pembahasan umum - IPB Repository

 PEMBAHASAN UMUM
Pregnancy-associated glygoprotein (PAG) merupakan famili aspartik
proteinase yang disekresikan oleh sel binukleat trofoblastik sesaat menjelang
implantasi. Konsentrasi PAG sejalan dengan semakin berkembangnya plasenta
yang mengindikasikan bahwa perkembangan embrio berjalan baik sehingga PAG
merupakan indikator kebuntingan maupun kesehatan feto-plasental. Konsentrasi
PAG dapat terdeteksi dalam darah induk pada awal kebuntingan dengan akurasi
76,6 – 100% (Szafranska et al. 2006). Diagnosa kebuntingan yang yang
mempertimbangkan beberapa aspek yaitu kemudahan mendapatkan bahan
bakunya; mudah dilakukan; cepat diperleh hasilnya, dan akurat.
Berdasarkan kelebihan di atas maka dilakukan purifikasi terhadap
kotledon plasenta sebagai tempat pertukaran nutrisi antara induk dan foetus. Dlam
perkembangannya ovPAG disekresikan sepanjang usia kebuntingan yang
konsentrasinya meningkat sesaat menjelang partus, kemudian akan mencapai
basal kembali setelah 4,5 hari kelahiran.
Proses purifikasi diperlukan untuk meningkatkan rasio aktivitas enzim
terhadap protein yang dielusi. Pemanfaatan kolom Sephadex-G75 memisahkan
protein berdasarkan ukuran proteinnyaantara 3 – 80 kDa sedangkan kolom
DEAE-cellulose dimanfaatkan untuk pertukaran anion dengan menggunakan
konsentrasi NaCl yang bertingkat sebagai upaya untuk mendapatkan protein yang
mempunyai ikatan ion yang paling kuat. Penggunaaan NaCl pada kromatografi
pertukaran anion karena ion Cl-1 dalam kondisi fisiologis normal banyak tersedia
dalam membran plasma. Sementara monogel SDS-PAGE diperlukan untuk
memisahkan protein berdasarkan kemampuan protein untuk bergerak yang setara
dengan nilai logaritmik berat molekulnya. Berat molekul protein yang paling
spesifik yang berhasil dimurnikan berada di sekitar 30 kDa. Konsentrasi ovPAG berdasarkan pelarut yang digunakan untuk mengelusi
ada lima yang memberikan nilai positif atau lebih tinggi dari standar yaitu
berturut-turut 181; 171; 2,67; 44,33 dan 86 ng/µL (S; DT; DN8; DN16, dan
DN32) yang akan dipergunakan sebagai stok isolat murni ovPAG sebagai hasil
purifikasi ekstrak kotiledon.
77 Selanjutnya isolat yang diperoleh dipergunakan untuk memproduksi
antibodi poliklonal. Produksi antibodi dilakukan dengan mengimunisasi isolat
pada bagian punggung kelinci. Kelinci dipilih sebagai hewan percobaan karena
memiliki tingkat kekerabatan yang jauh dengan ruminansia sedangkan kelinci
monogastrik sebagai salah satu persyaratan agar diperoleh respon imun yang
tinggi dalam produksi antibodi poliklonal. Selain belum pernah adanya paparan
ovPAG terhadap kelinci yang dipergunakan.
Ada sembilan ekor yang dapat dipergunakan sebagai sumber antibodi
yaitu S1 dan S2 (kolom Sephadex-G75), DT1, DT2, DN8.2, DN16.1 dan 16.2,
DN32.1 dan 32.2. Sementara DN8.1 tidak dipergunakan pada uji selanjutnya
karena telah menunjukan absorbansi yang tinggi dalam plasma darah baseline
sehingga dimungkinkan akan banyak reaksi silang akan terjadi. Pada kelompok
kontrol absorbansi sangat rendah, hal ini dapat terjadi karena disuntik plasebo
(NaCl Fisiologis 0,9 %). Hasil ini penting untuk menunjukan bahwa ekstrak
kotiledon plasenta, yang didalamnya mengandung ovPAG berhasil diisolasi.
