Amplifikasi Internal Transcribed Spacer dan β-tubulin

Amplifikasi Internal Transcribed Spacer dan β-tubulin
pada Tanaman Jacobaea sp. (Asteraceae) Setelah Perlakuan Fungisida Sistemik
Fuad Dwi Atmaja
Intisari
Ragwort (Jacobaea sp.) adalah tumbuhan yang tersebar di berbagai wilayah sub
tropis dan mampu mensintesis metabolit sekunder terutama alkaloid pirolisidin yang
diketahui beracun dan berperan untuk pertahanan diri terhadap herbivora. Penelitian
terkini menunjukan bahwa sintesis alkaloid pada tanaman sering melibatkan bantuan
jamur endofit. Pada penelitian terdahulu diketahui terjadi penurunan kandungan
alkaloid pirolisidin pada tanaman yang diberi perlakuan fungisida folikur. Belum
diketahui apakah penurunan tersebut disebabkan oleh pengaruh fungisida atau
hilangnya jamur endofit dari tanaman Jacobaea sp.. Ragwort memiliki kadar
polisakarida dan fenolat tinggi sehingga isolasi DNA genom pada tanaman ini
memerlukan optimasi khusus, untuk itu perlu perlu dilakukan tiga metode isolasi DNA
yang berbeda. Tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan prosedur isolasi DNA
yang dapat digunakan untuk memperoleh DNA genom tanaman Jacobaea sp dengan
kualitas cukup baik dan mengamplifikasi gen ITS (Internal Transcribed Spacer) dan
β-tubulin jamur endofit dari DNA genom Jacobaea sp. Penelitian diawali dengan
isolasi DNA sampel dari akar dan daun tanaman Jacobaea sp yang diperlakukan folikur
dan kontrol yang diperoleh dari penelitan sebelumnya. Isolasi DNA dilakukan dengan
tiga metode yang berbeda yaitu menggunakan genAid kit, metode Cheung, dan metode
CTAB dengan modifikasi. Selanjutnya hasil isolasi DNA yang memenuhi standar
digunakan sebagai template untuk PCR. Primer yang digunakan yaitu ITS1, ITS4 dan
ITS5 untuk gen ITS dan T1 dan T22 untuk gen β-tubulin. Hasil amplifikasi PCR
dipisahkan menggunakan elektroforesis gel agarose (1.5%). Sebagai kontrol positif
jamur endofit digunakan Fusarium solanii. Hasil menunjukan metode yang paling baik
untuk mengisolasi DNA sampel Jacobaea sp. adalah metode CTAB dengan
modifikasi. Hasil amplifikasi primer ITS 1 dan ITS 4; serta ITS 4 dan ITS 5
menunjukan kontrol positif menghasilkan pita spesifik berukuran 550 bp dan tanaman
sampel menghasilkan pita spesifik 750 bp. Hasil amplifikasi primer T1 dan T22
menunjukan kontrol positif menghasilkan pita spesifik berukuran 1500 bp, sedangkan
tanaman sampel Jacobaea sp. tidak menghasilkan pita DNA. Dari hasil tersebut
diketahui bahwa tanaman Jacobaea sp. baik yang diperlakukan dengan fungisida
folikur dan kontrol tidak mengandung jamur endofit.
Kata kunci : Jacobaea sp., Alkaloid Pirolisidin, Fungisida, Endofit, PCR,
Elektroforesis.
v
Internal Transcribed Spacer and β-tubulin Amplification of Jacobeaea sp.
(Asteraceae) Treated by Systemic Fungicide
Fuad Dwi Atmaja
Abstract
Ragwort (Jacobaea sp.) is plant dispersed in sub-tropical regions and able to
synthesize secondary metabolites such as pyrrolizidine alkaloids. Pyrrolizidine
alkaloids are known to be toxic and serve as defense against herbivore. Recent study
indicates that alkaloid synthesis often involves endophytic fungi. Previous studies
showed a decrease of pyrrolizidine alkaloids content were observed in Jacobaea sp.
plants treated with folicur fungicide. It had not been known whether the decrease was
caused by fungicide or the absent of endophytic fungi. Ragwort have a high level of
polysaccharides and phenolic. Therefore DNA isolation from this plant need
optimization, then three different DNA isolation were conducted. The purpose of this
research was to obtain DNA isolation procedure with good quality genomic DNA from
Jacobaea sp. plant and amplify endophytic fungi ITS (Internal Transcribed Spacer) and
β-tubulin gene from Jacobaea sp. plant. DNA isolation from fungicide folicur treated
Jacobaea sp. roots and leaves obtained from previous research. To isolate DNA, three
different methods were used, genAid kit, Cheung method, and CTAB method with
modifications. Furthermore, DNA isolated from the best DNA isolation method was
used as a template for PCR. DNA was amplified in PCR using the 5 types of primer
that were ITS1, ITS4 and ITS5 for ITS gene and T1 and T22 for β-tubulin gene.
Amplification product was ran in electrophoresis apparatus using agarose gel (1.5%).
Fusarium solanii was used as endophytic fungi positive control. The results showed
that the best method to isolate DNA of Jacobaea sp. was CTAB method with
modifications. The results of the primer amplification ITS 1 and ITS 4; and ITS 4 and
ITS 5 positive control produced specific band of 550 bp in size and the plant sample
produce specific band of 750 bp in size. The results of the primer amplification T1 and
T22, positive control produce a specific band of 1500 bp in size, while Jacobaea sp.
plant sample did not produce any band. From these results it is known that Jacobaea
sp. plant both treated with folicur and control do not have endophytic fungi.
Keyword : Jacobaea sp., Pyrrolizidine Alkaloid, Fungicide, Endophyte, PCR,
Electrophoresis.
vi