Diversitas bakteri asal spora fungi mikoriza

BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Silvikultur Fakultas
Kehutanan Institut Pertanian Bogor dari bulan Maret 2010 – Februari 2011.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini yaitu: alkohol, spirtus,
aquades, tissue, parafilm, kertas saring, aluminium foil, kertas label, zeolit, media
Potato Dextros Agar (PDA), media Nutrient Broth (NB), media Nutrient Agar
(NA), media enzim protease, media enzim selulase, media enzim pektinase,
Kloramin-T 2%, Streptomycin 0.02%, spora FMA Glomus sp., spora FMA
Gigaspora sp., fungi patogen (Rhizoctonia sp., Sclerotium sp. dan Ganoderma
sp.).
Alat-alat yang digunakan pada peneitian ini yaitu: saringan bertingkat,
Laminar Air Flow Cabinet, mikroskop, autoklaf, timbangan analitik, hot plate dan
stirer, oven, shaker, inkubator, sentrifus, refrigerator, labu ukur, labu Erlenmeyer,
gelas piala, cawan Petri, bunsen, spatula, jarum inokulasi, pipet, pipet mikro,
jarum suntik, botol film, ependof, botol semprot, gunting, stopwatch, kamera
digital.
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Eksplorasi Bakteri yang Berasal dari Spora FMA
3.3.1.1 Isolasi spora FMA
Spora yang digunakan berasal dari jenis Gigaspora sp. dan Glomus sp.
yang diperoleh dari koleksi Laboratorium Silvikultur, Fakultas Kehutanan IPB.
Isolasi spora dilakukan dengan menggunakan metode Gardeman dan Nicholson
(1963). Spora yang telah ditemukan dimasukan ke dalam botol 10 ml, masingmasing sebanyak 50 spora per botol dan disimpan di dalam refrigerator.
3.3.1.2 Isolasi bakteri dari spora FMA
Spora Gigaspora sp. dan Glomus sp. disterilkan permukaannya, kemudian
diekstraksi untuk mendapatkan bakteri yang terdapat di dalam spora-spora
tersebut dengan menggunakan metode Budi et al. (1999). Hasil ekstraksi
27
selanjutnya disebar di atas media NA dan disimpan di dalam inkubator pada suhu
300C selama tiga hari, untuk mendapatkan koloni bakteri.
3.3.1.3 Karakterisasi dan identifikasi bakteri
Koloni yang tumbuh dikarakterisasi secara morfologi (warna, permukaan
koloni, tipe koloni) kemudian dimurnikan. Identifikasi bakteri dilakukan di
Laboratorium Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bandung. Metode yang
digunakan adalah metode Analitycal Profile Index (API) (Buchanan dan Gibbons
(1974); Holt et al. (1994); Cappuccino dan Sherman (2005)). Secara garis besar
analisis menggunakan metode ini dilakukan dengan melihat bentuk makroskopis
koloni, bentuk mikroskopis sel, motilitas dan reaksi biokimia dari bakteri.
3.3.2 Uji Stimulasi Mikoriza
Uji stimulasi spora FMA dilakukan secara in vitro menggunakan spora
Gigaspora sp. Pengujian dilakukan sesuai dengan metode Budi et al. (1999).
Sterilisasi
permukaan
spora
dilakukan
sebelum
pemberian
perlakuan.
Perkembangan spora dan hifa awal diukur terlebih dahulu dengan mengambil 100
spora secara acak untuk dilakukan pengamatan dan pengukuran. Rata-rata dari
100
spora
tersebut
digunakan
sebagai
pendekatan
untuk
mengetahui
perkembangan spora dan hifa sebelum diberi perlakuan. Spora yang diberi
perlakuan ditempatkan pada kertas saring steril yang dijenuhkan di dalam 100 ml
suspensi bakteri dan dimasukan ke dalam cawan Petri berisi media zeolit dengan
jumlah spora sebanyak 10 spora untuk setiap cawan Petri. Cawan Petri direkatkan
dengan parafilm, kemudian diinkubasi dalam keadaan gelap pada suhu 300C
selama 21 hari.
Pengamatan dilakukan dengan mengukur panjang hifa dibandingkan
dengan kontrol. Isolat bakteri yang dapat menstimulasi pertumbuhan mikoriza
dapat dipertimbangkan sebagai MHB.
Uji stimulasi mikoriza dilakukan menggunakan Rancangan Acak Lengkap
dengan 13 perlakuan dan diulang sebanyak 3 kali. Data yang diperoleh diolah
menggunakan perangkat statistik SAS dan dilanjutkan dengan uji Duncan.
3.3.3 Uji Enzimatik
Uji enzimatik dilakukan untuk melihat adanya potensi aktivitas enzimatik
dari bakteri yang ditemukan, khususunya aktivitas enzim hidrolitik. Aktivitas
28
enzim yang akan diuji yaitu enzim selulase, protease, dan pektinase. Uji aktivitas
enzim selulase dan pektinase dilakukan dengan metode Teather dan Wood (1982),
sedangkan aktivitas enzim protease menggunakan metode Dunne et al. (1997).
Pengamatan yang dilakukan ialah: adanya zona bening (hallo) pada media.
Bakteri yang menunjukan respon terhadap media selanjutnya akan ditandai, dan
diukur diameter zona beningnya.
Penelitian dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap.
Perlakuannya ialah 12 bakteri hasil isolasi, dan diulang sebanyak 3 kali. Data
yang diperoleh diolah menggunakan perangkat statistik SAS dan dilanjutkan
dengan uji Duncan.
3.3.4 Uji Antagonis
Uji antagonis dilakukan
secara in vitro untuk melihat adanya sifat
antagonis dari bakteri hasil isolasi terhadap jenis-jenis fungi patogen tular tanah.
Patogen yang digunakan ialah Rhizoctonia sp. Ganoderma sp. dan Sclerotium sp.
Patogen-patogen tersebut diperoleh dari laboratorium Penyakit Hutan, Fakultas
Kehutanan IPB.
Pengujian dilakukan sesuai dengan metode Varese et al. (1996). Patogen
ditumbuhkan pada cawan Petri
yang berisi media PDA. Koloni dari bakteri
ditempatkan pada jarak 1.5 cm dari patogen. Cawan Petri direkatkan dengan
parafilm dan diinkubasikan dalam keadaan gelap pada suhu 250 C dengan durasi
waktu hingga penuhnya kontrol pada media PDA.
Pengamatan dilakukan dengan mengukur pertumbuhan fungi yang diberi
perlakuan secara radial dibandingkan dengan kontrol. Data pengamatan digunakan
untuk menghitung perkembangan radial miselium dan persen penghambatan
bakteri terhadap patogen. Persen penghambatan dihitung dengan menggunakan
rumus:
Persen penghambatan
= 100 % - Persen (%) total pertumbuhan fungi.
Persen total pertumbuhan fungi = Diameter perkembangan fungi X 100 %.
Total diameter cawan Petri
Uji antagonis dilakukan menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan
13 perlakuan dan diulang sebanyak 3 kali. Data yang diperoleh diolah
menggunakan perangkat statistik SAS dan dilanjutkan dengan uji Duncan.
29