Berdasarkan pita protein yang terbentuk, konsentrasi ovPAG serta respon
imunnya ada kesamaan antara DN16 dan DN32 akan tetapi DN32 mempunyai
beberapa kelebihan yaitu intensitas pita protein yang lebih tebal; konsentrasi
ovPAG DN32 sebesar 86 ng/ml sedangkan DN16 sebesar 44,33 ng/ml, serta
respon imun yang lebih tinggi.
Uji spesifikasi Rabbit anti-ovPAG DN32 dilakukan dengan menggunakan
teknik Western Blot yang dikenal sebagai Gold Standard. Determinasi
Rabbit
anti-ovPAG DN32 Negatif terhadap protein ovPAG pada K tidak terbentuk pita
protein, berarti dalam kelinci tersebut tidak ada reaksi terhadap NaCl 0,9%.
Sementara pada DN32, DN16 dan S terdapat pita protein pada 71 kDa. Akan
tetapi pada S 71 kDa masih ada dua pita protein 34 dan 14 kDa. Pita protein
pada DT berada pada sekitar 31 dan 14 sedangkan DN8 tidak mempunyai pita
protein setelah reaksi berakhir. Uji konfirmasi
Rabbit α-ovPAG DN32 positif
menunjukan bahwa pita protein 71 kDa terdapat di semua sumber ovPAG
(K; DN32; DN16; DN8; DT, dan S). OvinePAG DN32 dan DN16 memiliki dua
pita pada 71 dan 62 kDa (2 pita) tetapi DN32 masih memiliki satu pita lagi yaitu
14 kDa.
78 Protein pada 71 kDa dapat diikat oleh Rabbit anti-ovPAG negatif maupun
positif, hal ini menunjukan bahwa protein ini merupakan protein umum,
sedangkan protein lainnya masih perlu dilakukan determinasi lebih lanjut.
OvinePAG S dan DT memberikan reaksi terhadap Rabbit anti-ovPAG negatif
maupun positif sehingga tidak dipergunakan sebagai sumber Rabbit anti-ovPAG
karena banyak mempunyai reaksi silang. Hal ini menunjukan bahwa RabbitantiαovPAG memberikan reaksi yang lebih spesifik terhadap OvinePAG DN32. Oleh
karena Rabbit anti-ovPAG merupakan antibodi poliklonal maka selain ovPAG
DN32, juga dapat mengenali protein dengan
epitop sama dari ovPAG lainnya.
Berdasarkan hasil tersebut, Rabbit anti-ovPAG DN32 dapat dipergunakan sebagai
sumber Rabbit anti-ovPAG .
Urin domba bunting menunjukan adanya pita protein pada 71 dan 31 kDa
berdasarkan perhitungan migrasi protein. Temuan menarik terjadi pada saat Ab+
DN32 beraksi dengan ovPAG dalam urin domba tidak bunting, pita protein yang
muncul hanya satu yaitu pada 71 kDa sedangkan pada 31 kDa tidak ada pita
protein yang terbentuk. Hasil ini menunjukan bahwa rabbit anti-ovPAG secara
spesifik berikatan dengan ovPAG dalam urin, kemungkian besar penanda
kebuntingan dini pada domba garut terpapar pada protein dengan berat molekul
sekitar 31 kDa. Dengan demikian dimungkinkan untuk dilakukan eksplorasi lebih
lanjut terhadap pengembangan metode deteksi kebuntingan dini menggunakan
metode Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA).
Teknik ini perlu
dikembangkan agar lebih aplikatif di lapangan.
