PENINGKATAN ENERGI LISTRIK SEL BAHAN
advertisement
PENINGKATAN ENERGI LISTRIK SEL BAHAN BAKAR MIKROBA MELALUI PERUBAHAN STATUS REDOKS PADA Escherichia coli MARA ANDA RIVAL DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PRTANIAN BOGOR 2016 PELIMPAHAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Peningkatan Energi Listrik Sel Bahan Bakar Mikroba melalui Perubahan Status Redoks pada Escherichia coli” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Agustus 2016 Mara Anda Rival NIM F34110057 ABSTRAK MARA ANDA RIVAL. Peningkatan Energi Listrik Sel Bahan Bakar Mikroba Melalui Perubahan Status Redoks pada Escherichia coli. Dibimbing oleh DJUMALI MANGUNWIDJAJA dan PRAYOGA SURYADARMA. Kebutuhan energi di bidang industri sangat tinggi. Salah satu teknologi sumber energi alternatif yang dapat diperbaharui yaitu sel bahan bakar mikroba (microbial fuel cell / disingkat MFC). Format dehidogenase (FDH) yang telah ditransformasikan pada E. coli mampu meregenerasi NAD+ menjadi NADH dengan mendekomposisi format menjadi CO2. Tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan pengaruh penyisipan jalur FDH dan penambahan format pada kultur E. coli terhadap peningkatan produksi energi listrik dalam rangkaian MFC. Perubahan tegangan listrik yang dihasilkan dapat dikonfirmasi melalui analisis bobot sel kering, konsumsi glukosa, format sisa, dan akumulasi asetat serta piruvat. Sel E. coli ditumbuhkan dalam kondisi aerob melalui penambahan format dengan konsentrasi 4 g/l pada kultur bergoyang 200 rpm selama 24 jam. Penyisipan jalur FDH dan penambahan format pada kultur E. coli terbukti dapat meningkatkan tegangan listrik pada rangkaian MFC dari 7.15 menjadi 20.35 mV. Sementara itu, penambahan format pada induk sel E. coli hanya meningkatkan tegangan listrik dari 7.15 menjadi 13.2 mV. Kata Kunci : Escherichia coli, sel bahan bakar, tegangan listrik, format dehidrogenase, NADH. ABSTRACT MARA ANDA RIVAL. Enhancement of Electrical Energy Microbial Fuel Cells by Changing The Redox Status in Escherichia coli. Supervised by DJUMALI MANGUNWIDJAJA and PRAYOGA SURYADARMA. Energy need in industry is very high. One of the renewable energy resource that can be applied to industry is Microbial Fuel Cell (MFC). Formate dehydrogenase (FDH) which has been transformed to E. coli is able to regenerate NAD+ to NADH by decomposing the format into CO2. The purpose of this research is gaining influence FDH insertion and the formate addition to the E. coli culture due to the electrical energy increasing of electrical energy in MFC. The change of electrical voltage is confirmed by the analysis of dry cell weight, glucose consumption, the rest of the formate, the accumulation of acetate, and pyruvate. E. coli cells were grown under aerobic conditions with the addition of format with a concentration of 4 g/l at agitation rate of 200 rpm shaking culture for 24 hours. Insertion of FDH pathways and adding formate to E. coli cultures increased the electrical voltage on MFC circuit from 7.15 into 20.35 mV. Meanwhile, the addition of format on the parent cells of E. coli increase the electrical voltage from 7.15 to be 13.2 mV. Keywords: Escherichia coli, microbial fuel cells, electrical voltage, formate dehydrogenase, NADH PENINGKATAN ENERGI LISTRIK SEL BAHAN BAKAR MIKROBA MELALUI PERUBAHAN STATUS REDOKS PADA Escherichia coli MARA ANDA RIVAL Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pertanian pada Depeartemen Teknologi Industri Pertanian DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PRTANIAN BOGOR 2016 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2015 sampai Oktober 2015 ini ialah penghasil listrik dari mikroba, dengan judul Peningkatan Energi Listrik Sel Bahan Bakar Mikroba Melalui Perubahan Status Redoks pada Escherichia coli. Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Ir Djumali Mangunwidjaja, DEA dan Dr Prayoga Suryadarma, STP MT selaku pembimbing. Penghargaan terbesar penulis sampaikan kepada almarhum ibu, ayah, dan seluruh keluarga atas segala doa, dukungan, dan kasih sayang yang telah diberikan. Selain itu, penulis sampaikan terima kasih kepada rekan-rekan seperjuangan di Laboratorium Bioindustri, Nadia, dan Sabroni atas bantuan dan dukungan selama penelitian dalam penyusunan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada seluruh staf dan laboran Departemen Teknologi Industri Pertanian yang telah banyak membantu dalam hal-hal administratif dalam pelaksanaan penelitian, serta rekan-rekan satu angkatan TIN 48 dan komunitas remaja islam (Liteecom) yang telah memberikan semangat, motivasi, dan nasehat hidup bagi penulis. Penulis berharap skripsi ini dapat bermanfaat dan memberi kontribusi dalam perkembangan ilmu pengetahuan, khususnya dibidang agroindustri di Indonesia. Bogor, Agustus 2016 Mara Anda Rival DAFTAR ISI DAFTAR TABEL vi DAFTAR GAMBAR vi DAFTAR LAMPIRAN vi PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Perumusan Masalah 2 Tujuan Penelitian 