PENDAHULUAN Lemak adalah salah satu komponen makanan

A. PENDAHULUAN
Lemak adalah salah satu komponen makanan multifungsi yang sangat penting
untuk kehidupan. Fungsi lemak dalam tubuh antara lain sebagai sumber energi, bagian
dari membran sel, mediator aktivitas biologis antar sel, isolator dalam menjaga
keseimbangan suhu tubuh, pelindung organorgan tubuh serta pelarut vitamin A, D, E,
dan K.(1)
Komponen dasar lemak adalah asam lemak dan gliserol yang diperoleh dari
hasil hidrolisis lemak, minyak maupun senyawa lipid lainnya. Asam lemak
pembentuk lemak dapat dibedakan berdasarkan jumlah atom C (karbon), ada atau
tidaknya ikatan rangkap, jumlah ikatan rangkap serta letak ikatan rangkap.
Berdasarkan struktur kimianya, asam lemak dibedakan menjadi asam lemak jenuh
(saturated fatty acid/SFA) yaitu asam lemak yang tidak memiliki ikatan rangkap.
Sedangkan asam lemak yang memiliki ikatan rangkap disebut sebagai asam lemak
tidak jenuh (unsaturated fatty acids), dibedakan menjadi Mono Unsaturated Fatty
Acid (MUFA) memiliki 1 (satu) ikatan rangkap, dan Poly Unsaturated Fatty Acid
(PUFA) dengan 1 atau lebih ikatan rangkap.(1)
Asam linoleat adalah asam lemak tak jenuh dengan ikatan rangkap pada atom
karbon C keenam dari ujung metilnya. Karena ikatan rangkap ini, maka asam linoleat
terkenal sebagai omega-6. Rumus kimia dari asam linoleat adalah C17H29COOH.
Asam linoleat merupakan asam lemak esensial, yaitu asam lemak yang dibutuhkan
oleh tubuh namun tidak dapat disintesis di dalam tubuh.(1)
Pangan
fungsional
didefinisikan
sebagai
makanan
yang mempunyai
komponen-komponen fungsional (zat gizi maupun non gizi) yang dapat meningkatkan
kesehatan dan atau menurunkan risiko penyakit.(2)
Functional fats dapat diartikan sebagai komponen-komponen lemak yang
dapat digunakan untuk meningkatkan kesehatan atau menurunkan beberapa risiko
penyakit. Selain itu dapat juga dalam meningkatkan nilai gizi sehingga dapat
menghindari defisiensi beberapa zat gizi, contohnya adalah margarin yang difortifikasi
dengan vitamin A dan vitamin D, sehingga dapat mencegah terjadinya defisiensi
vitamin-vitamin tersebut.(2)
Functional fats mempunyai beberapa fungsi, salah satunya adalah menurunkan
risiko penyakit kronis seperti asam linoleat untuk menurunkan kolesterol darah pada
1
penyakit jantung koroner dan Conjugated Linoleic Acid (CLA) dalam menurunkan
massa lemak pada obesitas.(2)
Awal perkembangan functional fats sendiri sudah dimulai sejak pemerintahan
Napoleon III, margarine dianggap sebagai salah satu pangan fungsional modern
karena diperkaya oleh Vitamin A dan Vitamin D. Pada tahun 1950, telah diperjelas
bahwa asam lemak jenuh yang berasal dari makanan berkorelasi secara positif dengan
konsentrasi kolesterol plasma dan insiden penyakit jantung koroner. Maka dari itu
dibuatlah penggantian asam lemak jenuh dengan asam lemak tidak jenuh untuk
menurunkan angka kejadian penyakit jantung koroner.(2)
Conjugated Linoleic Acid (CLA) merupakan salah satu jenis functional fat
yang diduga memiliki beberapa manfaat bagi tubuh. Conjugated Linoleic Acid
merupakan hasil oksidasi dari asam lemak linoleat dimana ikatan rangkapnya yang
berumlah dua tidak dipisahkan oleh dua ikatan tunggal, tetapi hanya dipisahkan oleh
satu ikatan tunggal sehingga letak ikatan rangkapnya terletak pada carbon nomor 9, 10
serta 11, 12.(1)
Manfaat tersebut antara lain dapat membantu menurunkan berat badan,
mengurangi massa lemak tubuh, meningkatkan massa otot tubuh, menurunkan kadar
kolesterol, serta sebagai pencegahan risiko penyakit kardiovaskuler.
Telah banyak penelitian yang dilakukan untuk mengkaji beberapa dugaan
manfaat dari CLA tersebut, baik dengan media hewan maupun uji coba ke manusia
secara langsung. Untuk itu kami akan membahas penjelasan yang lebih mendalam
terkait Conjugated Linoleic Acid (CLA) sebagai salah satu functional fat yang
bermanfaat bagi kesehatan manusia.
B. GAMBARAN UMUM DAN KARAKTERISTIK CLA
CLA atau conjugated linoleic acid merupkan klasifikasi isomer conjugated
dienoic
yang mempunyai posisi dan geometri FA C18:2. Konfigurasi geometri
dirancang dengan menggunakan istilah cis dan trans dimana konfigurasi cis terjadi
secara alamiah, sementara konfigurasi trans terjadi karena adanya bantuan secara
termodinamik.(3)
Angka, posisi dan geometri dari ikatan ganda mempengaruhi laju oksidasi.
Isomer angka adalah kelompok senyawa yang memiliki massa relatif sama tetapi
2
berbeda kerangka karbonnya. Isomer posisi adalah kelompok senyawa isomer yang
disebabkan oleh perbedaan posisi ikatan rangkap pada rantai karbon. Sementara
isomer geometri adalah isomer yang disebabkan karena perbedaan letak geometris
dari gugus yang terikat pada atom C yang berikatan rangkap. Misalnya C18:2(c-9, c12) menunjukkan bahwa terdapat 18 rantai carbon dimana terdapat 2 ikatan rangkap
yang terletak pada rantai karbon nomor 9 dengan geometri cis dan ikatan karbon
nomor 12 dengan geometri cis. Sementara C18:1c9 menunjukkan bahwa terdapat 18
rantai carbon dengan jumlah ikatan rangkap hanya satu dan ikatan geometris cis
terdapat pada rantai karbon nomor 9. Kecepatan oksidasi relatif pada C20:4, C18:3n3, C18:2 dan C18:1c9 secara berturut-turut adalah 40:20:10:1. Isomer cis lebih
mudah mengoksidasi dibandingkan trans, dan ikatan ganda terkonjugasi lebih reaktif
dibandingkan non-konjugasi. Pada suhu kamar, ketengikan oksidatif pada ikatan tak
jenuh menjadi dapat diketahui.(3)
Pada awal CLA ditemukan pada tahun 1930 menunjukkan bahwa produk susu
dapat menyerap radiasi ultraviolet pada 230 nm. Rumitnya struktur CLA terungkap
dari kolom kapiler tinggi polar yang sangat panjang pada kromatografi gas (GC).(3)
Conjugated Linoleic Acid (CLA), secara posisi geometris dan isomer CLA ini
dapat menjadi agen pencegah kanker pada model binatang yang diinduksi zat
karsinogenik. Isomer CLA secara alami dapat ditemukan dalam makanan, paling
tinggi terdapat dalam daging hewan ruminansia dan susu. CLA juga bisa menjadi
terapi anti obesitas, agen farmasi yang dapat meningkatkan stimulasi insulin. Ada
kemungkinan bahwa CLA dapat meningkatnya homeostatis glukosa dan beberapa
mekanisme pada Zucker Diabetic Fatty rats.(4)
Terdapat 28 jenis isomer yang telah teridentifikasi, namun hanya dua isomer
yang dikenal mempunyai aktivitas biologis, yakni CLA cis 9 trans 12 dan Trans 10
Cis 12. Asam Rumenic atau cis 9 trans 11 dapat ditemukan sebanyak 72-94 % dari
total CLA dalam makanan yang berasal dari hewan pemamah biak. Sementara isomer
trans 10 cis 12 ditemukan pada makanan berasl dari hewan ruminansia dalam jumlah
yang sedikit. Struktur kimia dari CLA dan 2 isomer ini adalah sebagi berikut.(5)
3
Gambar 1.Struktur Kimia Isomer Canjugated Linoleic Acid
Sumber : Aydin R. Conjugated Linoleic Acid : Chemical Structure , Sources and
Biological Properties. 2005;29:189–95.
Gambar 2
Sumber : Aydin R. Conjugated Linoleic Acid : Chemical Structure , Sources and
Biological Properties. 2005;29:189–95.
4
C. METABOLISME CLA
Gambar 3
CLA dapat terbentuk dari biohidrogenasi oleh mikrobiota pada rumen hewan
pemamah biak. Asam linoleat yang terasup mengalami hidrogenasi menjadi asam
rumenat (9cis, 11trans), asam vaccenat, dan asam stearate. Asam vaccenat juga dapat
membentuk asam rumenat melalui desaturasi delta 9. Jalur inilah yang menjadi jalur
pembentukan utama untuk asam rumenat yang dikenal luas sebagai CLA .
Isomer CLA dimetabolisme melalui jalur yan berbeda-beda. Karena
merupakan bentuk lain dari asam linoleat (9cis, 12cis-18:2), maka jalur metabolism
untuk CLA kurang lebih sama: yaitu melewati proses desaturasi berturut-turut dan
pemanjangan/elongase. Seperti pada gambar, dapat dilihat bahwa CLA mengalami
desaturasi delta 6 menjadi asam oktadecetrienoic (cis6, cis9, trans11-18:3) yang
kemudian mengalami elongase menjadi asam eicosatrienoic terkonjugasi (CD 20:3).
