1 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Multi

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Multi-Drug Resistance Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) adalah jenis
Tuberkulosis (TB) yang resisten terhadap dua atau lebih Obat Anti Tuberkulosis
(OAT) lini pertama, seperti rifampisin (RIF) dan isoniazid (INH) (Halilu et. al.,
2014). Kasus MDR-TB dilaporkan telah menyebar ke seluruh dunia meliputi
Amerika Serikat, Amerika Latin, Afrika, Meksiko, Rusia, Eropa Barat, Eropa
Timur, Asia, New Zealand dan Austria (Amukoye, 2008). Berdasarkan laporan
World Health Organization (WHO), pada tahun 2013 diperkirakan terjadi
300.000 kasus MDR-TB di dunia. Lebih dari 50% kasus penyakit MDR-TB
terjadi di Cina, India dan Federasi Rusia (WHO, 2014). Di Indonesia, kasus
MDR-TB diperkirakan terdapat sekitar 6.300 kasus setiap tahunnya (Kemenkes
RI, 2011).
Isoniazid merupakan salah satu obat utama untuk tuberkulosis (Silva and
Palomino, 2011). Isoniazid bekerja dengan cara menghambat biosintesis asam
mikolat yang merupakan komponen penting dari dinding sel bakteri (Katzung,
2006). Isoniazid (INH) atau hidrazid asam isonikotinat adalah agen bakterisida
sintetik yang diproduksi pertama pada awal tahun 1900 tetapi tidak digunakan
sebagai agen antituberkulosis hingga tahun 1952. Dalam rentang waktu yang
singkat, obat ini dipilih sebagai profilaksis tuberkulosis karena harga yang murah
dan relatif rendah menyebabkan hepatotoksik (Whitney and Wainberg, 2002).
1
2
Namun, penggunaan obat INH yang tidak rasional oleh pasien akan menyebabkan
resistensi terhadap INH (ELF, 2009).
Resistensi yang terjadi pada INH disebabkan oleh adanya mutasi gen pada
Mycobacterium tuberculosis. Terdapat beberapa gen yang bertanggung jawab
terhadap terjadinya resistensi terhadap INH yaitu, katG, inhA, ahpC, kasA dan ndh
(Kaufmann and Hahn, 2003). Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan,
penyebab utama terjadinya resistensi terhadap INH, yaitu mutasi pada katG dan
inhA (Silva and Palomino, 2011). Sekitar 50% resistensi terhadap INH disebabkan
oleh mutasi pada katG dan antara 20 – 34% mutasi pada inhA (Kaufmann and
Hahn, 2003).
KatG adalah gen pengkode enzim katalase peroksidase, enzim yang terlibat
dalam aktivasi INH menjadi senyawa beracun dalam sel bakteri (Johnson, 2007).
Mutasi pada gen katG merupakan mekanisme utama pada resistensi INH (Hazbon
et al., 2006). Sebelumnya telah dilakukan penelitian mengenai mutasi pada gen
katG di Bali dan telah diperoleh adanya mutasi pada kodon 234 dan kodon 315
dari isolat P11 (Deniariasih et. al., 2013).
InhA merupakan gen pengkode enzim enoil reduktase (ER), enzim yang
terlibat dalam biosintesis asam mikolat (asam lemak rantai panjang pada
Mycobacterium) yang merupakan target kerja dari INH (Rozwarski et. al., 1998).
Berdasarkan penelitian Hazbon et al. (2006), 0 – 5% dari isolat Mycobacterium
tuberculosis terjadi mutasi pada gen inhA, sedangkan 8 – 20% terjadi pada
promoter inhA. Mutasi pada daerah promoter inhA umumnya terjadi pada posisi –
15. Mutasi ini merupakan mutasi yang paling banyak ditemukan yaitu pada 48
3
isolat dari 403 isolat (Hazbon et. al., 2006). Di Indonesia, terutama di Bali, telah
dilakukan juga penelitian mengenai mutasi pada daerah promoter inhA (7-290 pb).
Hasil yang diperoleh adanya mutasi pada posisi –15 dari isolat 151 (Asmara et. al.,
2014).