2 Hipotesis 2 Manfaat Penelitian 3 METODE 3 Lokasi dan Waktu Penelitian 3 Bahan 3 Alat 4 Tahapan Penelitian 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 6 Pengaruh Konsentrsi NADH Terhadap Tegangan Listrik MFC 6 Pengaruh Lama Kultivasi E. coli Terhadap Tegangan Listrik MFC 7 Pengaruh FDH dan Penambahan Format terhadap Tegangan Listrik MFC 8 SIMPULAN DAN SARAN 10 DAFAR PUSTAKA 10 LAMPIRAN 13 DAFTAR RIWAYAT HIDUP 17 DAFTAR TABEL 1 Hasil bobot sel kering, konsumsi glukosa, dan asam organik hasil kultivasi selama 24 jam 9 DAFTAR GAMBAR 1 Ilustrasi skematika produksi NADH oleh E. coli BW25113/pHfdh pada MFC 2 Ilustrasi skematika metabolisme sel E. coli BW25113/pHdfh 3 Profil waktu tgangan listrik yang dihasilkan MFC pada konsentrasi NADH anolit yang berbeda 4 Profil waktu tegangan listrik yang dihasilkan MFC pada larutan anolit kultur E. coli BW25113 dengan lama kultivasi yang berbeda 5 Tegangan listrik yang dihasilkan MFC pada larutan anolit kultur E. coli BW25113 dan BW25113/pHfdh dengan penambahan format selama 24 jam 2 3 6 7 8 DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7 Prosedur pembuatan larutan yang mengandung NADH Prosedur pengukuran tegangan listrik Prosedur transformasi plasmid jalur FDH Prosedur pembuatan stok gliserol, prakultivasi, dan kultivasi Prosedur analisis bobot sel kering Prosedur analisis glukosa sisa dengan metode DNS Prosedur analisis asam organik 13 13 13 14 14 14 15 PENDAHULUAN Latar Belakang Kebutuhan energi saat ini sangat tinggi, terutama penggunaan energi listrik pada aktivitas industri. Sumber energi listrik untuk aktivitas industri pada umumnya berasal dari PLN yang menggunakan batu bara sebagai sumber energi. Batu bara merupakan sumber energi yang tidak dapat diperbaharui dan menghasilkan emisi gas CO2 tinggi sehingga diperlukan teknologi sumber energi listrik alternatif yang dapat diperbaharui dan tidak berbahaya bagi lingkungan. Salah satu teknologi alternatif penghasil energi yang ramah lingkungan yakni sel bahan bakar mikroba (microbial fuel cell / disingkat MFC). MFC merupakan teknologi yang memanfaatkan mikroba sebagai katalis untuk mengubah komponen organik menjadi energi listrik (Logan et al. 2006; Du et al. 2007; Allen dan Beneto 1993). Aktivitas katalitik dan transfer proton dilakukan dengan menggunakan enzim atau tambahan mediator (Kordesch dan Simander 2001). Beberapa keuntungan teknologi MFC adalah dapat menggunakan limbah organik sebagai bahan dalam pembentukan energi yang dikatalis oleh mikroba, memiliki efisiensi konversi 90% dari sistem transportasi elektron, dan ramah lingkungan (Vishwanathan dan Sai 2009). Pada awal perkembangannya, rangkaian MFC dirancang dengan menggunakan dua kompartemen. Pada penelitian berikutnya ditemukan prinsip bahwa oksigen merupakan penerima elektron yang baik, sehingga MFC dirancang dengan satu kompartemen. Kelebihan dari penggunaan satu kompartemen ini yaitu biaya perakitan dan pemeliharaan lebih murah, serta listrik yang dihasilkan lebih tinggi (Hampannavar et al. 2011). Elektron yang dihasilkan pada MFC berasal dari reaksi oksidasi-reduksi Nicotinamide Adenine Dinucleotide Hydrogen (NADH) yang diproduksi didalam metabolisme mikoba. Pada mikroba pereduksi logam seperti Shewanella putrefaciens mampu melakukan oksidasi-reduksi NADH menjadi elektron di dalam metabolismenya (Kim et al. 1999). Namun, untuk bakteri non-pereduksi logam seperti Escherichia coli perlu mediator untuk melakukan reaksi oksidasi-reduksi. Mediator merupakan zat kimia yang digunakan untuk memindahkan elektron dari sel bakteri menuju elektroda. Biasanya mediator yang digunakan pada MFC yaitu pewarnaan bakteri, seperti neutral red dan metilen biru. Sejalan dengan perkembangan MFC, mikroorganisme yang digunakan bervariasi seperti B. subtilis, E. coli, dan Geobacterium sp. Pada dasarnya, E. coli bukan bakteri yang dapat menghasilkan energi listrik. Namun dengan berkembangnya teknik rekayasa metabolisme, E. coli memiliki potensi dijadikan sebagai sumber pembangkit energi listrik dengan merekayasa metabolisme di dalam selnya. Penggunaan E. coli memberikan keuntungan diantaranya spektrum substrat yang dapat dijadikan media sangat luas, dapat tumbuh dengan cepat pada kondisi aerobik, mudah untuk rekayasa, dan banyak tumbuh di lingkungan sekitar, sehingga E. coli dijadikan sumber mikroba dalam menghasilkan energi listrik pada MFC. V R Penerima elektron O2 Sumber karbon Sel Bakteri NAD+ NADH CO2 NADH Mediator Mediator 2H+ Energi Listrik NAD+ + H+ + 2e- Gambar 1 Ilustrasi skematika produksi NADH oleh E. coli BW25113 pada MFC Perumusan Masalah Keberhasilan MFC untuk menghasilkan energi listrik sangat ditentukan oleh produksi NADH dalam sel bakteri. Pada rangkaian MFC, NADH dioksidasi menjadi NAD+, ion hidrogen, dan elektron. Elektron tersebut mengalir melalui anoda menuju katoda. Aliran elektron tersebut akan menghasilkan tegangan listrik. NADH/NAD+ memiliki peranan utama dalam metabolisme mikroba, ketika sumber karbon seperti glukosa akan tereduksi dengan NAD + membentuk NADH. Hal ini sangat penting dalam pertumbuhan sel yang dapat mereduksi NADH menjadi NAD+ sehingga mencapai keseimbangan reaksi redoks (Susana et al. 2002). NADH dihasilkan pada metabolisme E. coli melalui jalur glikolisis dan siklus tricarboxylic acid (TCA). Dengan demikian, perlu strategi peningkatan NADH pada sel E. coli untuk meningkatkan produksi energi listrik. Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini adalah meningkatkan poduksi energi listrik dalam rangkaian MFC dengan meningkatkan produksi NADH didalam metabolisme sel E. coli melalui penyisipan jalur metabolisme FDH dan penambahan asam format pada kultur E. coli. Hipotesis Salah satu strategi untuk meningkatkan produksi NADH yaitu dengan menyisipkan jalur format dehidrogenase (FDH) ke dalam E. coli dengan penambahan asam format sebagai substrat. Hal ini dilakukan karena reaksi jalur metabolisme FDH dapat meregenerasi NADH dari NAD+ dengan mendekomposisi format menjadi CO2. Sejalan dengan peningkatan NADH, maka akan terjadi peningkatan tegangan listrik, seperti yang diperlihatkan pada Gambar 1. Glukosa NAD+ NAD+ NADH Format fdh CO2 NADH Piruvat NAD+ PDHc NADH Asetil-CoA NADH NAD+ Gambar 2 Asetat TCA Cycle Ilustrasi skematika metabolisme sel E. coli BW25113/pHfdh Manfaat Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi tentang strategi peningkatan energi listrik dengan peningkatan NADH melalui penyisipan jalur metabolisme FDH dan penambahan asam format pada kultur E. coli. METODE Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di laboratorium Bioindustri Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian dengan waktu pelaksanaan antara bulan Maret hingga Oktober 2015. Bahan Sel E. coli yang digunakan dalam penelitian ini adalah BW25113 berasal dari National Bio-Resource Project (NBRP) Jepang. Plasmid yang akan disisipkan ke dalam sel tersebut yaitu pHfdh yang berasal dari Universitas Osaka, Jepang. Bahan yang digunakan dalam transformasi antara lain antibiotik (kloramfenikol 34 mg/ml dan kanamisin 15 mg/ml), CaCl 2 0.05 M, dan 2×YT (pepton 10 g/l dan ekstrak khamir 5 g/l) serta air panas dan es batu. Bahan yang digunakan untuk prakultivasi yaitu media luria bertani (LB) dengan komposisi 5 g/l ekstrak khamir, 10 g/l pepton, dan 10 g/l. Media stok E. coli BW25113 dan E. coli BW25113/pHfdh. Bahan yang digunakan dalam kultivasi antara lain 40 g/l glukosa, 5 g/l ekstrak khamir, 10 g/l pepton, 10 g/l NaCl, dan 4 g/l sodium format. Bahan lain yang digunakan yakni kloramfenikol 34 mg/ml, dan CaCO3 20 g/l. Bahan yang digunakan untuk membuat jembatan garam yaitu agar bakto 10 g/l KCl 4 g/l. dan aquades. Sedangkan pengukuran listrik, kultur ditambahkan methylene blue (MB) sebanyak 100 µM. Alat Alat yang digunakan untuk transformasi antara lain clean bench, tabung reaksi, pipet mikro, spektrofotometer, sentifugator 10000 rpm 4 °C, eppendorf tube 1.5 ml, kotak pendingin, freezer, water bath, inkubator bergoyang 200 rpm 37 °C, timbangan analitik, otoklaf 121°C, cawan petri, erlenmeyer, bunsen, dan GeneJETTM plasmid miniprep kit. Alat yang digunakan untuk pembuatan stok gliserol yaitu eppendorf tube dan pipet mikro. Alat yang digunakan untuk kultivasi antara lain clean bench, erlenmeyer, gelas ukur, gelas piala, pH meter, neraca analitik, autoklaf 121 °C, inkubator bergoyang 120 rpm 37 °C, dan pipet mikro. Alat yang digunakan untuk kultivasi antara lain clean bench, spektrofotometer Hach DR 2500, baffled conical flask 250 ml, stopper, pipet mikro, dan inkubator bergoyang 200 rpm 37 °C. Alat yang digunakan pada MFC yaitu botol schooth durant 100 ml, rubber stopper, kabel tembaga, resistor 1000 Ω, grafit, pipa kaca, pembolong karet, capit buaya, magnetic strirrer, dan multimeter. Alat yang digunakan untuk analisa yaitu eppendorf tube, syringe filter 0.2 μm, sentrifugator 10000 rpm 4 °C, tabung ulir, spektrofotometer Hach DR 2500, pipet volumetrik 10 ml, pipet mikro, pH meter, spektrofotometer UV, vortex, HPLC, dan ZORBAX SB-Aq 883975-914 column. Tahapan Penelitian Tahapan penelitian ini meliputi penentuan pengaruh konsentrasi NADH dan penentuan pengaruh lama kultivasi E. coli terhadap tegangan listrik MFC. Selanjutnya dilanjutkan dengan penentuan pengaruh FDH dan penambahan format terhadap tegangan listrik MFC. a. Penentuan Pengaruh Konsentrasi NADH terhadap Tegangan Listrik MFC Langkah awal untuk menentukan pengaruh konsentrasi NADH pada rangkaian MFC yaitu penyiapan larutan yang mengandung NADH. Larutan tersebut dengan mengunakan kit glukosa (F-Kit 716251). Prosedur pembuatan konsentrasi NADH dijelaskan pada Lampiran 1. Larutan yang mengandung NADH dimasukkan ke dalam rangkaian MFC dan dilarutkan kembali dengan aquades hingga volume total mencapai 115 ml. Setelah rangkaian listrik dan sampel siap, magnetic stirrer dan multimeter disiapkan. Larutan MB sebanyak 5 ml dimasukkan ke dalam rangkaian. Pengukuran tegangan dilakukan selama 