Ekspresi Gen 4

EKSPRESI GEN 3
Ani Retno Prijanti
FKUI
2010
Regulasi Ekspresi Gen
Ekspresi gen, adl produksi suatu produk RNA
dari suatu gen tertentu yg dikontrol oleh
mekanisme yg kompleks.
Secara normal hanya sebagian tertentu DNA
dalam suatu sel akan diekspresikan pada suatu
waktu.
Ekspresi gen diregulasi secara berbeda antara
prokariot dan eukariot.
Regulasi ekpresi gen pada prokariot.
Pd prokariot ekspresi gen diregulasi terutama
dgn mengontrol inisiasi transkripsi gen.
Suatu set yg terdiri atas gen-gen yg disusun
dalam suatu operon dan tiap operon
dikendalikan oleh satu promotor (regulatory
region).
Protein regulator yg disebut represor dapat
terikat pada promotor dan menghambat
pengikatan RNA polimerase = kontrol negatif
Sedangkan protein aktivator memfasilitasi
pengikatan RNA polimerase = kontrol positif.
Represor dikendalikan oleh nutrien atau
metabolitnya yg disebut inducer atau
corepressor.
Regulasi dapat juga terjadi melalui atenuasi
transkripsi.
Regulasi sintesis protein pada eukariot.
Eukariot lebih kompleks drpd prokariot.
Sebagai contoh embrio manusia berkembang s/d
organisme multiseluler, berbagai set gen
diaktifkan dan berbagai grup protein diproduksi,
menghasilkan diferensiasi tipe sel yg
morfologinya berbeda dan memperlihatkan fungsi
yand berbeda pula.
Bahkan pada umur diatas usia reproduktif, sel
tertentu masih berdiferensiasi contohnya:
Sel yg memproduksi antibodi dalam merespon
terhadap suatu infeksi.
Produksi sel darah merah baru.
Penggantian sel epitel saluran pencernaan baru
terhadap sel tua yg dilepaskan.
Semua proses perubahan fisiologis ini
diatur/diregulasi secara kompleks dalam ekspresi
gennya (terjadi pada level DNA).
Aktivasi gen memerlukan perubahan dlm state
kromatin (chromatin remodeling) yg difasilitasi
oleh asetilasi histon dan metilasi basa-basanya.
Perubahan pd DNA menentukan gen mana yg
dapat ditranskripsi.
DNA eukariot akan diorganisasi ke dalam bentuk
nukleosom kromatin dan gen-gen harus dlm
keadaan struktur aktif utk diekspresikan dlm sel.
Operon tidak terdapat dalam DNA eukariot.
Gen-gen utk protein-protein yg fungsinya bekerja
bersama terletak dalam kromosom yg berbeda.
Karena itu tiap gen membutuhkan promotor
masing-masing.
Selain itu proses-proses transkripsi dan translasi:
1. Terjadi di ruang-ruang yg terpisah
(kompartemen: nukleus, sitosol, retikulum
endoplasmik) di sel eukariot.
2. Berbeda waktu berlangsungnya: hnRNA eukariot
harus diproses dulu dan dikeluarkan dari nukleus
sebelum ditranslasi .
Regulasi ekspresi gen terjadi pada multiple level:
 DNA dan kromosom termasuk chromosome
remodeling dan gene rearrangement.
 Transkripsi, melalui faktor transkripsi yg
berikatan dg RNA polimerase.
 Proses transkripsi
 Inisiasi translasi dan stabilitas mRNA
Agar gen dapat diekspresikan:
 Chromatin remodeling
 Metilasi DNA
 Gene rearrangement
 Gen amplificatio/Deletion
Regulasi pada level transkripsi:
Dengan cara mengontrol penyusunan basal
transcription complex yg mengandung RNA
polimerase dan TATA box dari promotor.
Faktor transkripsi akan dapat terikat upstream
pada berbagai tempat di region promotor.
Faktor ini akan meningkatkan frekuensi
transkripsi dan diperlukan agar promotor
berfungsi pd level yg adequate.
Region control gen juga mengandung genespesific transcription factor (transactivator/
activator) yg dpt berinteraksi dg protein
mediator (coactivator), dapat meningkatkan
transkripsi s/d 1000 x atau lebih.
Dg cara membentuk loop dlm DNA, coactivator
berinteraksi dg basal transcription complex
dan mengaktifkan pengikatan pd initiation site
dlm promotor.
DNA regulatory sequences dapat terletak jauh
dr promotor, bisa upstream ataupun
downstream dari initiation site.
Proses Post transkripsi RNA.
Terjadi setelah hnRNA dibentuk, kemudian akan
dibuat mRNA mature.
 Alternative splicing dan polyadenilation site
 RNA editing.
Regulasi Translasi dan Stabilitas mRNA.