Biokonversi ini dapat berlanjut menjadi asam eicosatetraenoic terkonjugasi (CD 20:4).
Metabolit-metabolit ini ditemukan dalam jaringan liver dan kelenjar mammae. Namun
proses metabolisme yang terjadi berbeda tergantung dari konfigurasi ikatan gandanya:
cis/trans, trans/cis, atau trans/trans. Untuk bentuk CLA cis9, trans11 tergolong mudah
untuk dimetabolisme menjadi CD 20:4, namun terdapat hambatan tertentu pada CLA
bentuk trans10, cis12 untuk terkonversi menjadi CD 20:4. Bentuk CD 18:3 dari
trans10, cis12 juga ditemukan lebih resisten terhadap proses elongase.(6)
Sebagai asam lemak, asam rumenic juga melewati proses β-oksidasi. Awalnya,
asam lemak akan mengalami degradasi sebagian di peroksisom. Kemudian asam
lemak akan memasuki mitokondria untuk metabolisme lanjut atau dimasukkan ke
berbagai bentuk lipid. Oksidasi CLA pada mitokondria lebih sedikit dibandingkan
5
dengan asam linoleat atau asam palmitat. Akan tetapi, perilaku isomer CLA unik
tergantung jenisnya. CLA trans10,cis12 memiliki tingkat oksidasi yang lebih tinggi
daripada CLA cis9, trans11. Ini dapat disebabkan oleh adanya perbedaan pada letak
ikatan rangkap. Beta-oksidasi pada CLA trans10, cis12 melewatkan empat tahap:
enoyl CoA isomerase, hidratase oleh 2 trans enoyl CoA, beta hidroxiacil CoA
dehydrogenosa. Sedangkan untuk CLA dari bentuk cis9, trans11, hanya melewatkan
dua tahap: katalis dari acyl coA dehydrogenase, serta 2,4 dienoil coA reduktase.
Kedua asam lemak konjugasi ditemukan memiliki tingkat oksidasi yang lebih tinggi
dari asam linoleat yang digunakan sebagai kontrol. Di sisi lain, asam lemak konjugasi
kurang dapat masuk dalam sebagian besar jaringan.(7)
Setelah melalui proses tersebut, CLA termasuk betuk konjugasi 18:3 dan
konjugasi 20:3 kemudian bergabung dengan lipid netral. Di sisi lain, CLA bentuk
konjugasi 20:4 justru bergabung dengan fosfolipid, seperti fosfatidylinositol yang
merupakan bahan utama pembentukan fosfolipase A2 dan biosintesis eicosanoid.
Adanya ikatan ganda pada konfigurasi cis dapat meningkatkan kemungkinan CLA
bergabung dengan fosfolipid.(6)
Kesimpulannya, CLA disalurkan sebagai asam lemak lainnya antara jalur
metabolisme yang berbeda. Namun, mereka beperilaku berbeda dibandingkan dengan
kadar asam lemak non terkonjugasi dan dapat mengganggu metabolisme mereka. Di
sisi lain, hal itu harus digarisbawahi bahwa utama isomer CLA alami adalah asam
rumenic. Untuk aspek kuantitatif, yang kedua adalah cis7, trans9 isomer, yang belum
dipelajari secara ekstensif. Kebanyakan penelitian mempertimbangkan trans10 itu,
cis12 isomer bersama dengan asam rumenic pada hewan atau manusia. Untuk yang
terakhir, titik akhir utama adalah komposisi tubuh, dan data yang diperoleh sejauh ini
masih kontroversial pada manusia. Sebagai contoh, laporan pertama oleh Blankson
dkk. dijelaskan dosis efek tergantung dari campuran CLA, sedangkan kita tidak
menemukan efek dari isomer murni makan sebagai TAG (1,5 atau 3 g / d) selama 16
minggu pada komposisi tubuh.(7)
Cara CLA bekerja dijabarkan sebagai berikut.
 CLA campur tangan dengan Lipoprotein lipase yang membantu penyimpanan
lemak dalam tubuh.
 CLA membantu tubuh kita untuk menggunakan lemak yang ada bagi kebutuhan
energy.
6
 CLA menambah kekenyalan jaringan otot (lean muscle tissue)
 Mekanisme fisiologis pengurangan lemak tubuh (body fat), CLA menghambat
penyimpanan lemak di dalam adiposit yang merupakan tempat penyimpanan lemak
yang utama.
 CLA meningkatkan oksidasi pada otot skelet diman terjadi pembakaran lemak
primer. Pemberian CLA pada manusia dapat menghasilkan penurunan lemak tubuh
9 %, dan kenaikan massa otot 2%. CLA menambah Palmitoyl transferase yang
membawa asam lemak rantai panjang kedalam Mitokondria untuk mengalami β
oksidasi.
 CLA secara significant meningkatkan total aktivitas carnitine palmitoyl transferase
baik di lemak maupun otot, tetapi tidak di hati. Enzim ini membawa asam lemak
rantai panjang untuk menembus membran mitochondria dimana asam lemaknya
akan mengalami beta -oksidasi).
 CLA meningkatkan HSL ( Hormone Sensitive Lipase ) dalam adiposit pada mencit
. HSL adalah suatu enzim lipase paling penting 43 yang mengkatalisa proses
lipolisis dan meregulasi penyimpanan lemak. HSL membatasi degradasi
triacylglycerol (TAG) menjadi diacylglycerol (DAG) dan free fatty acids (FFA)
 Pada 3T3 L1 adiposit, CLA mengurangi heparin releaseable lipoprotein lipase
activity dan konsentrasi intraselular dari triacylglycerol dan glycerol Lipoprotein
lipase (LPL) biasanya meningkat pada obesitas dan enzim ini dapat meningkatkan
penyimpanan triglycerida dalam jaringan adiposa. LPL menghidrolisis trigliserida
menjadi glycerol dan free fatty acid.(8)
7
D. SUMBER CLA
Conjugated Linoleic Acid (CLA) secara alami ditemukan dengan konsentrasi
paling tinggi pada hewan ruminansia seperti susu atau pun produk susu. Jumlah
polimer CLA juga banyak ditemukan pada daging sapi, daging domba dan lemak
susu. Dalam keadaan normal, kandungan CLA dalam susu ruminansia sebesar 0.1%
hingga 2.0% dalam susu. Sedangkan di dalam daging sapi, kandungan CLA dapat
mencapai 1.2 hingga 12.5 mg/g lemak yang terkandung di dalam daging. Kandungan
CLA di dalam lemak susu biasanya lebih tinggi dibandingkan dengannya di dalam
jaringan lemak hewan. Rekomendasi asupan CLA harian bagi manusia adalah 1.5
hingga 3.5 g/hari.(9)
Berdasarkan data kandungan CLA yang terdapat pada lemak hewan, serta
kandungannya yang dinilai bermanfaaat bagi manusia, telah banyak penelitian yang
mengembangkan studi terkait CLA agar menambah kandungan dan efektifitas CLA
dalam tubuh manusia.Reaksi antara asupan dipercaya dapat mempengaruhi
bioavailabilitas CLA dalam tubuh. Seperti kandungan minyak dan biji-bijian yang
tinggi akan asam linoleic, linolenic dan oleic dapat meningkatkan konsentrasi CLA di
dalam susu hingga 75%. Juga, pemanasan pada susu sapi dengan penambahan kacang
kedelai akan memperkaya kandungan asam linoleic yang juga akan meningkatkan
biovailabilitas CLA dari 4 mg/g menjadi 20 mg/g asam lemak tanpa menurunkan
kandungan lemak total.(10) CLA seperti PUFA yang terdapat di minyak ikan juga
dapat meningkatkan enzim antioksidan yang terdapat dalam sel. Penelitian yang
banyak dilakukan oleh para ilmuan, mengambil senyawa asam lemak terkonjugasi
dari minyak tanaman yang banyak mengandung asam linoleat seperti biji bunga
matahari sebagai salah satu contoh substansi yang telah terbukti efektif dalam
mengatasi permasalahan berat badan.(9)
E. PENGARUH PENGOLAHAN CLA
1. Pengaruh fraksinasi pada CLA
Fraksionasi kering pada susu hewan menghasilkan bagian susu yang keras
dan bagian susu yang lembut melalui pendinginan terkontrol dan guncangan. Pada
fraksi terakhir ditemukan kadar CLA lebih tinggi di fraksi lembut dibandingkan
dengan pengukuran pada lemak awal. Refraksionasi untuk bagian kering justru
dapat mengurangi kadar CLA sebanyak 10%.
8
Agregasi memiliki dampak negatif pada kandungan CLA di bagian lembut.
Ada pula hasil penelitian lain yang menyebutkan bahwa fraksionasi kering
menyebabkan turunnya kadar CLA.
2. Pengaruh ekstrak karbon dioksida superkritikal
Konsentrasi CLA dapat ditingkatkan 89% pada susu hewan melalui proses
fraksionasi memakai sistem karbon dioksida berkelanjutan. Fraksionasi kering
pada susu hewan menghasilkan bagian susu yang keras dan bagian susu yang
lembut melalui pendinginan terkontrol dan guncangan. Pada fraksi terakhir
ditemukan kadar CLA lebih tinggi di fraksi lembut dibandingkan dengan
pengukuran pada lemak awal. Refraksionasi untuk bagian kering justru dapat
mengurangi kadar CLA sebanyak 10%.