20 menit (Park dan Zeikus 2000). b. Penentuan Pengaruh Lama Kultivasi E. coli terhadap Tegangan Listrik MFC Tahap ini diawali dengan melakukan prakultivasi sel E. coli. Prakultivasi dilakukan untuk menyegarkan kembali sel E. coli yang akan dikultur agar sel dapat tumbuh dengan optimal saat kultivasi. Pertumbuhan sel diukur menggunakan spektrofotometer Hach DR 2500 dengan melihat nilai optical density (OD) pada panjang gelombang 660 nm. Prosedur prakultivasi dapat dilihat pada Lampiran 2. Kultivasi dilakukan secara aerob selama 0, 6, 12, 18, dan 24 jam pada kultur bergoyang 200 rpm dan suhu 37 oC. Dari masing-masing lama kultivasi tersebut dilakukan pengukuran listrik pada rangkaian MFC selama 20 menit. Prosedur kultivasi dan pengukuran tegangan listrik MFC dapat dilihat pada Lampiran 4. c. Penentuan Pengaruh FDH dan Penambahan Asam Format terhadap Tegangan Listrik MFC Tahap ini diawali dengan menyiapkan biakan. Penyiapan biakan pada penelitian ini terdiri dari transformasi plasmid jalur FDH dan pembuatan stok gliserol. Transformasi plasmid ini dilakukan untuk menyisipkan FDH ke dalam E. coli. Prosedur dapat dilihat pada Lampiran 3. Kemudian, pembuatan stok gliserol bertujuan untuk menyimpan sel E. coli hasil transformasi agar tidak perlu melakukan transformasi ulang untuk kultivasi berikutnya. Prosedur pembuatan stok gliserol dapat dilihat pada Lampiran. Prakultivasi dilakukan untuk menyegarkan kembali sel E. coli yang akan dikultur agar sel dapat tumbuh dengan optimal saat kultivasi. Pertumbuhan sel diukur menggunakan spektrofotometer Hach DR 2500 dengan melihat nilai optical density (OD) pada panjang gelombang 660 nm. Kultivasi dilakukan secara aerob selama 24 jam pada kultur bergoyang 200 rpm dan suhu 37 oC. Sel E. coli hasil prakultivasi diinokulasikan ke dalam media kultivasi yang mengandung format, IPTG, dan kloramfenikol. Setelah sel dikultivasi, maka dilakukan pengukuran listrik pada rangkaian MFC selama 20 menit. Prosedur kultivasi dapat dilihat pada Lampiran 4. Analisis Analisis pada penelitian ini meliputi bobot sel kering, glukosa sisa, dan asam organik (asetat, piruvat, dan format). Pengambilan sampel untuk analisis dilakukan pada jam ke-24 setelah kultivasi. Sebanyak 1.5 ml sampel untuk masing-masing analisis disimpan dalam eppendorf tube 1.5 ml. Sampel untuk analisis glukosa sisa dan asam organik disentrifugasi terlebih dahulu untuk memisahkan supernatan dan pelet, kemudian supernatan disaring dengan syringe filter 0.2 μm. Analisis bobot sel kering dilakukan untuk mengetahui pertumbuhan sel yang diukur menggunakan spektrofotometer Hach DR 2500 dengan mengukur optical density (OD) pada panjang gelombang 660 nm. Nilai yang terukur dikonversi dengan cara mengalikannya dengan 0.36 yang merepresentasikan bobot sel kering (Ojima et al. 2012). Prosedur analisis bobot sel kering dapat dilihat pada Lampiran 5. Pengukuran glukosa sisa dilakukan untuk mengetahui jumlah glukosa yang dikonsumsi E. coli. Sampel yang telah siap dicampur dengan larutan DNS dengan perbandingan 1:3. Kemudian dipanaskan pada air mendidih selama 5 menit. Lalu sampel didinginkan, dan diukur OD nya menggunakan spektrofotometer Hach DR 2500. Nilai OD yang diperoleh kemudian dikonversi menjadi bobot glukosa berdasarkan kurva standar (Lampiran 6). Kemudian, analisis asam organik (asetat, piruvat, dan format) menggunakan alat HPLC dengan kolom ZORBAX SB-Aq 883975-914. Prosedur analisis asam organik (asetat, piruvat, dan format) dapat dilihat pada Lampiran 7. HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh Konsentrasi NADH terhadap Tegangan Listrik MFC Tegangan listrik dihasilkan dari elektron yang diproduksi dari larutan anolit dalam rangkaian MFC. Elektron diperoleh melalui reaksi oksidasi-reduksi antara NADH dengan mediator. Hal tersebut telah dilaporkan oleh peneliti sebelumnya oleh Park dan Zeikus (2000) yang menyatakan bahwa penambahan mediator neutral red dapat menghasilkan elektron. Oleh karena itu dilakukan penelitian pengujian MFC dengan menggunakan variasi konsentrasi NADH terhadap tegangan listrik yang dihasilkan (Gambar 2). Peningkatan konsentrasi NADH dari 1 g/l menjadi 2 g/l mengakibatkan peningkatan tegangan listrik yang dihasilkan sebesar + 20 kali menjadi 13.3 mV. Hasil tersebut menunjukan bahwa peningkatan konsentrasi NADH sejalan dengan peningkatan tegangan listrik yang dihasilkan. Hal tersebut sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Park dan Zeikus (2000) yaitu semakin tinggi konsentrasi NADH maka tegangan listrik yang dihasilkan akan semakin tinggi. Fenomena penelitian ini menunjukan bahwa MFC yang digunakan mampu untuk mengonversi NADH menjadi tegangan listrik serta dapat menghasilkan tegangan listrik sesuai dengan tingkat konsentrasi NADH yang berbeda. 