MODUL 7 Uji Potensi Bakteri dan Resistensi terhadap Antibiotik

MODUL
7
Uji Potensi Bakteri dan Resistensi terhadap
Antibiotik
POKOK BAHASAN :
1. Uji Resistensi Bakteri terhadap Antibiotik
2. Uji potensi bakteri sebagai penghasil enzim ekstraseluler (proteolitik, celulase, kitinase)
3. Uji penapisan bakteri probiotik/penghasil antibiotik
TUJUAN PRAKTIKUM :
Mengetahui tingkat resistensi bakteri terhadap antibiotik
Mengetahui potensi bakteri sebagai penghasil enzim ekstraseluler
Mengetahui potensi bakteri sebagai penghasil antibiotik/berfungsi probiotik
TINJAUAN PUSTAKA :
Uji resisten adalah suatu pengujian untuk mengetahui kepekaan bakteri terhadap antibiotik. Telah
diketahui bahwa antibiotik merupakan bahan yang cukup representatif untuk membunuh bakteri.
Penggunaan antibiotik yang tidak terkendali telah menyebabkan terjadinya efek samping yang
sangat mebahayakan yaitu menyebabkan bakter-bakteri tertentu menjadi tahan atau resisten
terhadap antibiotik.
Antibiotik pada umumya diproduksi dari kapang (yeast), misalnya: Penicillium notatum, Penicillium
chisogenum, dan lain sebagainya. Antibiotik yang dihasilkan dari Penicillium sp tersebut dikenal
sebagai penisilin. Untuk mengetahui bakteri-bakteri yang telah resisten terhadap antibiotik, maka
dilakukan uji resistensi. Bakteri ditumbuhkan pada medium lempeng agar, kemudian bahan
Antibiotik dipaparkan dengan menempatkannya di atas kertas berbentuk cakram (paper disk) dan
diletakan di atas lempeng agar tersebut. Media kemudian diinkubasikan selama 24 jam pada suhu
370 C. Ketahanan bakteri terhadap antibiotik dilihat berdasarkan daerah hambat (zona halau) yang
terbentuk di sekeliling paper disk antibiotik tersebut.
Adapun interpretasi terhadap daerah hambat (zona halau) tersebut yaitu sebagai berikut:
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012
Page 30
1. Daerah hambat dengan diameter lebih dari 30 mm menunjukan bahwa bakteri tersebut Peka
terhadap antibiotik;
2. Daerah hambant dengan diameter antara 20 – 30 mm menunjukan bahwa bakteri tersebut
Agak Resisten terhadap antibiotik;
3. Daerah hambat dengan diameter kurang dari 20 mm menunjukan bahwa bakteri tersebut
Resisten terhadap antibiotik.
Paper
diskDisk
Zona Hambatan
Biakan Bakteri Uji
Cawan Petri
Gambar : Pengukuran Zona Hambatan pada Uji Resistensi Bakteri
Bakteri mengambil nutrisi yang dibutuhkan dari media tempat hidupnya.
Nutrisi yang berupa
makromolekul seperti polisakarida, lipid, dan protein, tidak dapat masuk melalui membran sel. Makromolekul
ini harus dihidrolisis dulu menggunakan enzim extraselular spesifik menjadi sub unit dasarnya. Molekul kecil
ini dapat masuk ke dalam sel dan digunakan dalam proses sintesis dan pembentukan energi. Beberapa enzim
yang umum dihasilkan bakeri adalah selulase, kitinase, lipase dan protease. Bakteri probiotik dapat
menghasilkan enzim laccase. Uji potensi produksi enzim ektraseluler dapat dilakkan dengan cara menmbuhka
bakteri di media spesifik yaitu media universal yang diperkaya dengan senyawa atau zat yang dapat
menginduksi produksi enzim.
Cara laina dalah dengan membuat media sederhana dengan menggunakan
senyawa atau zat penginduksi sebagai sumber utama karbon, sementara komponen N, P, S dan elemen mikro
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012
Page 31
dalam bentuk senyawaan kimia. Cara awal menapis bakteri yang berpotensi probiotikr sama dengan uji potensi
bakteri dalam menghasilkan antibiotik atau uji resistensi antibiotik.
Hidrolisis casein
Casein, protein yang mendominasi susu, merupakan makromolekul yang tersusun dari asam amino yang
dihubungkan oleh ikatan peptida (CO-NH). Sebelum masuk kedalam sel, protein harus dipecah secara bertahap
menjadi pepton, polipeptida, dipeptida, dan asam amino. Proses ini disebut peptonisasi atau proteolisis dan
proses ini dilakukan oleh enzim extraselular yang biasa disebut protease. Fungsi dari protease adalah untuk
memotong ikatan peptide CO-NH dengan memasukkan air ke dalam molekul. Molekul kecil seperti asam
amino dapat ditransfer melalui membrane sel menuju kolam intraselular asam amino untuk digunakan dalam
mensintesis struktur dan fungsi sel protein.