Agregasi memiliki dampak negatif pada kandungan CLA di bagian lembut.
Ada pula hasil penelitian lain yang menyebutkan bahwa fraksionasi kering
menyebabkan turunnya kadar CLA.
Konsentrasi CLA dapat ditingkatkan 89% pada susu hewan melalui proses
fraksionasi memakai sistem karbon dioksida berkelanjutan. Selain peningkatan
CLA, terjadi pula peningkatan asam lemak tidak jenuh yang berantai panjang.
3. Pengaruh kristalisasi urea pada CLA
Kim dan Liu(33) membuat CLA alami dari lemak susu dengan
kompleksasi urea. Lemak susu dihidrolisis untuk menghasilkan asam lemak,
diikuti dengan kristalisasi dengan rasio yang berbeda pada urea. Asam lemak tidak
jenuh rantai panjang, termasuk CLA, dikonsentrasi setelah proses kristalisasi.
Jumlah CLA meningkat dari 5 mg/g menjadi 12,7 mg/g (meningkat 2,5 kali lipat.
4. Pengaruh mikrofiltrasi pada CLA
Susu yang diperkaya nilai CLA nya dengan tepung ikan terbukti dapat
menurunkan ukuran lemak globular dibandingkan dengan susu yang tidak diberi
tepung ikan. Diameter kasein pada susu yang diperkaya dengan CLA juga lebih
kecil. Michalski dan Fauquant menginvestigasi pengaruh pemisahan globular
lemak susu yang besar dan kecil dengan mikrofiltrasi. Globular lemak kecil
mengandung lebih banyak asam lemak dan sedikit asam stearat dibanding globular
9
lemak berukuran besar. Globular lemak susu yang beukuran kecil relative
mengandung CLA yang lebih banyak dibanding globular lemak susu yang besar.
5. Pengaruh pemanasan pada CLA
Penelitian yang dilakukan oleh Nieuwenhove dan Luna membuktikan
bahwa pemanasan pada suhu yang tinggi tidak meningkatkan kadar CLA.
Campbell dan Precht juga membuktikan bahwa kadar CLA berkurang ketika
dipanaskan pada suhu tinggi hingga 200oC. Penggunaan microwave juga
menyebabkan penurunan kadar CLA pada susu sampai 53%.(11)
F. STUDI KASUS TERKAIT CLA (Conjugated Linoleic Acid)
1. Efek CLA pada Penurunan Berat Badan
Effect of conjugated linoleic acid supplementation on weight loss and body fat
composition in a Chinese population
CLA (Conjugated Linoleic Acid) memiliki banyak manfaat, seperti
mengurangi lemak dalam tubuh, termasuk tubuh hewan. Namun, hasil penelitian
dari CLA terhadap penurunan komposisi massa lemak tubuh
pada manusia
sifatnya belum konsisten. Oleh karena itu, diadakannya penelitian ini. Penelitian
dalam jurnal ini bertujuan untuk menentukan pengaruh CLA terhadap penurunan
Berat Badan dan komposisi tubuh pada subjek yang mengalami overweight atau
obesitas di Cina.(12)
Berikut ini akan dipaparkan terkait metode dalam penelitian ini :
Subjek
Dalam penelitian ini, penentuan subjek dilakukan secara random/acak,
double-blinded, dan kontrol terhadap makanan yang dikonsumsi oleh subjek
dilakukan mulai dari 1 Maret 2009 hingga 31 Mei 2009 di Rumah Sakit E-DA dan
Universitas I-Shou. Semua subjek yang tergabung dalam penelitian ini merupakan
anggota atau staff dari sebuah perusahaan. Dalam penelitian ini, total subjek ada
80 orang yang terdiri dari 26 wanita dan 54 wanita dengan rentan usia 18 – 60
tahun dan memiliki BMI berkisar antara 24 – 35 kg/m2. Subjek termasuk ke dalam
kriteria eksklusi jika subjek mengidap kanker, infeksi berat, penyakit tiroid,
Diabetes mellitus, penyakit Cushing, mengkonsumsi obat, dan peminum alkohol.
10
Selain itu, wanita yang sedang hamil dan dalam masa menyusui juga masuk ke
dalam kriteria eksklusi. Subjek yang tergabung dalam penelitian ini juga dikontrol
asupannya, yaitu 10% lebih besar dari asupan biasanya, dan kontrol aktifitas fisik
selama penelitian ini berlangsung.(12)
Desain penelitian
Subjek diatur untuk mengkonsumsi 1,7 gram suplemen CLA (campuran
dari bioaktif isomer 50% cis-9, trans-11, dan 50% trans-10,cis-12; tonalin = 40)
yang dikonsumsi dengan 200 ml susu (di dalam susu tersebut per 100 ml-nya
mengandung 27 kalori; 0,5 gram protein; 1,2 gram lemak; dan 3,5 gram
karbohidrat). Dalam penelitian ini, konsumsi suplementasi CLA dilakukan selama
12 minggu.(12)
Diet dan aktifitas fisik
Laporan asupan makan yang digunakan dalam penelitian ini bertujuan
untuk menganalisis asupan makan subjek sebelum dan sesudah penelitian. Asupan
makan dikaji selama 3 hari menggunakan dietary record. Subjek yang tergabung
dalam penelitian ini menuliskan secara mandiri makanan apa saja yang
dikonsumsi ke dalam form dietary record, dan menyerahkan form tersebut kepada
ahli gizi yang sedang berkujung ke dalam ruangannya. Selain itu, peneliti juga
memberikan assessment terhadap aktifitas fisik yang biasa dilakukan oleh
subjek.(12)
Mengukur komposisi tubuh dan berat badan
Bioimpedance merupakan teknik yang digunakan untuk menentukan
komposisi tubuh. X-scan Plus II merupakan indikator untuk menganalisis
komposisi tubuh. dengan menggunakan teknik pengukuran tersebut, peneliti dapat
menentukan berat badan, tinggi badan, BMI, Massa lemak tubuh, Massa tubuh
tanpa keam, massa lemak organ internal, massa lemak subkutan, prosentase lemak
tubuh, dan rasio lebar pinggul.(12)
Analisis statistika
Analisis statistika menggunakan aplikasi SPSS 15. Sebelum memulai
penelitian, peneliti menggunakan uji chi-square untuk menguji variabel kualitatif.
Uji T test digunakan untuk mengkaji perbedaan pada continuous variabel .
variabel kategori menggunakan uji Fisher exact dan uji test juga digunakan untuk
11
mengevaluasi perubahan antropometri dan menganalisis variabel dari minggu ke 0
hingga minggu ke 12. Perbedaan kondisi/gejala pada saluran pencernaan diuji
menggunakan uji McNemar. Uji Wilcoxon digunakan untuk mengevaluasi efek
keseluruhan dari suplementasi CLA dan interaksi antara CLA dengan parameter
lainnya. Tingkat signifikansi menggunakan 5% pada semua uji, dan semua uji
menggunakan two-tailed.(12)
Dalam penelitian ini juga dipaparkan bagaimana hasil dari penelitian yang
telah dilakukan. Berdasarkan penelitian yang dilakukan, 63 dari 80 subjek
(78,75%) berhasil mengikuti penelitian ini hingga selesai sampai akhir penelitian
dilakukan. 10 subjek (5 berasal dari kelompok perlakuan dan 5 berasal dari
kelompok kontrol) mengundurkan diri dari penelitian karena alasan pribadi. 7
orang (5 orang dari kelompok perlakuan dan 2 orang dari kelompok kontrol) harus
diekslud dari penelitian karena data dari mereka tidak lengkap. Oleh karena itu,
subjek yang mengikuti penelitian ini hingga akhir adala 63 orang (30 orang di
kelompok perlakuan dan 33 orang di kelompok kontrol).(12)
Setelah 12 minggu berlangsung, jika dibandingkan dengan data awal, berat
badan (∆ = - 0,70 ± 1,71 kg), BMI (∆ = -0,31±0,65 kg/m2), total massa lemak (∆=0,58±1,18 kg), prosentase lemak (∆ = - 0,58 ± 1,19%), lemak subkutan (∆ = - 0,53
± 1,11 kg), dan rasio lingkar pinggang (∆ = - 0,01 ± 0,16) mengalami penurunan
pada subjek yang diberi perlakuan konsumsi CLA. Dari hasil penelitian juga
terdapat hasil yang tidak signifikan terhadap perubahan massa tubuh tanpa lemak
setelah mengkonsumsi CLA selama 12 minggu. (12)
Pada kelompok perlakuan yang terdiri dari 30 subjek (pria 11 orang dan
wanita 19 orang) terdapat hasil dimana wanita memiliki total massa lemak dan
prosentase lemak yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan pria.(12)
Dalam penelitian juga didapatkan hasil pengaruh CLA terhadap nilai
laboratorium. Didapatkan tingkat oxaloacetat transaminase, glutamat piruvat
transaminase, Glu – AC, TC, TG, dan peningkatan LDL, sedangkan HDL
menurun setelah 3 bulan dilakukan treatment. Tidak ditemukan hasil yang
signifikan secara statistik pada nilai laboratorium antara kelompok perlakuan dan
kelompok kontrol.(12)
12
Pembahasan
Setelah melihat hasil penelitian, dapat diketahui bahwa konsumsi
suplementasi CLA secara signifikan dapat menurunkan berat badan, BMI, massa
lemak tubuh, prosentase lemak, lemak subkutan, dan rasio lingkar pinggang pada
subjek yang mengalami overweight dan obesitas tingkat 1. Penemuan tersebut
bertolak belakang hasilnya dengan penelitian yang dilakukan oleh Laso et al.,
yang menyimpulkan bahwa konsumsi susu bersamaan dengan konsumsi
suplementasi 3 gram CLA selama 12 minggu secara signifikan menurunkan massa
lemak pada subjek yang mengalami overweight, namun tidak pada subjek yang
mengalami obesitas. Lain lagi dengan penelitian yang dilakukan oleh Gaullier et al
yang menggunakan 3,4 gram CLA yang dikonsumsi perhari selama 6 bulan.