Penelitian yang telah dilakukan oleh Abe et. al. (2008) terhadap isolat M.
tuberculosis di Jepang, ditemukan mutasi pada kodon 94 dengan jenis mutasi
yaitu missense mutation. Pada studi lain oleh Machado et. al. (2013) terhadap
isolat M. tuberculosis di Lisbon, Portugal, ditemukan juga mutasi pada kodon 94
dengan jenis mutasi yaitu missense mutation. Berdasarkan hasil penelitian di atas,
kodon 94 (urutan basa nukleotida ke-280-282) dari gen inhA merupakan kodon
yang selalu mengalami mutasi. Oleh karena itu pada penelitian ini akan dilakukan
amplifikasi dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk mengetahui
adanya mutasi pada kodon tersebut dari gen inhA isolat M. tuberculosis lokal di
Bali. Untuk itu diperlukan sepasang primer yang dapat mengamplifikasi fragmen
gen ini dengan target pada kodon 94 yang letaknya pada bagian tengah produk
PCR. Studi awal tentang desain sepasang primer PCR telah dilakukan untuk
amplifikasi fragmen gen inhA. Sepasang primer untuk amplifikasi gen inhA pada
nukleotida ke-31-490 pb diperoleh dengan bantuan program Clone Manager Suite
(University of Groningen).
Pada penelitian ini digunakan metode Multiplex Polymerase Chain Reaction
(PCR). Multiplex PCR merupakan metode pengembangan dari PCR yang dapat
mengamplifikasi dua atau lebih sekuens target secara simultan pada reaksi yang
sama (Markoulatos et. al., 2002). Multiplex PCR lebih efisien biaya dan waktu
4
pengerjaan
dibandingkan
dengan
metode
PCR
biasa
karena
dapat
mengamplifikasi lebih dari satu sekuen target secara simultan dengan satu kali
reaksi PCR sehingga dapat menghemat alat dan reagen yang digunakan (Edwards
and Gibbs, 1994). Metode ini dapat digunakan untuk mendiagnosis penyakit yang
berbeda dalam sampel yang sama. Metode ini juga mampu mendeteksi patogen
yang berbeda dalam sampel tunggal (Rodriguez and Ramirez, 2012).
Dalam perkembangan keilmuan mengenai mutasi yang terjadi pada MDRTB, telah banyak dilakukan penelitian pada gen resistensi INH di Indonesia,
terutama di provinsi Bali. Pada penelitian ini, amplifikasi fragmen dan identifikasi
mutasi dilakukan pada promoter inhA, gen inhA dan gen katG dengan metode
Multiplex Polymerase Chain Reaction. Daerah amplifikasi yang digunakan, yaitu
pada promoter inhA menggunakan segmen 7–290 pb, gen inhA menggunakan
segmen 31-490 pb dan gen katG menggunakan segmen 2437-3160 pb. Ketiga
daerah tersebut digunakan karena ketiga daerah tersebut mewakili daerah
terjadinya mutasi. Untuk mengamplifikasi ketiga daerah tersebut, digunakan tiga
pasang primer yang berbeda. Primer untuk amplifikasi gen inhA diperoleh dengan
melakukan desain primer secara khusus menggunakan program Clone Manager
Suite (University of Groningen) sedangkan primer untuk amplifikasi promoter
inhA dan gen katG diperoleh dari hasil penelitian sebelumnya (Septiari et. al.,
2014; Deniariasih et. al., 2013).
5
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, maka dapat disusun rumusan masalah
sebagai berikut:
1. Apakah amplifikasi fragmen promoter inhA, gen inhA dan gen katG
pada isolat MDR-TB dapat dilakukan dengan metode Multiplex
Polymerase Chain Reaction?
2. Apakah terjadi mutasi pada promoter inhA (7-290 pb), gen inhA (31-490
pb) dan gen katG (2437-3160 pb) pada isolat MDR-TB dan apa jenis
mutasi yang terjadi?
3. Apakah perbedaan asam amino terjadi pada gen inhA (31-490 pb) dan
gen katG (2437-3160 pb) pada isolat MDR-TB dibandingkan dengan
data base wildtype-nya?
1.3 Tujuan Penelitian
1. Mengetahui amplifikasi fragmen promoter inhA, gen inhA dan gen katG
pada isolat MDR-TB dapat dilakukan dengan metode Multiplex
Polymerase Chain Reaction.
2. Mengetahui terjadinya mutasi dan jenis mutasinya pada promoter inhA
(7-290 pb), gen inhA (31-490 pb) dan gen katG (2437-3160 pb) pada
isolat MDR-TB.
3. Mengetahui perbedaan asam amino yang terjadi pada gen inhA (31-490
pb) dan gen katG (2437-3160 pb) pada isolat MDR-TB dibandingkan
dengan data base wildtype-nya.
6
1.4 Manfaat Penelitian
Dari penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat dalam menambah
wawasan ilmu pengetahuan mengenai adanya mutasi yang terjadi dan jenis mutasi
pada daerah promoter inhA, gen inhA dan gen katG isolat MDR-TB di Bali
resisten INH dengan metode Multiplex PCR sehingga dapat digunakan dalam
pengembangan teknik biomolekular dan membantu dalam mendiagnosis MDRTB di Bali.