Dalam praktikum kali ini, skim milk agar digunakan untuk mendemonstrasikan aktivitas hidrolisis
exoenzim. Medium terdiri dari nutrient agar yang ditambahkan susu yang mengandung substrat casein protein.
Mirip dengan protein lain, susu protein merupakan suspense koloid yang memberikan warna dan buram pada
medium karena susu protein dapat membelokkan cahaya daripada meneruskannya.
Setelah inokulasi dan inkubasi kultur, organisme yang menghasilkan protease akan memperlihatkan zona
proteolisis, yang ditunjukkan dengan adanya zona bening mengelilingi bakteri. Ini merupakan hasil dari reaksi
hidrolisis yang menghasilkan larutan , nonkoloid asam amino, dan ini menunjukkan hasil yang positif. Dalam
pencarian aktifitas protease, daerah disekitar pertumbuhan bakteri yang tetap berwarna buram , menunjukkan
reaksi negatif.
Hidrolisis CMC (Carboxymetyl Cellulose)
CMC merupakan senyawa selulosa yang digunakan untuk menapis bakteri yang mampu menghasilkan
enzim selulolitik. Penapisan dilakukan dengan menambahkan pewarna red congo untuk mendeteksi adanya
aktivitas selulolitik, yang ditandai dengan adanya zona bening disekeliling koloni setelah media padat diwarnai.
PROSEDUR PELAKSANAAN PRAKTIKUM :
Alat :
 Tabung Reaksi
 Jarum Ose
 Cawan Petri
 L-Glass
 Beaker Glass
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012
Bahan :
 Biakan (Agar Culture)
 NaCl Fisiologis
 Antibiotik
 Aquades Steril
 Paper disk
Page 32
 Pinset Steril
 Bunsen
 Jangka Sorong





Spiritus
CMC
Skim milk
Kitin
Bakteri Staphylococcus aureus&Vibrio sp.
Prosedur Uji Resistensi Antibiobiotik:
1. Persiapkan biakan bakteri yang sudah ditanam dalam medium Agar Miring;
2. Secara aseptis, ambil 1 (satu) Ose biakan dari medium Agar Miring, masukkan ke dalam
tabung reaksi yang berisi 10 mL NaCl Fisiologis;
3. Suspensikan biakan dengan Vortex;
4. Ukur Densitas/Kekeruhan suspensi dengan membandingkannya dengan Reagent Mc
Farlan’s;
5. Ambil 100 µL suspensi dengan menggunakan Micropipet, tebarkan di atas medium Agar Plate
yang sudah padat, ratakan dengan L-Glass;
6. Dengan menggunakan Pinset Steril, celupkan Paper Disk ke dalam larutan antibiotik,
kemudian tempatkan di atas Lempeng Agar;
7. Inkubasi pada suhu 370 C selama 24 jam;
8. Amati dan Ukur Zona Hambat yang terbentuk.
Prosedur Uji Enzim Ekstraseluler
1. Bakteri yang sudah ditanam dalam agar miring digores zigzag pada media padat spesifik
sesuai dengan jenis enzim yang akan diuji (media skim milk, kitin, CMC).
2. Bakteri diinkubasi pada suhu 300C sehari semalam kemudian diamati pembentukan zona
beningnya untuk penghasil protease dan kitinase.
3. Uji selulolitik dilakukan dengan menuangkan red congo 0,1% sebanyak 5 ml ke bakteri uji
diinkubasi 15 menit pada suhu ruang kemudian red congo yang tidak terserap dibuang
4. NaCl 5M sebanyak 5 ml dituangkan ke bakteri uji untuk membilas red congo kemudian
diamati pembentukan zona beningnya.
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012
Page 33
5. Zona bening yang dihasilkan diukur diameternya kemudian dihitung nilai index hidrolitik
dengan membagi diameter zona bening/diameter bakteri.
Prosedur Penghasil Antibiotik dan Potensi Probiotik
1. Bakteri dari agar miring digores zigzag pada media padat pada zona 1.
2. Bakteri uji/antagonis digores tegak lurus dengan bakteri isolat pada zona 2.
3. Media yang telah digores kemudian diinkubasi pada suhu 300C sehari semalam kemudian
diamati pertumbuhan bakteri antagonis.
4. Bakteri yang berpotensi menghasilkan antibiotik atau bersifat probiotik dapat menghambat
pertumbuhan bakteri antagonis.
Gambar : Ilustrasi Prosedur Uji Resistensi Bakteri
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012
Page 34
a
b
Gambar bentuk goresan untuk uji hidrolitik (a) dan uji produksi antibiotik (b)
PARAMATER YANG DIAMATI :
No
Sumber Isolat
Diameter Zona bening (mm)
Antibiotik A
(………..)
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012
Index hidrolitik
Antibiotik B
(………..)
Page 35