Mereka menemukan bahwa CLA secara signifikan dapat menurunkan massa
lemak tubuh pada 3 bulan. Penurunan massa lemak tubuh paling banyak ada di
bagian kaki dan pada wanita yang memiliki BMI lebih dari 30 kg/m 2. Peneliti
yakin bahwa perubahan massa lemak tubuh yang ditemukan pada subjek obesitas
disebabkan karena penelitian yang dilakukan oleh Gaullier et al, menggunakan
dosis CLA yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan dosis yang digunakan pada
penelitian yang dilakukan oleh Laso et al, dimana dosis yang digunakan oleh Laso
et al. lebih rendah yaitu hanya 3 gram.(12)
CLA ternyata memiliki sifat memicu terjadinya peningkatan massa tubuh
tanpa lemak. Blankson et al. menyatakan bahwa subjek yang mengalami
overweight/obesitas menunjukkan peningkatan massa lemak tubuh sebesar 0,88 kg
setelah mengkonsumsi CLA 6,8 gram/hari selama 12 minggu. Penelitian ini
sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Steck et al. yang menyatakan
bahwa subjek yang mengkonsumsi CLA dengan dosis 6,8 gram/hari selama 12
minggu mengalami kenaikan massa tubuh tanpa lemak sebesar 0,64 kg pada pria.
Namun, pada penelitian tersebut juga menyatakan bahwa aktifitas fisik subjek
diturunkan selama menjalankan proses penelitian.(12)
Hasil yang kontroversi juga ditemukan dalam penelitian lain yang melihat
pengaruh dari CLA terhadap metabolisme karbohidrat pada manusia. Riserus et al.
menyatakan bahwa resistensi insulin meningkat kejadiannya pada populasi pria
dengan metabolik sindrom setelah mengkonsumsi CLA selama 12 minggu dalam
bentuk trans-10,cis-12-CLA isomer. Namun di dalam penelitian-penelitian yang
13
lain tidak menunjukkan adanya pengaruh CLA dalam bentuk trans-10,cis-12-CLA
isomer terhadap kadar insulin, sensitivitas insulin, maupun resistensi insulin.(12)
Berdasarkan rekomendasi untuk penanggulangan obesitas dari National
Heart, Lung, and Blood Institute, terkait asupan makan, aktifitas fisik, dan/atau
terapi kebiasaan dapat diberikan kepada orang yang membutuhkan penurunan
berat badan. Selain itu, penggunaan suplementasi dalam bentuk apapun perlu
diperhatikan. Masih banyak masyarakat yang masih awam terkait penggunaan
suplementasi tersebut. Obat herbal dan interaksi antar obat dapat terjadi setelah
konsumsi berbagai macam produk penurun berat badan. Oleh karena itu, harus
berhati – hati dalam mengkonsumsi suplemen dalam bentuk apapun. Disarankan
untuk selalu berkonsultasi dengan ahlinya.(12)
Kesimpulan
Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa konsumsi suplementasi CLA
sebesar 3,4 gram perhari selama 12 minggu yang diberlakukan terhadap subjek
overweight dan obesitas tingkat I menunjukkan hasil terjadinya penurunan
indikasi obesitas.(12)
2. Efek CLA pada Enzim Hati
Association of conjugated linoleic acid consumption and liver enzymes
in human studies: A systematic review and meta-analysis of randomized
controlled clinical trials
Latar Belakang Penelitian
Enzim hati meningkat pada gangguan hati akut dan kronis yang berbeda.
Kondisi hati kronis seperti steato hepatitis non alkoholik (NASH) dan penyakit
hati berlemak non alkoholik (NAFLD) adalah cukup lazim. NAFLD dianggap
sebagai salah satu penyebab paling umum dari penyakit hati kronis di seluruh
dunia. Pengukuran laboratorium alanine aminotransferase (ALT), aspartat
aminotransferase (AST), dan alkali fosfatase (ALP) digunakan untuk menilai
penyakit
hati.
Diet
asam
linoleat
terkonjugasi
(CLA)
memiliki
efek
menguntungkan pada lemak tubuh, kanker, dan penyakit kardiovaskular; namun,
menunjukkan bahwa CLA menyebabkan hipertrofi hati dan steatosis hati.(13)
14
Efek CLA terhadap enzim hati tergantung pada berbagai bentuk CLA,
sebagai makanan alami yang diperkaya dengan CLA dan suplemen CLA, yang
memiliki berbagai efek dari enzim hati. Namun, berbagai jenis isomer CLA dan
berbagai dosis menunjukkan hasil yang tidak konsisten dalam berbagai penelitian.
Oleh karena itu, diperlukan review dari temuan kontroversial.(13)
Tujuan Penelitian
Untuk mengetahui hubungan konsumsi asam linoleat terkonjugasi (CLA)
dalam dua bentuk makanan yang diperkaya atau ditambah dengan CLA terhadap
serum enzim hati pada studi manusia.(13)
Metode Penelitian :
1. Pencarian literatur
Pencarian literature pada PubMed, Google Scholar, Cochrane Library,
ScienceDirect, ProQuest, dan Ovid hingga Januari 2015 dengan menggunakan
kata kunci terkait penelitian CLA seperti “cis-9, trans-11-conjugated linoleic
acid”, “trans-10,cis-12-conjugated linoleic acid”, “non-alcoholic steatohepatitis
(NASH)”, “non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)”, “ALT”, “AST”, “ALP”,
“APT”, dan “liver enzymes”. Literatur yang digunakan adalah studi yang meneliti
efek dari suplementasi CLA atau makanan yang diperkaya dengan CLA terhadap
konsentrasi enzim hati antara orang dewasa yang sehat. Perbedaan rata-rata dan
perubahan SD pada serum enzim hati antara kelompok intervensi dan kontrol
digunakan sebagai ukuran efek untuk meta-analisis.
2. Kriteria inklusi dan eksklusi
a. Kriteria inklusi
- RCT dalam desain;
- Studi pada manusia;
- Peserta dewasa sehat tanpa gangguan apapun;
- Intervensi dilakukan dengan menggunakan suplemen CLA atau makanan
yang diperkaya CLA ; dan
- Penilaian serum AST, ALT, dan konsentrasi ALP digunakan sebagai
variabel hasil.
15
b. Kriteria eksklusi
- Studi pada hewan;
- Studi dengan peserta pasien (misalnya, pasien diabetes);
- Studi tentang kelompok umur bukan dewasa;
- Studi non-RCT;
- Percobaan di mana kelompok intervensi menerima bentuk campuran
CLA (CLA dengan asam amino), dan
- Studi tanpa data pelengkap atau tanpa kelompok plasebo.(13)
3. Penilaian kualitas
Skor Jadad kuantitatif 5 point digunakan untuk menilai kualitas studi
yang relevan berdasarkan pengacakan, penyembunyian alokasi pengobatan,
pembutaan, kelengkapan tindak lanjut, dan penggunaan analisis intention-totreat. Salah satu nilai dialokasikan untuk setiap item dengan skor kemungkinan
0-5 (tingkat tertinggi kualitas). Studi dengan skor yang lebih tinggi yang
dianggap memiliki kualitas yang lebih baik.
4. Kutipan data
Pengambilan data termasuk nama terakhir penulis pertama, tahun
publikasi, negara penduduk, jumlah individu dalam kelompok intervensi dan
kontrol, durasi intervensi, usia, jenis kelamin, bentuk, dan dosis CLA dan
plasebo, dan rata-rata dan perubahan SD ALT serum, AST, dan kadar ALP
pada setiap kelompok intervensi dan plasebo.
Tiga studi melaporkan rata-rata dengan SE dan dihitung nilai SD dari
SE dan jumlah peserta pada setiap kelompok. Dalam review ini dihitung
koefisien korelasi dengan menggunakan delapan artikel yang melaporkan
perubahan rata-rata±SD, rata-rata±SD sebelum dan sesudah intervensi untuk
ALT, enam artikel untuk AST, dan 2 artikel untuk kadar ALP, yang digunakan
untuk menghitung perubahan mean dan SD. Dua studi membandingkan efek
dari tiga dosis suplemen CLA: 6,4 g / hari dan 6,8 dan 3,4 g / hari dengan
plasebo, dan ini termasuk sebagai dua studi terpisah di meta analisa. Dua
bentuk CLA termasuk 4,5 g / hari CLA-asam lemak bebas (FFA) 80% (3,6 g
isomer aktif c-9 t-11 dan t-10 c-12) dan 4,5 g / hari CLA-triasilgliserol (CLATG ) 76% (3,4 g isomer aktif c-9 t-11 dan t-10 c-12) telah diselidiki. Dalam
studi lain, peserta diminta untuk mengkategori indeks massa tubuh (IMT)
16
menjadi 2 kategori: <30 kg / m2 dan > 30 kg / m2 pada kedua kelompok CLA
dan placebo.(13)
Hasil

CLA dan ALP : Suplementasi CLA memberikan penurunan yang tidak
signifikan pada level ALP (MD=-0.216: 95% Cl, -0,60 sampai 0,17; P =
0,28)

CLA dan ALT : Analisis berdasarkan sumber asupan CLA menunjukkan
bahwa suplementasi CLA meningkatkan level ALT cukup signifikan.