14 NADH 1 (g/l) 12 Tegangan (mV) NADH 2 (g/l) 10 8 6 4 2 0 0 4 8 12 Waktu (Menit) 16 20 Gambar 3 Profil waktu tegangan listrik yang dihasilkan MFC pada konsentrasi NADH anolit yang berbeda Pengaruh Lama Kultivasi E. coli terhadap Tegangan Listrik MFC Pengujian selanjutnya, untuk mengetahui peranan sel E. coli BW25113 dalam menghasilkan tegangan listrik, dilakukan analisa pengaruh lama kultivasi E. coli BW25113 sebagai anolit terhadap profil tegangan listrik yang dihasilkan (Gambar 3). MFC yang menggunakan media tanpa sel E. coli (media pada saat t = 0 jam) menghasilkan nilai tegangan listrik yang sama dari menit pertama hingga menit ke-20 dengan nilai 0 mV. Hal tersebut mengindikasikan bahwa sistem MFC ini tidak menghasilkan tegangan listrik sama sekali. Sementara itu, pada media yang telah diinokulasi sel E. coli dan dikultivasi selama 6 jam menghasilkan kurva yang memiliki puncak sebesar 0.1 mV. Kedua fenomena ini memperlihatkan bahwa pertumbuhan sel E. coli mampu menghasilkan tegangan listrik. Gambar 4 menunjukan adanya peningkatan tegangan listrik dari kultivasi selama 6 hingga 12 jam. Hal ini sejalan dengan peningkatan jumlah sel yang tinggi selama fase logaritmik. Sel E. coli mengalami fase logaritmik dari lama kultivasi 3-12 jam. Pada fase ini NADH banyak dihasilkan pada jalur glikolisis dan siklus TCA mengingat pada fase tersebut terjadi laju konsumsi glukosa dan pertumbuhan yang tinggi (Suryadama et al. 2012). Sementara itu, pada kultivasi 12 hingga 24 jam mengalami peningkatan tegangan listrik. Pada fase ini sel mengalami fase stasioner, ketika pertumbuhan sel tidak berbeda secara signifikan, tegangan listrik yang dihasilkan pada anolit dengan lama kultivasi 24 jam lebih tinggi. Hal ini menunjukan selain jumlah sel, metabolisme didalam sel ikut berperan dalam memproduksi NADH. Hal ini sejalan dengan teori dari Suryadarma et al. (2012) yang mengatakan bahwa kurva pertumbuhan E. coli BW25113 dari jam ke-12 hingga jam ke-24 mengalami fase stasioner. Dimana hasil metabolit lebih dominan daripada pertumbuhan sel. Hal ini mengindikasikan bahwa NADH yang terbentuk dapat dioptimalkan untuk menghasilkan tegangan listrik pada lama kultivasi selama 24 jam. 2,8 Media tanpa sel (kontrol) 6 Jam 12 Jam 18 Jam 24 Jam Tegangan (mV) 2,4 2 1,6 1,2 0,8 0,4 0 0 4 8 12 Waktu (Menit) 16 20 Gambar 4 Profil waktu tegangan listrik yang dihasilkan MFC pada larutan anolit kultur E. coli BW25113 dengan lama kultivasi yang berbeda Pengaruh FDH dan Penambahan Asam Format terhadap Tegangan Listrik MFC Salah satu strategi peningkatan akumulasi NADH pada larutan anolit hasil kultivasi adalah dengan menyisipkan jalur metabolisme FDH ke dalam sel E. coli dan penambahan asam format pada media kultivasi. Format akan didekomposisi menjadi CO2 oleh FDH sehingga meregenerasi NAD+ menjadi NADH (Ojima et al. 2012). Penambahan asam format sebanyak 4 g/l pada E. coli yang telah disisipi oleh FDH mampu meningkatkan NADH yang tinggi. Hal ini telah dikonfirmasi oleh Ojima et al. (2012) bahwa penambahan asam format 4 g/l mampu meningkatkan produksi piruvat dengan meningkatnya NADH. Gambar 5 memperlihatkan pengaruh penambahan asam format pada media kultivasi E. coli dan pengaruh asam format pada jalur FDH dalam E. coli terhadap tegangan listrik yang dihasilkan. Peningkatan produksi tegangan listrik yang signifikan terjadi pada E. coli BW25113 dengan penambahan asam format dan penyisipkan jalur metabolisme FDH yang disertai penambahan asam format sebagai substrat. Hal ini mengindikasikan asam format berkontribusi dalam peningkatan tegangan listrik. Pada E. coli BW25113/pHfdh, FDH berperan aktif dalam mendekomposisi asam format menjadi NADH sehingga produksi NADH tinggi. Tingginya produksi NADH pada sel akan meningkatkan tegangan listrik yang dihasilkan. Selain itu, untuk mengklarifikasi adanya pengaruh asam format terhadap peningkatan tegangan listrik, dilakukan analisis bobot sel kering, konsumsi glukosa, dan asam organik (Tabel 1). 30 * : Signifikan pada pada taraf < 0,05 25 * Tegangan (mV) * * 20 15 10 5 0 BW25113 BW25113/pHfdh & BW25113 & penambahan asam penambahan asam format 4 g/l format 4 g/l Gambar 5 Tegangan listrik yang dihasilkan MFC pada larutan anolit kultur E. coli BW25113 dan BW25113/pHfdh dengan penambahan asam format yang dikultivasi selama 24 jam Tabel 1 Bobot sel kering, konsumsi glukosa, dan asam organik hasil kultivasi selama 24 jam Penambah Bobot Konsumsi Asam an asam sel Piruvat Asetat Sel glukosa format format t=0 kering (g l-1) (g l-1) (g l-1) sisa (g l-1) -1 -1 jam (g l ) (g l ) 1.9212 16.7646+ 15.533 BW25113 0 1.9559 0 +0.10 0.27 8 BW25113 2.2602 13.9755+ 4 0.8312 6.8164 3.2871 /pHfdh +0.15 0.15 1.3326 21.0776+ BW25113 4 1.0098 4.2071 3.5640 +0.06 0.72 Bobot sel kering dan konsumsi glukosa pada E. coli BW25113/pHfdh dengan penambahan asam format tidak menyebabkan perubahan secara signifikan. Hal ini memperlihatkan bahwa penambahan asam format tidak secara signifikan mengubah metabolisme sel E. coli. Peningkatan NADH tidak terjadi akibat peningkatan jumlah sel, namun peningkatan tersebut diakibatkan oleh jalur metabolisme FDH yang mendekomposisi format menjadi CO2, sehingga