Meskipun demikian, konsentrasi ovPAG terukur baik pada sampel urin
maupun plasma, dan hasil didapat sesuai dengan hipotesis bahwa urin bunting
yang diduga mengandung ovPAG memberikan reaksi
terhadap
Ab+ tetapi
hasilnya kurang memuaskan karena tidak konsensisten. Antibodi negatif dapat
bereaksi dengan ovPAG dalam urin, hal ini menunjukan bahwa ada epitop dari
ovPAG yang dapat dikenali oleh Ab+ maupun Ab-. Kemungkinan terbesar
disebabkan oleh pemanfaatan antibodi poliklonal sebagai antibodi primer. Pada
dasarnya antibodi poliklonal mempunyai spesifisitas yang luas sehingga
dimungkinkan untuk berinteraksi dengan protein PAG dalam sampel yang diuji.
79 Pada sampel plasma dari hewan yang sama perbedaan konsentrasi ovPAG
yang duji menggunakan Ab+ dan Ab- memperlihatkan hasil yang konsisten
karena kandungan ovPAG dalam darah mencerminkan level yang sama dengan
kondisi fisiologis saat diukur. Pemakaian sampel darah merupakan metode
invasive, meskipun memberikan hasil yang lebih baik tetapi sulit dikembangkan
pada saat sampel yang akan diuji merupakan serial (saat dikawinkan sampai
melahirkan). Oleh sebab itu urin masih merupakan pilihan yang paling baik
karena dengan menggunakan teknik ELISA, hasil yang diperoleh akan
memberikan gambaran yang sama dengan darah hanya berbeda dalam masa
pengukuran (time lag).
Konsentrasi ovPAG dalam urin domba tidak bunting (Tabel 4) yang diukur
menggunakan
standar
ovPAG
DN32
pada
sembilan
individu
domba
memperlihatkan adanya tiga individu yang mempunyai konsentrasi berbeda nyata
(P
0,05) yaitu B3; C1; C2 dan dua individu berbeda sangat nyata (P
0,01)
yaitu C3 dan E1. Namun rerata konsentrasi kesembilan individu tidak
menunjukan adanya perbedaan yang nyata (P
0,05). Hal ini menunjukan bahwa
teknik ELISA termodifikasi yang dipergunakan dapat dipergunakan untuk
mengukur konsentrasi
konsentrasi
ovPAG
ovPAG dalam urin. Namun untuk membedakan
pada
domba
bunting
dan
tidak
bunting,
tingkat
keberhasilannya masih rendah (55,56 %) dari sembilan individu yang diuji.
Pengembangan teknik ELISA Termodifikasi, masih perlu optimasi dalam
pemurnian ovPAG DN32 sebagai standar, karena hal ini erat kaitannya dengan
kespesifikan rabbit anti-ovPAG yang diproduksi. Tahapan yang harus dilalui
untuk mendapatkan kit yang dapat diproduksi secara masal maka perlu dilakukan
pemurnian ulang terhadap ovPAG DN32 dengan sumber pembanding ovPAG
DN16. Fraksi yang dielusi difokuskan pada fraksi yang mengandung protein
dengan berat molekul sekitar 30 kDa. Penyuntikan ovPAG yang lebih spesifik
diharapkan akan menghasilkan antibodi poliklonal yang lebih spesifik pula.
Imunisasi isolat ovPAG DN32 maupun DN16 dilakukan dengan
mempertimbangkan dosis penyuntikan; jumlah kelinci sebagai ulangan; adjuvant
yang akan dipilih, serta kemungkian dicari hewan coba yang dapat memproduksi
antibodi yang lebih banyak seperti kambing sehingga antibodi yang dihasilkan
80 akan lebih banyak lagi. Selanjutnya dilakukan purifikasi terhadap antibodi yang
dihasilkan. Antibodi poliklonal (rabbit anti-ovPAG) diuji spesifisitas terhadap
ovPAG urin domba saat estrus; bunting, dan setelah melahirkan. Optimasi teknik
ELISA Termodifikasi akan sangat bermanfaat dalam pembuatan prototipe kit
deteksi kebuntingan dini.