Sementara itu makanan yang diperkaya dengan CLA tidak dapat
meningkatkan level ALT secara signifikan.

CLA dan AST : Analisis berdasarkan sumber asupan CLA menunjukkan
bahwa suplementasi CLA dapat meningkatkan level AST secara
signifikan, sementara makanan yang diperkaya dengan CLA dapat
menurunkan level AST namun tidak signifikan.(13)
Pembahasan
Suplementasi CLA dapat meningkatkan level AST secara signifikan
dibandingkan dengan placebo. Tidak ditemukan pengaruh yang signifikan
pada level ALT dan ALP baik yang mengonsumsi makanan yang diperkaya
dengan CLA maupun suplemen CLA.(13)
Mekanisme CLA pada fungsi hati masih belum jelas. Meskipun begitu,
penelitian pada tikus menunjukkan bahwa pengaruh CLA terhadap hati bisa
jadi melalui reseptor yang mengaktivasi peroksisom proliferator (PPAR)α dan
PPARβ/δ, dimana keduanya memiliki isomer CLA trans-10 cis 12 dan cis 9
trans 11 sebagai ligand. PPAR adalah reseptor inti pusat untuk glukosa dan
homeostasis lemak. Inaktivasi PPAR dihepatosit berhubungan dengan
peningkatan berat badan dan berat hati, dan menurunkan level AST dalam
darah. Penelitian lain meneliti tentang regulasi isomer spesifik pada
metabolism dan pensignalan PPARϒ oleh CLA pada preadiposit manusia.
Penelitian tersebut menunjukkan CLA trans 10 cis 12 menurunkan ekspresi
PPARϒ, sementara cis 9 trans 11 CLA meningkatkan ekspresi PPARϒ.
Beberapa hal diatur secara positif oleh PPARϒ, seperti lipoprotein lipase
(LPL), adipocyte protein 2 (aP2), dan acyl-coenzym A binding protein
17
(ACBP). Dalam penelitian ini diduga peningkatan level AST disebabkan oleh
peran c9 t11 dalam tubuh.(13)
Dalam review ini terdapat kekurangan dalam mengobservasi hubungn
CLA terhadap kadar ALT. Namun, dari beberapa penelitian yang terobservasi,
ditemukan bahwa suplementasi CLA dapat meningkatkan kadar ALT. Salah
satu penelitian juga menyebutkan bahwa pemberian CLA dengan dosis yang
sama dapat meningkatkan kadar ALT secara signifikan.(13)
Dalam review ini juga tidak didokumentasikan hubungan antara CLA
dan ALP. Tetapi ada penelitian yang menyebutkan bahwa CLA dapat
menurunkan level ALP pada orang overweight yang sehat, namun tidak
signifikan. Sementara itu penelitian lain menyebutkan bahwa suplementasi
CLA dalam proporsi yang sama dapat meningkatkan level ALP pada orang
overweight dan obesitas yang sehat.(13)
Ketidaksesuaian hasil dari beberapa penelitian suplementasi CLA ini
dapat disebabkan oleh bentuk CLA yang berbeda(TG atau FFA), dosis CLA
(2,1-6,8 g pada supplement dan 1,17-3 g pada produk yang diperkaya dengan
CLA), proporsi dan pengaruh isomer spesifik, perbedaan jenis kelamin
subyek, dan berat badan subyek yang bervariasi.(13)
Pada manusia, tidak ditemukan efek samping dari konsumsi CLA pada
hati. Suatu penelitian menyebutkan pemberian CLA selama 3 minggu tidak
memberikan efek samping pada kesehatan manusia. Tidak ada pula ketetapan
mengenai dosis CLA yang direkomendasikan, meskipun beberapa penelitian
membuktikan bahwa dosis yang diperlukan adalah 3 gram per hari, selain itu
ibu hamil tidak direkomendasikan menonsumsi suplemen CLA.(13)
ALT dan AST pada umumnya digunakan untuk mengecek fungsi hati.
Peningkatan aktivitas ALT dan AST
seringkali berhubungan dengan
peningkatan lemak hati, meskipun beberapa peneliti tidak mengonfirmasi
penemuan ini dan menunjukkan bahwa adanya peningkatan enzim hati tidak
mengeluarkan diagnosis NAFLD. Dengan demikian, enzim hati bukan
indicator yang tepat untuk diagnosis dan diagnosis NASH yang tepat
membutuhkan biopsy hati. Oleh karena itu tidak dapat diklaim apakah CLA
mempengaruhi kelainan hati atau tidak. Meskipun begitu, adanya peningkatan
AST yang signifikan dalam penelitian ini, maka disimpulkan bahwa
18
suplementasi CLA dapat memberikan efek yang mengganggu pada NAFLD
dan penyakit hati. (13)
Hepatic steatosis diinduksi oleh CLA berhubungan dengan resistensi
insulin, hiperinsulinemia, dan hiperglikemia. Pengaruh ini dapat menyebabkan
lipodystrophy dan penurunan sekresi adipokine (leptin dan adinopectin)
dimana adinopektin berperan dalam memerangi NAFLD. Dengan demikian,
suplementasi CLA tidak bermanfaat pada NAFLD dan NASH.(13)
Kesimpulan
Suplementasi CLA berhubungan dengan peningkatan kadar AST yang
signifikan dan tidak memberikan efek yang signifikan terhadap ALP dan ALT.
Penelitian lebih lanjut dibutuhkan untuk menentukan dosis dan frekuensi
konsumsi suplemen yang paling efektif.(13)
3. Efek CLA pada Diabetes Melitus
Conjugated linoleic acid supplementation, insulin sensitivity, and lipoprotein
metabolism in patients with type 2 diabetes mellitus
Latar Belakang
Beberapa penelitian pada hewan telah menunjukkan bahwa suplementasi
asam linoleat terkonjugasi ( CLA ) memiliki potensi terapi terhadap sensitivitas
insulin dan metabolisme lipid , pada penyakit kardiovaskular ( CVD ) yang
merupakan faktor risiko penting terkait dengan diabetes mellitus tipe 2.(14)
Tujuan
Untuk mengetahui pengaruh suplementasi CLA dengan metabolisme
glukosa,resistensi insulin , metabolisme lipoprotein , dan inflamasi CVD pada
subyek dengan diabetes tipe 2.(14)
Pengantar
Sejalan dengan epidemi global mengenai diabetes tipe 2. Dengan
demikian, ada kebutuhan untuk mengidentifikasi strategi diet yang efektif untuk
melemahkan pengaruh diabetes tipe 2, yang merupakan penyakit heterogen
19
ditandai dengan resistensi insulin jaringan sasaran yang tidak dapat diatasi dengan
hipersekresi sel β. Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) mendefinisikan
pengelompokan kelainan metabolik yang berhubungan dengan diabetes tipe 2
sebagai sindrom metabolik. Menyebabkan
sensitivitas insulin terganggu;
intoleransi glukosa, atau diabetes mellitus ditambah dengan ≥ 2 gangguan
metabolik, termasuk obesitas,
resistensi
insulin,
hipertensi,
dislipidemia
(peningkatan triasilgliserol plasma dan konsentrasi HDL-kolesterol rendah); dan
mikroalbuminuria. Peradangan rendah, juga termasuk dalam diabetes tipe 2, telah
terlibat dalam perkembangan aterosklerosis. Penyakit kardiovaskular (CVD)
adalah penyebab utama morbiditas dan mortalitas di antara pasien diabetes tipe 2,
sebagai akibat dari adanya beberapa faktor risiko utama untuk CVD pada populasi
pasien ini.(14)
Sedikit yang bisa dilakukan untuk mencegah kecenderungan genetik untuk
diabetes 2, pelemahan dari pengaruh faktor risiko yang dapat dimodifikasi penting
melalui faktor makanan dan gaya hidup. Conjugated linoleic acid (CLA) telah
mendapat perhatian sebagai nutrisi terapi yang potensial terhadap resistensi insulin
dan hiperlipidemia, yang merupakan karakteristik kunci dari diabetes tipe 2. CLA
merujuk pada isomer posisi dan geometri asam linoleat dengan sistem ikatan
ganda terkonjugasi. Studi yang dilakukan pada makanan hewan menunjukkan
bahwa CLA mengurangi lemak tubuh, menurunkan massa tubuh, meningkatkan
metabolisme lipid plasma, dan menghambat perkembangan dan dipromosikan
regresi aterosklerosis. Relatif sedikit studi intervensi pada manusia.(14)
Studi intervensi CLA pada manusia baru-baru ini menunjukkan bahwa
suplemen CLA trans-10, cis-12 (t10, c12 CLA) memiliki efek negatif pada
resistensi insulin, stres biomarker oksidatif dan peradangan pada pria obesitas
yang memiliki tanda-tanda sindrom metabolik. Sebaliknya, kelompok ini
menemukan bahwa suplemen menggabungkan cis-9, trans-11 (c9, T11) dan t10,
c12 CLA meningkatkan konsentrasi triasilgliserol plasma dan metabolisme
VLDL, tanpa efek samping pada insulin dan metabolisme glukosa, pada subyek
sehat. Hasil yang bertentangan mungkin mencerminkan perbedaan dalam durasi
studi, pengaturan studi, dan, yang paling penting komposisi suplemen. CLA
adalah senyawa yang sangat heterogen, dan memiliki efek isomer tertentu yang
berbeda . 2 isomer CLA pokok, c9, T11 dan T10, c12 CLA, telah memiliki efek
kontras pada metabolisme dan efek molekul. Konsumsi suplementasi CLA c9,
20
T11 CLA meningkatkan lipid dan metabolisme glukosa, sedangkan konsumsi t10,
c12 CLA dipromosikan dengan resistensi insulin dan dylipidemia.(14)
Subyek dan Metode
Penelitian ini disetujui oleh Komite Etika Bersama Rumah Sakit St James
dan Federasi Dublin. Irlandia. Tujuan, sifat, dan risiko potensial dari penelitian ini
dijelaskan sebelum diperoleh izin tertulis dari masing-masing relawan. 32 subyek
dengan diabetes tipe 2 yang menghadiri Care Centre Diabetes Day di Rumah Sakit
St James di Dublin dan subyek diabetes yang dikendalikan dengan terapi diet.
