasuk dalam spesies Bos taurus
atau sapi taurin (Bradley & Cunningham
1999).
Sapi bali yang terdapat di Indonesia,
berbeda dari tipe B. indicus dan B. taurus,
dan berasal dari domestikasi yang terpisah.
Sapi bali memiliki karakteristik berukuran
sedang, tidak berpunuk, memiliki warna
putih pada bagian belakang paha, bagian
perut, dan keempat kaki bawah sampai di
atas kuku (white stocking) (Payne &
Rollinson 1973). Sapi bali yang ada saat ini
diduga berasal dari hasil domestikasi
Banteng liar (Bibos banteng), dan proses
domestikasi sapi bali ini terjadi sebelum
3500 SM (Rollinson 1984). Mereka
diklasifikasikan sebagai B. javanicus, serta
memiliki kromosom 2n=60, hampir sama
dengan B. indicus dan B. taurus (Bradley &
Cunningham 1999).
Bangsa sapi memiliki karakteristik
tertentu
yang
sama.
Berdasarkan
karakteristik
tersebut
mereka
dapat
dibedakan dari ternak lainnya meskipun
masih
dalam
spesies
yang
sama.
Karakteristik yang dimiliki dapat diturunkan
ke generasi berikutnya. Sapi-sapi yang
terdapat
di
Indonesia
mempunyai
karakteristik warna kulit maupun ukuran
tubuh yang berbeda tergantung dari asal
tetuanya. Perkembangan jenis sapi di
Indonesia berasal dari sapi asli seperti sapi
bali dan juga sapi hasil silangan yang telah
menjadi sapi lokal seperti sapi pesisir, sapi
madura, sapi aceh, sapi Sumba Ongole (SO)
dan sapi Peranakan Ongole (PO) (Martojo
2003; Jakaria 2008). Dalam upaya
membedakan masing-masing sapi lokal
Indonesia tersebut, struktur morfogenetik
saja tidak cukup untuk membedakan
keaslian
dan
asal-usulnya.
Untuk
memperjelas asal-usul sapi tersebut dapat
digunakan penanda genetik molekuler.
Salah satu penanda molekuler yang
sering digunakan sebagai pembeda adalah
gen cytochrome oxidase subunit I (COI).
Salah satu kelebihan gen COI sebagai
penanda analisis filogeni adalah asam amino
pada fragmen COI jarang mengalami
substitusi. Namun demikian, basa-basa pada
triple codonnya masih berubah dan bersifat
silent (perubahan basa yang tidak merubah
jenis asam amino). Perubahan yang bersifat
silent tersebut berasal dari substitusi basa
kodon ketiga (Lynch & Jarrell 1993).
Fragmen basa nukleotida COI bersifat
conserved (lestari) maka berguna untuk
merekonstruksi filogenetik pada cabang
evolusi tingkat spesies (Palumbi 1996).
Selain itu, COI juga dapat digunakan
sebagai DNA barcoding karena sedikit
sekali delesi dan insersi dalam sekuennya,
serta variasinya juga sedikit. Oleh karena itu,
sekuens yang bersifat conserved merupakan
identitas spesies (Hebert et al. 2003).
Beberapa penelitian telah menggunakan
daerah COI sebagai penanda pada beberapa
hewan seperti pada primata (Wu et al.
2000), Cestoda (Taenia) (Gasser et al.
1999), dan Hemiptera (Rahayuwati 2009).
Filogeni adalah sejarah mengenai garis
evolusi suatu kelompok organisme atau
makhluk hidup (Coccone 1999). Filogeni
sapi telah dipelajari berdasarkan analisis
morfologi (Geraads 1992) dan molekuler
seperti
sekuensing
gen
mitokondria
cytochrome oxidase subunit II (COII)
(Janecek et al. 1996), sekuensing D-loop
DNA mitokondria (Sutopo 2001; Abdullah
2008),
dan
sekuensing
mitokondria
cytochrome b (Schreiber et al. 1999). Hasil
penelitian Abdullah (2008) menunjukkan
berdasarkan runutan daerah D-loop DNA
mitokondria, sapi aceh, pesisir, dan PO
terletak dalam kelompok yang sama serta
memiliki jarak genetik yang lebih dekat
dengan B. indicus (zebu), sedangkan sapi
bali dan madura terletak dalam kelompok
sendiri. Selain DNA mitokondria, analisis
molekuler juga menggunakan DNA inti
yaitu mikrosatelit (Sutopo 2001; Abdullah
2008). Berdasarkan DNA mikrosatelit
2
Abdullah (2008) menunjukkan bahwa sapi
aceh, pesisir, dan PO terletak dalam
kelompok yang sama dengan sapi madura,
sedangkan sapi bali terletak dalam kelompok
yang terpisah.