dapat meregenerasi NAD+ menjadi NADH. Konsumsi glukosa pada E. coli BW25113/pHfdh lebih sedikit daripada E. coli BW25113 tanpa penambahan asam format. Tingginya bobot sel kering pada E. coli BW25113/pHfdh dikarenakan glukosa lebih banyak digunakan untuk pertumbuhan sel dan mendapatkan suplai substrat tambahan berupa format. Dilain pihak, konsumsi glukosa pada E. coli BW25113 lebih banyak digunakan untuk produk lain, sehingga untuk mengonfirmasi hal tersebut perlu dilakukan analisis asam organik yaitu piruvat dan asetat. Asam piruvat dan asetat merupakan hasil metabolisme pada jalur glikolisis (Vemuri et al. 2006). Penyisipan jalur metabolisme FDH dan penambahan asam format pada induk sel E. coli menyebabkan penurunan produksi asam piruvat dan asetat. Hal ini menunjukan adanya peningkatan konversi piruvat, selain menuju asetat. Produksi tegangan listrik pada MFC dari anolit kultur E. coli BW25113 dengan penambahan asam format mengalami kenaikan secara signifikan, yakni hampir 2 kali lipat dari kultur E. coli BW25113. Hal ini menunjukan bahwa asam format berkontribusi dalam peningkatan tegangan listrik. Untuk mengonfirmasi hal tersebut dilakukan analisa melalui bobot sel kering, konsumsi glukosa, dan asam organik (asam piruvat dan asetat). Penambahan asam format pada induk sel E. coli menghasilkan bobot sel kering yang lebih rendah daripada E. coli BW25113 tanpa penambahan asam format, namun tegangan listrik yang dihasilkan lebih tinggi. Hal tersebut dikarenakan format berkontribusi dalam peningkatan tegangan listrik. Menurut Suryadarma et al. (2012), penambahan asam format 6 g/l pada jam ke-12 menurunkan bobot sel kering, sehingga kelebihan format tidak dapat didekomposisi oleh E. coli rekombinan. Hal ini mengonfirmasi terjadinya penurunan bobot sel kering pada induk sel E. coli. Dengan demikian, asam format dapat menjadi racun bagi sel, sehingga bobot sel kering pada induk sel E. coli yang ditambahkan asam format lebih rendah daripada yang tidak ditambahkan asam format. Tingginya konsumsi glukosa pada induk sel E. coli yang ditambahkan asam format menunjukan adanya peningkatan aktivitas sel pada jalur glikolisis. Glukosa yang dikonsumsi kemudian dikonversi menjadi piruvat dan dikonversi lebih lanjut ke jalur produksi asetat (Vemuri et al. 2006). Terbentuknya piruvat dan asetat mempengaruhi aliran karbon pada siklus TCA. Pembentukan asetat terjadi ketika karbon yang mengalir ke siklus TCA melebihi kapasitas sehingga aliran karbon akan beralih pada jalur lain (Chang et al. 1999). Pada kondisi aerob, sel menggunakan NADH untuk aktifitas respirasi. Aktifitas tersebut mengoksidasi NADH menjadi NAD+ yang kemudian akan digunakan untuk meningkatkan glikolisis dan aktivitas siklus TCA. Meningkatnya konsumsi glukosa akan menghasilkan NADH yang tinggi pula. Sementara itu, peningkatan aktifitas siklus TCA juga akan menghasilkan NADH. Dengan demikian, akan terjadi akumulasi NADH. Meski demikian, akumulasi NADH tersebut dapat menjadi hambatan bagi enzim sintase untuk aktifitas siklus TCA. Hal ini mengakibatkan sedikitnya aliran karbon menuju siklus TCA sehingga terjadi pembentukkan asam asetat. Dengan demikian, kondisi aerobik berpengaruh terhadap pembentukkan asam asetat. Meski ada kemungkinan lain konsumsi glukosa mengarah pada produk samping lain, tidak hanya asetat, dalam penelitian ini tidak membahas kemungkinan lain lebih lanjut. Pembentukan piruvat dan asetat yang tinggi pada BW25113 menjadi salah satu indikator rendahnya tegangan listrik. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Penyisipan jalur metabolisme FDH pada sel E. coli dengan penambahan asam format sebagai substrat memberikan pengaruh terhadap kenaikan energi listrik pada rangkaian MFC dengan mendekomposisi format menjadi CO 2, sehingga dapat meregenerasi NAD+ menjadi NADH . Selain itu, penambahan asam format pada induk sel E. coli dapat meningkatkan tegangan listrik pada rangkaian MFC. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terkait rangkaian MFC yang dapat secara langsung mengukur tegangan listrik pada anolit. Selain itu, perlu juga dilakukan pengujian grafit yang secara efektif untuk menghantarkan elektron pada rangkaian MFC. DAFTAR PUSTAKA Allen RM, Bennetto HP. 1993. Microbial fuel cells: electricity production from carbohydrates. J Appl Biochem Biotechnol. 39:27-40. Chang DE, Shin S, Rhee JS, dan Pan JG. 2009. Acetate metabolism in a pta mutant of Escherichia coli W3110: improve of maintaining acetyl-CoA flux for the growth and survival. J Bacteriol. 181:6656-6663. Du, Zhuwei, H. Li, and T. Gu. 2007. A state of the art review on microbial fuel cell: a promising technology for wastewater treatment and bioenergy. J Biotechnol Advanc. 25:464-482. Hampannavar US, Anupama, dan Pradeep NV. 2011. Treatment of distellery wastewater using single chamber and double chamber MFC. J Env Sci. 2(1):113-123. Kim, H. Joo, M. Sik Hyun, I. Sheop Chang, dan B. Hong Kim. 1999. A microbial fuel cell type lactate biosensor using a metal-reducing bacterium, Shewanella putrefaciens. J Biotechnol. 