Semua subjek memiliki kontrol metabolik stabil dengan konsentrasi hemoglobin
terglikasi (Hb A1c) dari 6,83 ± 0,18 mmol / L dan konsentrasi glukosa darah ratarata puasa dari 7.33 ± 0.24 mmol / L. Tidak ada subjek menerima pengobatan
farmakologis untuk kontrol glukosa atau tujuan menurunkan lipid. Hipertensi
hadir di sekitar satu-setengah dari subyek. Namun, hanya subyek dengan tekanan
darahnya yang stabil berpartisipasi dalam studi. Tidak ada perbedaan dalam
prevelance hipertensi antara 2 kelompok. Selain itu, tidak ada dokumentasi
penyakit makrovaskuler dalam catatan medis dari setiap peserta. Semua subjek
memiliki berat badan yang stabil. Semua mengikuti pedoman makan sehat seperti
yang direkomendasikan oleh American Diabetes Association. Subyek penelitian
tidak mengkonsumsi suplemen asam lemak atau produk makanan lainnya yang
diketahui mempengaruhi metabolisme penanda diabetes tipe 2.(14)
Desain Penelitian
Studi ini dilakukan secara acak, buta ganda, studi terkontrol plasebo
dilakukan pada subyek yang rawat jalan. Subyek menerima 3,0 g CLA / d (enam
kapsul 0,5-g; campuran 50:50 isomer c9, T11 dan T10, c12 CLA) atau plasebo
(campuran minyak kelapa dan minyak kedelai) selama 8 minggu. Plasebo
dirancang untuk mengandung campuran asam lemak yang kebiasaan wakil dari
diet Barat. Semua suplemen yang disediakan oleh Loders Crooklann (Wormeveer,
Belanda). Setiap subyek menerima kapsul 2 tumpuk , pada awal dan setelah
minggu 4. Semua peserta diminta untuk mempertahankan kebiasaan makan dan
gaya hidup mereka. Pengaruh perubahan diet, berat badan, dan aktivitas fisik
dijelaskan kepada subyek.(14)
21
Penilaian Asupan
Asupan makanan rata-rata harian dinilai dengan menggunakan dua catatan
makanan, satu segera sebelum studi dan lainnya selesai pada akhir periode
suplementasi . Langkah-langkah dalam porsi makanan standar , dan atlas makanan
yang digunakan untuk mengukur ukuran porsi.(14)
Pemeriksaan Klinis
Subyek menghadiri Unit metabolik , Departemen Endokrinologi , Rumah
Sakit St James , untuk pengambilan sampel darah setelah 12 jam puasa semalam
sebelum dan sesudah intervensi ( minggu 0 dan 8 ) . Subyek menjauhkan diri dari
latihan dan asupan alkohol berlebih selama 24 jam sebelum pemeriksaan dan
menahan diri dari merokok pada pemeriksaan pagi hari.(14)
Analisis biokimia
Konsentrasi darah untuk pengukuran kolesterol, triasilgliserol, LDL,
interleukin 6 (IL-6), insulin, dan C-peptida dikumpulkan dalam tabung serum.
Darah untuk analisis HDL dan VLDL dikumpulkan dalam tabung berlapis EDTA.
Sampel untuk analisis glukosa dikumpulkan dalam tabung yang mengandung
sodium fluoride, dan darah untuk fibrinogen, protein C-reaktif (CRP), dan asam
lemak analisis dikumpulkan dalam tabung yang mengandung sitrat. Sampel serum
diizinkan untuk membeku selama 1 jam. Sampel untuk lipid, glukosa, insulin, Cpeptida, dan IL-6 dianalisis dengan segera disentrifugasi pada 1400 × g selama 10
menit pada suhu kamar. Sampel sitrat untuk CRP dan fibrinogen pengukuran
dikumpulkan dan kemudian disentrifugasi pada 2000 × g selama 20 menit pada
suhu kamar. Sampel darah dikumpulkan untuk analisis asam lemak disentrifugasi
pada 200 xg selama 20 menit pada suhu kamar. Semua sampel yang tercantum di
atas dibekukan segera dan disimpan pada - 70 ° C untuk analisis selanjutnya.(14)
Konsentrasi glukosa plasma diukur dengan menggunakan penentuan
enzimatik berdasarkan prinsip oksidase glukosa. Konsentrasi serum insulin dan C
- peptida diukur dengan menggunakan fase solid,dan dua situs tes, pada 1235
Auto Delfia sistem immunoassay otomatis. Hb A1c dinilai dengan menggunakan
HPLC analyzer otomatis.(14)
22
IL - 6 dan CRP tes dilakukan dengan menggunakan tes imun sensitivitaa
tinggi pada manusia sesuai dengan instruksi masing-masing produsen . Kegiatan
pembekuan fibrinogen diukur dengan menggunakan uji pembekuan otomatis.(14)
Analisis komposisi asam lemak
Kepatuhan protokol diverifikasi dengan melakukan penghitungan kapsul
dan dengan pengukuran komposisi plasma asam lemak dengan menggunakan gas
kromatografi cair (GLC). Total lipid plasma diisolasi dengan menggunakan
metode Folch et al. Total metil ester plasma lipid disiapkan dengan menambahkan
0,5 mL 0,01 mmol NaOH / L dalam metanol kering dan kemudian menambahkan
0,5 mL boron trifluorida.(14)
Pengukuran antropometri
Berat badan diukur pada keseimbangan elektronik (hingga 0,1 kg) dengan
tanpa sepatu. Tinggi dinilai dengan menggunakan stadiometer yang diukur dengan
ketelitian 0,1 cm. Pinggang lingkar diukur pada lingkar minimum antara krista
iliaka dan tulang rusuk.(14)
Penyiapan data dan analisis statistik
Semua analisis statistik dilakukan dengan menggunakan software DATA
DESK (versi 6.0; Data Description Inc, Ithaca, NY). Data postprandial dinyatakan
dalam ringkasan bentuk yaitu, daerah di bawah kurva postprandial (AUC), daerah
tambahan di bawah kurva postprandial (IAUC), konsentrasi postprandial
maksimum (Cmax), dan waktu untuk maksimal konsentrasi postprandial (Tmax).
Data ini digunakan untuk menyelidiki variasi postprandial antara kelompok
suplemen. AUC dihitung dengan menggunakan aturan trapesium, dan IAUC
dihitung sebagai total AUC tambahan menurut Le FLOCH. Model penilaian
homeostasis (HOMA) dihitung sebagai glukosa puasa (mg/dL) dikalikan dengan
insulin puasa (μU/mL) dibagi dengan 22,5.(14)
Analisis kovarians (ANCOVA), setelah kontrol nilai dasar dari variabel
hasil, digunakan untuk mengidentifikasi perubahan signifikan dalam nilai-nilai
biokimia setelah periode suplementasi dikontrol untuk konsentrasi baseline
microalbumin dan kolesterol karena nilai-nilai dasar berbeda antara kelompok.
Analisis tiga arah varians (ANOVA) dengan subjek, pengobatan, dan intervensi
23
sebagai variabel independen dan interaksi perlakuan dari intervensi digunakan
untuk mengidentifikasi perubahan signifikan dalam komposisi asam lemak
plasma.(14)
Hasil
Karakteristik subjek dan intervensi detail
Karakteristik awal dari dua kelompok belajar dirangkum dalam sebuah
tabel. Rerata usia, berat badan, indeks massa tubuh (BMI; kg / m2), lingkar
pinggang, lingkar pinggul, WHR, persentase lemak tubuh, dan durasi diabetes
tidak berbeda secara signifikan antara kelompok. Pengukuran antropometri tidak
berubah setelah diberi CLA atau kontrol suplemen. Subyek mengkonsumsi
96,16% dari suplemen diresepkan. Kepatuhan tidak berbeda secara signifikan
antara kelompok studi: 96,33% dan 95,83% dari suplemen yang digunakan oleh
kontrol dan masing-masing CLA kelompok. Analisis diet, didasarkan pada dua
catatan makanan, sebelum dan setelah intervensi, menunjukkan bahwa energi ratarata harian, makronutrien, serat makanan, kolesterol, asupan alkohol, dan
kontribusi persentase terhadap total atau energi makanan tidak berbeda secara
signifikan setelah CLA atau suplementasi placebo. Selain itu, berarti asupan gizi
harian tidak berbeda secara signifikan antara kelompok sebelum atau sesudah
intervensi.(14)
Metabolisme insulin dan glukosa
Pengaruh suplementasi CLA pada berbagai sensitivitas insulin dan kontrol
glikemik ditunjukkan pada konsentrasi glukosa puasa. secara signifikan meningkat
setelah suplementasi CLA (P<0,05). HOMA juga secara signifikan lebih tinggi
setelah suplementasi CLA daripada setelah suplementasi kontrol (P=0,05). Kedua
OGIS dan ISI (komposit) secara signifikan lebih rendah setelah suplementasi CLA
daripada setelah suplementasi kontrol (P=0,05 dan P<0,05, masing-masing).