Penelitian mengenai filogeni sapi
berdasarkan DNA mitokondria gen COI
belum pernah dilakukan sebelumnya,
sehingga hasil penelitian ini diharapkan
dapat digunakan untuk merekonstruksi
pohon filogenetik beberapa bangsa sapi
lokal Indonesia.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan menganalisis
keragaman genetik beberapa bangsa sapi
lokal Indonesia dan mengetahui hubungan
kekerabatannya berdasarkan sekuens DNA
mitokondria gen COI.
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Oktober 2010 hingga April 2011 di
Laboratorium Biologi Molekuler Pusat
Penelitian
Sumberdaya
Hayati
dan
Bioteknolgi (PPSHB) dan Laboratorium
Genetika
Molekuler
Ternak
Bagian
Pemuliaan
dan
Genetika
Ternak,
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi
Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut
Pertanian Bogor, Bogor.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Sampel darah sapi yang digunakan
dalam penelitian ini adalah sampel darah
sapi bali (n = 2), madura (n = 2), aceh (n =
2), pesisir (n = 2), dan PO (n = 2) koleksi
Laboratorium Genetika Molekuler Ternak
Bagian Pemuliaan dan Genetika Ternak
Institut Pertanian Bogor, Bogor. Bahan
purifikasi yang digunakan yaitu etanol
absolut, etanol 70%, ddH2O, SDS 10%,
Proteinase K 5 mg/ml, 1X STE, larutan
fenol, CIAA (kloroform: isoamil alkohol
=24:1), NaCl 5 M, dan larutan TE.
Metode
Ekstraksi dan Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan
menggunakan metode fenol (Sambrook et
al. 1989). Sampel darah sapi yang disimpan
dalam etanol absolut dipindahkan ke tabung
1.5 ml sebanyak 200 µl, ditambah dengan
1000 µl low TE, divortex dan didiamkan ± 5
menit. Kemudian disentrifugasi pada
kecepatan 8000 rpm selama 5 menit dan
supernatannya dibuang. Hal ini dilakukan
sebanyak dua kali dengan tujuan untuk
menghilangkan kandungan alkohol yang
terdapat di dalam sampel darah sapi. Setelah
itu, ditambah 40 µl SDS 10%, 10 µl
Proteinase K 5 mg/ml, dan 1X STE sampai
400 µl, dikocok pelan dalam inkubator pada
suhu 55oC selama 2 jam.
Suspensi yang telah diinkubasi pada
suhu 55ºC selama 2 jam ditambah 400 µl
larutan fenol, 400 µl CIAA (kloroform:
isoamil alkohol =24:1), dan 40 µl 5 M NaCl,
dikocok pelan pada suhu ruang selama 1 jam
dan disentrifugasi pada kecepatan 12000
rpm selama 5 menit. Bagian DNA (bening)
dipindahkan menggunakan pipet ke tabung
1.5 ml baru ditambah 800 µl etanol absolut,
dan 40 µl 5 M NaCl lalu didinginkan dalam
freezer selama semalam. Setelah itu,
disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm
selama 5 menit. Supernatan dibuang,
ditambah dengan 800 µl etanol 70%,
disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm
selama 5 menit dan bagian supernatan
dibuang. Sampel selanjutnya didiamkan
dalam keadaan terbuka sampai alkohol
hilang lalu ditambah 100 µl TE dan sampel
DNA disimpan dalam freezer sampai akan
digunakan pada tahap selanjutnya.
Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen
DNA
Amplifikasi mtDNA daerah COI
dilakukan dengan menggunakan primer
koleksi Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
dengan primer forward BICOIF (5’-TTCTCAACCAACCATAAAGATATTGG-3’)
dan primer reverse BICOIR (5’-TAGACTTCGGGGTGTCCAAAGAATCA-3’).
Komposisi pereaksi PCR terdiri atas sampel
DNA 4 µl, primer forward dan reverse
dalam 0.5 ρmol/µl, dNTPs 0.1 mM/µl,
MgCl2 0.5 mM/µl, dan Taq Polymerase
(Fermentase) beserta buffernya sebesar 0.5
unit dalam volume total 25 µl.
Reaksi PCR dilakukan menggunakan
mesin Thermocycler Eppendorf dengan
kondisi yaitu, predenaturasi 95 oC selama
lima menit. Siklus PCR dilakukan sebanyak
35 kali dengan kondisi denaturasi 95 ºC
selama 45 detik, penempelan primer 58 oC
selama 1 menit, ekstensi 72 oC selama 1
menit, dan diakhiri oleh post-ekstensi 72 oC
selama 5 menit. Produk PCR yang
dihasilkan sebesar 710 pb
Kualitas produk PCR dilihat dengan
dimigrasikan pada gel agarosa 1.5% dengan
menggunakan buffer 0.5x TBE. Gel agarosa