9(3):365-367. Kordesch K, Simnder G. 2001. Fuel cell and their application. VCH. New York. Logan BE, Hamelers B, Rozendal R, Schroder U, Keller J, Verstraete W, dan Rabael K. 2006. Microbial fuel cells: methodology and technology. Env sci technol. 40(17):5181-5182. Muralidharan A, Babu OA, Nirmalraman K, Ramya M. 2011. Impact of salt concentration on electricity production in microbial hydrogen based salt bridge fuel cell. Indn J Fund Appl Life Sci. 1:178-184. Ojima Y, Suryadarma P, Tsuchida K, dan Taya M. 2012. Accumulation of pyruvate by changing the redox status in Escherichia coli. Biotechnol Lett. 34:889-893. Panja S, Saha S, Jana B, dan Basu T. 2006. Role of membrane potential on artificial transformation of E. coli with plasmid DNA. Biotechnol. 127:1420. Park DH, Zeikus JG. 2000. Electricity generation in microbial fuel cells using neutral red as an electronophore. Appl Env Microbiol. 66(4):1292-1297. Suryadarma P, Ojima Y, Fukuda Y, Akamatsu N, dan Taya M. 2012. Design of Escherichia coli cell culture for regulating alanine production under aerobic conditions. J Chem Eng Jpn. 6(2):152-157. Susana J, Riveria B, Bennett GN, San KY. 2002. Metabolic engineering of Escherichia coli: increasing of NADH availability by overexpressingan NAD+ dependent formate dehydrogenase. Metab Eng. 4:217-229. Taskan E, B. Ozkaya, H. Hasar. 2014. Effect of different mediator concentrations on power generation in MFC using Ti-TiO2 electrode. J Energy Sci. 4(1):911. Vemuri GN, E Altman, DP Sangurdekar, AB Khodursky, dan MA Eiteman. 2006. Overflow metabolism in Escherichia coli during steady state growth: Transcriptional regulation and effect of the redox ratio. Appl Environ Microbiol. 72:3653-3661. Vishwanathan dan Sai SSS. 2009. Microbial fuel cell: principles and applications. [Internet]. (diunduh 2016 Feb 10). Tersedia pada: http://www.altenergymag.com/content.php?post_type=1424. Yan M. 2008. Preliminary Study on E. coli microbial fuel cell and on-electrode taming of biocatalyst. Chn J Proc Eng. 6(8):1179-1184. LAMPIRAN Lampiran 1 pembuatan larutan yang mengandung NADH (Cat. No. 10716 251 035) Pembuatan larutan yang mengandung NADH dibuat dari glucose kit. Larutan glukosa disiapkan dalam tabung ulir dengan konsentrasi 0.5 g dan 1 g per liter aquades. Masing-masing larutan glukosa diambil sebanyak 0.1 ml dan direaksikan dengan 1 ml larutan ke-1 dalam kit dan 1.9 ml aquabides lalu ditunggu 3 menit. Larutan tersebut kemudian direaksikan dengan 0.02 ml suspensi ke-2 dalam kit dan ditunggu selama 15 menit. Lampiran 2 pengukuran tegangan listrik Tahapan ini diawali dengan perakitan rangkaian MFC dengan satu dengan menggunakan satu botol schoot duran 100 ml. Mulut botol ditutup dengan rubber stopper yang telah dilubangi untuk pipa jembatan garam dan anoda. Jembatan garam dibuat dari agar bakto 10% dan garam KCl 4% dengan pipa kaca yang berdiameter 12 mm dan panjang 50 mm. Katoda dibenamkan pada jembatan garam sepanjang setengah dari panjang katoda (Muralidharan et a. 2011). Anoda dan katoda terbuat dari grafit berbentuk silinder. Kabel tembaga digunakan untuk menghubungkan sirkuit dan dipasang dengan capit buaya. Sebelum digunakan, MFC diotoklaf pada 121oC selama 20 menit. Pada botol diisi sebanyak 120 ml hasil kultivasi dan ditambahkan dengan methylenen blue (MB) sebanyak 100 µM. MFC dihubungkan dengan resistor 1000 Ω dan multimeter serta dioperasikan pada ruangan dengan suhu 37 oC dengan pengadukan menggunakan magnetic stirrer dengan kecepatan 400 rpm. Pengukuran tegangan dilakukan selama 20 menit. Lampiran 3 transformasi plasmid jalur FDH (Panja et al. 2006) Sel E. coli BW25113 dikultur terlebih dahulu dalam 2 ml media LB yang mengandung 15 mg/ml kanamisin, diinkubasi pada suhu 37°C dengan kecepatan 120 rpm selama semalam. Sebanyak 0.5 ml kultur sel E. coli disubkultur hingga OD600 mencapai 0.4–0.5. Kemudian 1.5 ml kultur sel E. coli diinkubasi dalam es selama 10 menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu 4°C selama 2 menit. Supernatan yang dihasilkan kemudian dibuang sedangkan pelet diresuspensi dengan 100 μl buffer transformasi (0.05 Mm CaCl 2) yang mengandung 15% gliserol dan diinkubasi pada suhu 4°C selama 10 menit. Setelah langkah tersebut, sell disebut sel kompeten. Sel kompeten yang dihasilkan kemudian digunakan untuk transformasi. Setiap transformasi membutuhkan 100 μl sel kompeten. Tahapan selanjutnya adalah transformasi plasmid yang dimaksud melalui sebanyak 10 μl plasmid pHfdh ditambahkan ke dalam 100 μl sel kompeten, diinkubasi pada suhu 4°C selama 30 menit. Kemudian dipanaskan pada suhu 42°C selama 45 detik. Kemudian diinkubasi pada suhu 4°C selama 5 menit. Setelah diinkubasi, sel kompeten tersebut ditambahkan dengan 100 μl media 2Xyt lalu diinkubasi pada suhu 37°C dengan kecepatan 250 rpm selama 30-60 menit. Sel E. coli yang telah disisipi plasmid pHfdh kemudian