Berulang-langkah ANOVA menunjukkan bahwa konsentrasi glukosa plasma,
seruminsulin, dan C-peptida meningkat secara signifikan (P<0.001) selama
OGTT. Baik sebelum dan sesudah intervensi, konsentrasi glukosa postprandial
secara signifikan lebih tinggi pada kelompok CLA, sedangkan konsentrasi Cpeptida postprandial secara signifikan lebih tinggi pada kelompok kontrol
(P<0,01). Konsentrasi glukosa puasa secara signifikan lebih tinggi setelah
24
suplementasi CLA daripada setelah suplementasi kontrol (P<0,05). Konsentrasi
glukosa postprandial tidak berubah secara signifikan dengan suplemen.(14)
Metabolisme lipoprotein
Tidak ada efek signifikan baik CLA atau suplemen kontrol pada
konsentrasi total kolesterol LDL atau jumlah konsentrasi kolesterol HDL yang
meningkat secara signifikan setelah suplementasi CLA (P<0,05). Kenaikan 7,9%
konsentrasi kolesterol HDL total adalah karena peningkatan yang signifikan dalam
konsentrasi HDL2 setelah suplementasi CLA (P< 0,05). LDL: HDL kolesterol
secara signifikan berkurang setelah suplementasi CLA (P<0,01). Serum dan
VLDL triasilgliserol dan konsentrasi kolesterol VLDL tidak signifikan diubah
oleh salah satu suplemen.(14)
Tanda peradangan dan koagulasi
Pengaruh CLA dan kontrol suplementasi pada peradangan dan koagulasi
juga ditentukan. Konsentrasi fibrinogen plasma secara signifikan lebih rendah
setelah suplementasi CLA daripada setelah suplementasi kontrol (315,11± 7.34,
317,36± 5,56, 310,15± 5.84, dan 294,30± 5,87 mg / dL untuk kontrol seminggu ,
kontrol 8 minggu, CLA minggu , dan CLA 8 minggu , masing-masing) significan
daripada suplementasi kontrol (P<0,01).(14)
Diskusi
Penelitian ini menentukan pengaruh suplementasi CLA pada beberapa
faktor risiko CVD dengan terkontrol baik diabetes tipe 2 yang diobati dengan
terapi diet saja. Mengingat peningkatan risiko CVD terkait dengan diabetes,
penting untuk menyelidiki kemampuan terapi nutrisi untuk melemahkan pengaruh
faktor risiko yang dapat dimodifikasi terkait dengan CVD pada kelompok pasien
risiko tinggi ini. Toleransi glukosa dan sensitivitas insulin adalah pusat untuk
diabetes tipe 2, dan karena itu merupakan OGTT dilakukan dan postprandial
indeks diselidiki. Suplementasi CLA memiliki efek negatif pada konsentrasi
glukosa puasa. HOMA adalah ukuran umum dari resistensi insulin, yang berasal
dari konsentrasi insulin dan glukosa.(14)
Dalam penelitian ini, suplemen CLA memiliki efek buruk pada resistensi
insulin, peningkatan HOMA sebesar 19%. Konsentrasi glukosa plasma
25
postprandial telah dikutip sebagai faktor risiko independen untuk CVD pada orang
dengan diabetes tipe 2. Konsentrasi glukosa dan insulin postprandial tidak
meningkat secara signifikan setelah suplementasi CLA, tapi ISI (komposit), yang
berasal dari tindakan puasa dan postprandial, menurun secara signifikan setelah
suplementasi CLA.(14)
Dalam kasus subyek dengan diabetes tipe 2, campuran CLA mengandung
jumlah yang sama dari c9, T11 dan T10, c12 CLA tidak meningkatkan insulin dan
metabolisme glukosa. Suplementasi CLA memiliki efek positif pada konsentrasi
kolesterol HDL dalam penelitian ini. Telah dilaporkan bahwa, untuk setiap
kenaikan 0,03 mmol / L konsentrasi HDL-kolesterol, ada pengurangan 2-3%
diresiko penyakit jantung koroner (PJK). Dengan demikian, peningkatan
kolesterol HDL setelah suplementasi CLA bisa mewakili pengurangan 7,3-11% .
Oleh karena itu, efek dari suplementasi CLA pada LDL: HDL kolesterol pada
diabetes tipe 2 mungkin manfaat klinis. Kurangnya efek pada CLA pada
metabolisme triasilgliserol kontras dengan temuan sebelumnya penelitian ini.(14)
4. Efek CLA pada Antioksidan
Antioxidant effects of the combination of conjugated linoleic acid and
phytosterol supplementation in Sprague-Dawley rats
Tujuan Penelitian
Untuk menginvestigasi efek asupan suplementasi Conjugated Linoic Acid
(CLA) dan fitosterol dan kombinasi mereka pada aktifitas enzim antioksidan dan
biomarker peroksidasi lemak pada tikus sehat.
Metode Penelitian
Tikus percobaan terdiri dari 40 ekor yang dibagi menjadi lima grup dan
menerima asupan suplementasi 2% dari minyak kedelai (grup S), minyak bunga
matahari (grup LA) (control), campuran c9,t11 dan t10,c12 CLA (grup CLA),
fitosterol (grup P) dan campuran CLA dan fitosterol (grup CLA+P) selama 9
minggu. Perhitungan dilakukan pada aktifitas enzim antioksidan pada aktifitas
autoksidasi lemak dengan indikator plasma lemak dan liver.
Kombinasi
suplementasi CLA dan fitosterol mengabaikan asupan makanan, penambahan
26
berat badan, nilai plasma malodialdehid (MDA) dan glutation (GSH), serta
aktifitas superoksida dismutase (SOD), glutation peroksidase (GPx) dan glutation
redukstase (GRd).
Hasil Penelitian
Binatang tampak sehat saat proses penelitian dan menerima dengan baik
makan yang bersuplemen. Dari hasil statistik asupan makanan p<0,05 dibawah
dari kelompok CLA dibandingkan dengan kelompok studi. Tapi ukuran berat
badan naik hampir sama disetiap kelompok. Suplementasi CLA meningkat secara
signifikan 3,7 kali aktifitas plasma CAT dan 60% plasma 8-isoprostan
dibandingkan dengan kelompok S p<0,05. Dalam tambahannya hubungan antara
CLA dan phytosterols mampu untuk mengembalikan CAT dan 8-isoprostan ke
level basal, sejak indikator CLA+Kelompok P secara statistika sama dengan S
grup. Tidak ada perbedaan yang signifikan antara kelompok experimental untuk
plasam level GSH, GRd dan aktifitas GPx (P>0,05). Kelompok CLA dan P titik
terendah (15.16± 1,23 U/mL) dan tertinggi (23.38±2.33 U/mL) aktifitas plasma
SOD masing-masing (p<0,05). Kelompok CLA+P menampilkan nilai SOD sama
dengan kelompok S. Kelompok LA, CLA dan P menampilkan pengurangan yang
signifikan pada plasma level MDA 48% (P<0,05) dibandingkan dengan kelompok
S. Suplementasi dengan CLA, phytosterols dan campuran (CLA+P) menampilkan
penurunan signifikan pada level MDA 50% dibandingkan dengan S dan kelompok
LA. Peroximals, β-oxidation, telah diregulasikan oleh peroxisome proliferator
activated receptors (PPAR), seperti PPARα. Jika terdapat perubahan aktifitas
dapat mempengaruhi konsentrasi dari 8-isoprostan. Beberapa studi mengarahkan
pada pengembangan stress oksidatif dengan determinasi dari 8-isoprostan pada
model yang berbeda termasuk manusia. Bagaimanapun, pada kenyataannya
suplementasi CLA+P pada hewan sama dengan 8-isoprostan dibandingkan dengan
kelompok S.
Kesimpulan
Kombinasi diet pada CLA dan phytosterols menyebabkan peningkatan
status antioxidan, penurunan pada lipid peroxidastion dan memproteksi dari
kemungkinan suplementasi CLA yang menyebabkan stress oksidatif pada tikus.
Bagaimanapun, efek metabolik dari hubungan difergen dan tidak sempurna
27
dijelaskan, jadi investigasi lebih lanjut membutuhkan klarifikasi dalam penemuan
sinergisitas dan hubungan antara CLA dan phytosterol. (15)
5. Efek CLA pada Aterosklerosis
Selective Effect of Conjugated Linoleic Acid Isomers on Atherosclerotic
Lesion Development in Apolipoprotein-E Knockout Mice
Tujuan
Untuk mengetahui pengaruh isomer Conjugated Linoleic Acid pada
perkembangan lesi aterosklerosis pada tikus. (16)
Pengantar
Efek potensial dari CLA pada aterosklerosis masih sangat kontroversial.