Biasanya melibatkan faktor eIFs (eukaryotic
initiation factors) dg mekanisme fosforilasi.
Transpor dan stabilitas mRNA
Stabilitas mRNA berperan dl regulasi ekspresi
gen, sebab mRNA yg half life-nya panjang dpt
menghasilkan jumlah lebih besar protein
dimaksud.
mRNA eukariot relatif stabil (jam s/d hari).
mRNA dapat didegradasi oleh nuklease dlm
nukleus dan sitoplasma sebelum ditranslasikan.
Untuk mencegah degradasi selama transport dr
nukleus ke sitoplasma, mRNA terikat pada
protein yg membantu mencegah degradasi
mRNA.
Sekuen ujung juga membantu mencegah
degradasi yaitu poli A. Poly A tail ini
memendek selama proses transpot
Penggunaan Tehnik DNA Rekombinan dlm
kedokteran.
Aplikasi klinis:
Polimorfisme: Variasi sekuens DNA utk suatu
gen, yg diwariskan, banyak tdp di populasi.
Banyak perubahan sekuens DNA dihubungkan
dgn penyakit.
Uji variasi DNA lebih sensitif utk mendeteksi
polimorfisme drpd tehnik lain (enzyme assay)
dan memungkinkan diketahui sejak dini dan
karena itu lebih awal terapi dpt diberikan.
Uji ini juga dpt mengidentifikasi penyakit
keturunan shg dapat dilakukan konseling yg
tepat
DNA finger printing: analisis perbedanaan
sekuens DNA dapat digunakan utk:
 menentukan adanya hubungan keluarga antar
individu
 dapat juga digunakan utk menetapkan
tersangka dlm kasus kriminal.
DNA rekombinan: suatu tehnik biologi molekuler
yg dapat digunakan dlm pencegahan dan terapi
penyakit.
Saat ini tehnik DNA rekombinan bermanfaat
bagi manusia utk: terapi diabetes melitus
(insulin), hemofilia (faktor VIII), vaksin
hepatitis.
Terapi gen masih dalam tahap penelitian.
Utk memastikan normal atau patologis variasi
genetik, DNA harus diisolasi dari sumber sel,
jumlahnya cukup.
Tehnik isolasi dan amplifikasi gen serta
manipulasinya dapat digunakan
 enzim-enzim restriksi,
 cloning vector,
 polymerase chain reaction/PCR
 gel electrophoresis,
 blotting dlm nitrocellulose paper
 persiapan probe yg dpt hibridisasi dg target
sekuens DNA
Terapi gen, meliputi isolasi gen normal dan
diinsersikan ke dlm sel yg sakit sehingga gen
normal dapat diekspresikan, memungkinkan sel
yg sakit kembali normal.
Tehnik DNA Rekombinan.
Adl tehnik utk menggabungkan sekuens DNA ke
suatu kombinasi baru, tehnik ini diciptakan utk
eksplorasi dan manipulasi gen, dan sekarang
dpt digunakan utk identifikasi defective gene
yg berhubungan dg penyakit.
1. Isolasi fragmen DNA dan memperbanyak/
kopi gen.
Meliputi:
 Restriction fragments
 Produksi DNA oleh reverse transcriptase
 Sintesis kimia DNA
2. Tehnik Identifikasi sekuens DNA.
Meliputi:
 Probe
 Gel electrophoresis
 Deteksi sekuens DNA spesifik
 DNA sequencing.
3. Tehnik amplifikasi sekuen DNA.
Digunakan utk memperbanyak jumlah DNA yg
telah diisolasi sebab utk suatu studi DNA
dibutuhkan sejumlah DNA yg cukup banyak,
sementara hasil isolasi DNA dari sumber sel
hanya sedikit sekali.
Jenis tehnik:
 Cloning DNA
 Polymerase chain reaction
Enzim endonuklease restriksi dapat memotong
segmen DNA dari genom beragam sel atau
fragmen DNA dr sumber lain.
Enzim ini mengenali secara spesifik sekuens
pendek biasanya 4 – 6 pasang basa dan
memotong ikatan fosfodiester dikedua rantai
DNA dalam sekuen. Enzim ini hanya memotong
sekuens tertentu (palindrom) dimana kedua
DNA mengandung sekuens yg sama bila dibaca
dari arah 5’ ke 3’ dgn hasil potongannya sticky
end.
GAATTC
CTTAAG
Ada jenis tumpul/ blunt hasil potongan enzimnya.
Beratus enzim restriksi ini dgn berbagai
spesifikasi telah dapat diisolasi.
Contoh:
Enzim restriksi Sumber
Cleavage Site
AluI
Arthrobacter
EcoRI
Escherecia coli G A A T T C
luteus
RY13
AGCT
TCGA
CTTAAG