disebar ke dalam media LB agar/padat yang mengandung 34 mg/ml kloramfenikol dan 15 mg/ml kanamisin dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 12 jam. Selanjutnya akan dilakukan analisis plasmid dengan menggunakan GeneJETTM plasmid miniprep kit. Lampiran 4 pembuatan stok gliserol, prakultivasi, dan kultivasi (Ojima et al. 2012) Sebanyak 300 μl gliserol 50% dan 700 μl sel E. coli hasil prakultivasi dimasukkan ke dalam eppendorf tube. Kemudian diresuspensi agar homogen. Selanjutnya disimpan dalam freezer. Sebanyak 50 ml LB dimasukkan ke dalam erlenmeyer kemudian ditambahkan antibiotik (kloramfenikol dan kanamisin), dan sel E. coli BW25113/pHfdh masing-masing 50 μl. Selanjutnya, diinkubasi di dalam incubator shaker dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 37 °C selama 12 jam. Setelah diinkubasi, nilai OD660 diukur hingga 1–1.5. Sebanyak 5 ml sel dimasukkan ke dalam kuvet kemudian diukur nilai OD660 dengan spektrofotometer. Jika nilai OD660 di atas 1.5 maka dilakukan pengenceran dengan media LB. Namun, jika nilai OD660 di bawah 1 maka proses inkubasi dilanjukan kembali hingga nilainya antara 1–1.5. Sebanyak 2.5 ml sel E. coli BW25113/pHfdh yang telah mencapai nilai OD660 1–1.5 dimasukkan ke dalam tiga baffled conical flask, setiap baffled conical flask mengandung 40 ml media LB, l0 ml glukosa 40 g/l, 50 μl kloramfenicol, 34 mg/l, 50 μl kanamisin 15 mg/l, 1 ml format 4 g/l, dan 1 g CaCO3 20 g/l. Nilai Ph media diatur hingga 7 dengan penambahan NaOH 1 M. Selanjutnya, diinkubasi di dalam incubator shaker dengan kecepatan 250 rpm pada suhu 37 °C selama 24 jam. Asam format yang digunakan harus disterilisasi terlebih dahulu dengan menggunakan syringe filter 0.2 μm. Sedangkan untuk CaCO3 disterilisasi dengan oven pada suhu 180 °C selama 2 jam. Lampiran 5 prosedur analisis bobot sel kering (Ojima et al. 2012) Sebanyak 4.5 ml HCl 1 M dimasukkan ke dalam tabung reaksi ulir kemudian dicampur dengan 0.5 ml sampel dan diresuspensi. Kemudian diukur nilai OD pada absorbansi (λ) 660 nm dengan spektrofotometer Hach DR 2500. Bobot sel kering (g/l) = 0.36 x OD660. Lampiran 6 prosedur analisis glukosa sisa dengan metode DNS Sampel yang telah siap dicampur dengan larutan DNS dengan perbandingan 1:3. Kemudian dipanaskan di air mendidih selama 5 menit. Lalu sampel didinginkan, dan diukur OD nya menggunakan spektrofotometer Hach DR 2500. Nilai OD yang diperoleh kemudian dikonversi menjadi bobot glukosa berdasarkan kurva standar yang telah dibuat. 1,6 y = 0,0048x - 0,2766 R² = 0,9999 1,4 Nilai OD 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 100 200 Glukosa (ppm) 300 400 Kurva standar glukosa Lampiran 7 prosedur analisis asam organik Pengukuran asam organik asetat, piruvat, dan format dilakukan dengan menggunakan HPLC dengan kolom ZORBAX SB-Aq 883975-914. Fase bergerak yang digunakan adalah 99% NaH2PO4 20 Mm, Ph2, 1% ACN. Suhu, laju alir, dan panjang gelombang yang digunakan, berturut-turut yakni 35ºC, 1 ml/menit, dan 210 nm, dengan volume sampel yang diinjek sebanyak 20 μl. 1600 y = 2966,1x - 21,006 R² = 0,9998 1400 Luas Area 1200 1000 800 600 400 200 0 0 0,2 0,4 Piruvat (g l-1) 0,6 Kurva standar asam piruvat 300 y = 531,62x + 1,4644 R² = 0,999 Luas Area 250 200 150 100 50 0 0 0,2 0,4 0,6 Asetat (g l-1) Kurva standar asam asetat 600 y = 993,87x - 2,5947 R² = 0,9993 Luas Area 500 400 300 200 100 0 0 0,2 0,4 -1 Format (g l ) Kurva standar asam asetat 0,6 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Tangerang pada tanggal 1 Februari 1994 dari ayah Ahmad Basyar dan ibu Nanih (alm). Penulis adalah putra pertama dari lima bersaudara. Tahun 2011 penulis lulus dari SMA Negeri 5 Jakarta dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN) Undangan dan diterima di Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif diberbagai organisasi yaitu sebagai bendahara IPB Farmer’s Student Club (I’FAST CLUB) selama dua periode (tahun 2012-2013) dan badan pengawas selama satu periode (tahun 2014), anggota departemen syiar islam Lembaga Dakwah Kampus (LDK) Alhurriyyah selama dua periode (tahun 2012-2013), anggota departemen syiar islam Lembaga Dakwah Fakultas (LDF) Fakultas Teknologi Pertanian (FATETA) selama dua periode (tahun 2013-2014), dan ketua Rohani Islam (Rohis) kelas selama 8 semester (tahun 2011-2015). Bulan Juli-Agustus 2014 penulis melaksanakan Praktik Lapangan di PT Rajawali Nusantara 1 Indonesia Unit PG Krebet Baru II Malang dengan judul Teknologi Proses dan Pengawasan Mutu Produksi Gula di PT Rajawali Nusantara 1 Indonesia Unit PG Krebet Baru II Malang. Semasa mengikuti perkuliahan, penulis pernah memperoleh berbagai prestasi, diantaranya memperoleh hibah dana DIKTI (Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi) tahun 2014 untuk kegiatan Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) Penelitian dan juara 1 lomba menulis esai Himalogin (Himpunan Mahasiswa Tekonologi Industri) IPB 2014. Selain itu, penulis juga menerima beasiswa Bidikmisi.