Penelitian in vivo melaporkan bahwa CLA memiliki efek anti aterogenik pada
kelinci dan hamster. Sebaliknya, pada penelitian lain menyebutkan bahwa tikus
yang diberikan CLA mengalami peningkatan perkembangan lesi aterosklerosis.
Mekanisme anti atrerogenik pada CLA masih belum jelas. Hal yang menjadi kunci
isu dari CLA adalah pada komposisi yang digunakan pada intervensi dengan CLA.
Isomer CLA yang berbeda akan menghasilkan efek yang berbeda pada
metabolisme lemak dan resistensi insulin. Penelitian ini menguji hipotesis yang
menyatakan bahwa isomer utama pada CLA memiliki memiliki efek spesifik pada
perkembangan lesi aterosklerosis yang dapat menjelaskan variabilitas antara
berbagai penelitian yang telah dilakukan. Tikus yang mengalami kekurangan
ApoE dipilih karena tikus ini dapat mengalami efek spontan pada perkembangan
aterosklerosis dan dapat menjadi media yang baik untuk melihat efek dari
intervensi asupan.
Metode
 Hewan Coba
Sampel adalah 29 tikus jantan berusia 3 bulan yang mengalami
defisiensi apoE. Kolesterol dan konsentrasi trigliserida diperkirakan dari
awal pada sampel diambil dari pleksus retroorbital pada hewan setelah puasa
semalaman, dan digunakan untuk mendistribusikan secara acak pada tiga
kelompok dengan konsentrasi yang sama. Tikus ditempatkan pada kandang
28
yang steril dengan pencahayaan selama 12 jam sehari dan diberikan akses
untuk makan dan minum. Makanan ditentukan menggunakan kandang
metabolik dan berat badan dicatat mingguan di seluruh percobaan.
 Asupan
Asupan makan diberikan secara semi-purified yang semuanya adalah
isokalorik dan isonitrogen berisi 0.15% kolesterol dan 30% energi dari
lemak. Asupan SFA, MUFA, dan PUFA diberikan dengan proporsi yang
sama ( masing-masing 40%, 33% dan 27% dari total lemak). PUFA
diberikan yang mengandung asam linoleat dan CLA. Makanan disimpan
dalam suhu -20oC. Diet diberikan setiap hari selama 12 minggu.
 Determinasi Biokimia
Setelah masa percobaan, tikus akan dimatikan lemas dengan CO2 dan
darah diambil dari hatinya. Plasma NEFA, konsentrasi kolesterol trigliserida
diukur dalam uji mikrotiter. Kolesterol HDL dilihat dengan cara yang sama
setelah pengendapan apoB mengandung partikel asam fosfotungstat.
Pengukuran dari total 8-iso-prostaglandin dilakukan oleh immunoassay.
 Evaluasi Lesi Aterosklerosis
Jantung dan pembuluh arteri diperfusi dengan phosphate-buffered
saline bawah tekanan fisiologis. Hati dan aorta dibedah dan dibersihkan.
Untuk studi pada wajah, aorta disimpan dalam formalin netral. Aorta pada
dasar hati diambil, dipindahkan ke liquid UCT (Bayer Diagnostik, Jerman)
dan dibekukan dalam cairan N2-cooled isopentana. Rata-rata ukuran lesi
menggunakan evaluasi morfometrik. Gambar diambil dengan mikroskop
Nikon yang dilengkapi dengan kamera digital Cannon.
Hasil
 Efek isomer khusus CLA pada metabolisme lemak dan berat badan
Tikus yang diberikan diet CLA isomer t10, c12 menunjukkan kenaikan
berat badan yang lebih rendah dibandingkan dengan kelompok kontrok dan
tikus yang diberikan diet CLA isomer c9,t11. Konsentrasi kolesterol plasma
tidak signifikan antara kelompok eksperimen. Diet c9,t11 secara signifikan
29
mengurangi kolesterol plasma dan konsentrasi NEFA, serta meningkatkan
konsentrasi apo A-1 dibandingkan dengan kelompok kontrol. Sebaliknya,
diet t10,c12 secara signifikan meningkatkan total kadar kolesterol HDL
plasma, trigliserida dan konsentrasi NEFA dan mengurangi tingkat apo-A1
dibandingkan dengan kontrol dan diet isomer c9,t11. Konsentrasi apoB
plasma secara signifikan lebih besar pada isomer t10,c12 dibandingkan
dengan diet isomer c9,t11 tetapi tidak dengan kelompok kontrol. Selain itu,
untuk diet isomer t10, c12 dikaitkan dengan hiperglikemia dan sebaliknya
c9,t11 justru mengurangi glukosa plasma dan konsentrasi insulin.
 Perbedaan efek isomer CLA pada daerah lesi aterosklerosis
Secara signifikan terdapat lebih banyak ekstensi pada dorsal dan
lumbar menunjukkan fokus sterosklerosis setelah pemberian diet CLA
isomer t19,c12. Sebaliknya, arkus aorta tidak menunjukkan perubahan antar
kelompok, yang menunjukkan bahwa aterosklerosis di wilayah ini jenuh dan
tidak sensitif terhadap inervensi diet. Hasil ini jelas menunjukkan
perkembangan selektif aterosklerosis tergantung pada isomer CLA yang
digunakan.

Efek isomer CLA pada stabilitas plak aterosklerosis
Adanya sel-sel otot yang lebih halus dan kadar serat dalam plak pada
kelompok kontrol dan kelompok diet dengan isomer c9,t11 dibandingkan
dengan isomer t10,c12.
 Pengaruh isomer CLA pada parameter oksidatif dan inflamasi
Isomer t10,c12 secara signifikan meningkatkan level plasma 8-isoprostaglandin F2 dibandingkan dengan kelompok kontrol dan kelompok
isomer c9,t11. Aktivitas chitotriosidase secara signifikan meningkat setelah
diberikan diet CLA isomer t10,c12 dibandingkan dengan kelompok kontrol
dan diet isomer CLA c9,t11. Plasma MPC-1 meningkat pada siet isomer
c9,t11 dibandingkan dengan kelompok kontrol dan kelompok isomer
t10,c12. (16)
30
Daftar Pustaka
1.
Wysong RL. Lipid Nutrition. Understanding Fats and Oils in Health and Disease.
Michigan, USA: Inquiry Press; 1990.
2.
The Institute for Functional Medicine. Phytonutrient Spectrum Comprehensive Guide.
2014.
3.
Kock PHL D. The Effect of Dietary Conjugated Linolei Acid Supplementation on The
Physicochemical Nutritional. 2012.
4.
Ryder JW, Portocarrero CP, Song XM, Cui L, Yu M CT. Isomer-Specific Antidiabetic
Properties of Conjugated Linoleic Acid. (13):1149–57.). 13(1149):57.
5.
Aydin. Conjugated Linoleic Acid : Chemical Structure , Sources and Biological
Properties. 2005;29:189–95.
6.
Churruca I, Fernández-Quintela A, Portillo MP. Conjugated linoleic acid isomers:
differences in metabolism and biological effects. Biofactors. 35(1):105–11.
7.
Chardigny JM, Brugere CM, Sebedio JL. CLAs, Nature, Origin and Some Metabolic
Aspects. Janvier-Fevrier. 2005;12(1):18–21.
8.
T P. Pemberian Conjugated Linoleic Acid Menurunkan Berat Badan Dan Mengurangi
Lingkar Perut Lebih Banyak Daripada Phosphatidyl Serine Pada Perempuan Obese.
2011;42–3. Available from: http://www.pps.unud.ac.id/thesis/pdf_thesis/unud-14081211194090-tresiaty tesis.pdf
9.
Cossio MLT, Giesen LF, Araya G, Pérez-Cotapos MLS, Vergara RL, Manca M, et al.
No Title No Title. Uma ética para quantos? 2012.
10.
Dj C. Brief Review Conjugated Linoleic Acid ( CLA ) -An Overview. 2011;4(3):12–8.
11.
Belletti N, Gatti M, Bottari B, Neviani E, Tabanelli G, Gardini F. Antibiotic resistance
of lactobacilli isolated from two italian hard cheeses. J Food Prot. 2009;72(10):2162–9.
12.
Effect of conjugated linoleic acid supplementation on weight loss and body fat
composition in a Chinese population. Nutrition. 2012;
13.
Mirzaii S, Mansourian M, Seyedeh-Masomeh Derakhshandeh-Rishehri, Kelishadi R,
Heidari-Beni M. Association of conjugated linoleic acid consumption and liver
enzymes in human studies: A systematic review and meta-analysis of randomized
controlled clinical trials. Nutrition. 2015;
14.
Moloney F, Yeow T, Mullen A, Nolan JJ, Roche HM. Conjugated linoleic acid
supplementation , insulin sensitivity , and lipoprotein metabolism in patients with type
2 diabetes mellitus 1 – 3. 2004;(2).
31
15.
Marineli RDS, Marques AYC, Furlan CPB, Maróstica MR. Antioxidant effects of the
combination of conjugated linoleic acid and phytosterol supplementation in SpragueDawley rats. Food Res Int. Elsevier Ltd; 2012;49(1):487–93.
16.
Arbonés-Mainar JM, Navarro M a, Guzmán M a, Arnal C, Surra JC, Acín S, et al.
Selective effect of conjugated linoleic acid isomers on atherosclerotic lesion
development in apolipoprotein E knockout mice. Atherosclerosis [Internet]. 2006 Dec
[cited
2015
Dec
11];189(2):318–27.
Available
from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16530768
32