90 RESPON EKSPRESI MOLEKUL ADHESI PADA

RESPON EKSPRESI MOLEKUL ADHESI PADA PERMUKAAN SEL
ENDOTEL OLEH KURKUMINOID EKSTRAK TEMU MANGGA
(Response of Adhesion Molecule Expression on Surface of Endothelial Cells by
Curcuminoid of Temu Mango Extract)
Abstrak
Molekul adhesi seperti Vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1) dan
Interceluler adhesion molecule-1(ICAM-1), adalah protein yang diekspresikan ke
permukaan sel endotel apabila fungsi endotel terganggu. Molekul adhesi
merupakan tanda-tanda awal terjadinya atesosklerosis yang dapat disebabkan oleh
meningkatnya konsentrasi kolesterol yang beredar di pembuluh darah. Penelitian
bertujuan mengkaji potensi kurkuminoid ekstrak dalam menghambat ekspresi
molekul adhesi coronary pulmonary arterial endothelial (CPAE) in vitro. Dalam
percobaan, sel endotel dipra-inkubasi dengan kurkuminoid ekstrak selama 48 jam.
Kultur sel endotel diinkubasikan kembali dengan LDL dan dioksidasi dengan
CuSO4 selama 24 jam. Molekul VCAM-1 dan ICAM-1 diamati secara
imunohistokimia yang direaksikan dengan antibodi anti VCAM-1 atau antibodi
anti ICAM-1 lalu divisualisasikan dengan3,3-diaminobenzidin tetrahydro chloride
(DAB). Hasil penelitian menunjukkan VCAM-1 tidak terekpresikan. Sedangkan
ICAM-1 terekspresi ke permukaan, berwarna kuning kecoklatan setelah
divisualisasikan dengan DAB. Kurkuminoid ektrak 8 ppm mampu menurunkan
respon ekspresi molekul ICAM-1. Partikel LDL teroksidasi dapat menginduksi
ekspresi ICAM-1 disamping terbentuk juga sel-sel busa.
Abstract
The adhesion molecule such as vascular cell adhesion molecules-1 (VCAM1) and Interceluler adhesion molecule-1 (ICAM-1), is a protein that is expressed
to the cell surface when disturbed endothelial function. The adhesion molecules is
early signs of atherosclerosis which can be caused by the increase of cholesterol
circulating in blood vessels. The study aims to assess the potential of the
curcuminoids extract in inhibiting the expression of adhesion molecules on cells
pulmonary arterial endothelial (CPAE) in vitro. In the reseach, endothelial cells
pre-incubated with curcuminoids of temu mangga extracts for 48 hours, then
washed with PBS. The cell culture pre-incubated with LDL that has been oxidized
with CuSO4 for 24 hours. The VCAM-1 and ICAM-1 were observed stained by
immunohistochemistry and reacted with anti VCAM-1 antibody or anti ICAM-1
antibody so visualized with 3.3 diamino benzidine tetrahydro-chloride (DAB).
The results showed that VCAM-1 did not expression to endothelial surface
cells but ICAM-1 expression vizualized by DAB is brown yellow. The
curcuminoids of temu mangga extract eight ppm reduces induction of ICAM-1
response. Induction of ICAM-1 expression by oxidized LDL caused ICAM-1
expressed addition foam cells accumulation.
Key words: Endothelial cells, VCAM-1, ICAM-1, LDL, curcuminoids
90
PENDAHULUAN
Interaksi antara sel-sel dan matrik ekstraseluler sel memegang peranan
penting dalam bermigrasinya sel dan teraktivasinya sel darah putih selama
peradangan. Ekspresi molekul adhesi pada sel endotel dan jaringan ekstra vaskular
merupakan tanda awal terjadinya patogenesis aterosklerosis. Dalam proses
radang, sel akan mengeluarkan sitokina kepermukaan vaskular sehingga akan
menstimuli pembentukan molekul adhesi, protease dan mediator lainnya yang
terlarut dan dapat masuk ke sirkulasi darah (Packard & Libby, 2008; Hansson
2009). Peradangan pada arteria merupakan suatu respon nonspesifik yang dapat
disebabkan oleh virus, toksin, kompleks imun, produk-produk yang dilepaskan
oleh sel darah putih maupun platelet yang teraktivasi serta stress fisik yang tidak
lazim. Selain itu, dapat juga disebabkan oleh peningkatan konsentrasi lipoprotein
dalam darah. Keadaan ini akan meningkatan permeabilitas endotel yang memicu
terjadinya peradangan.
Menurut Hansson (2009), peradangan berperan penting di dalam penyakit
patogenesis aterosklerosis. Sel imun mendominasi lesi awal aterosklerosis,
dimana pengaruh molekul ini mempercepat perkembangan lesi. Libby (2002);
Packard & Libby, (2008) menyatakan, bahwa proses peradangan pada arteri dapat
dipicu oleh meningkatnya produksi sitokina. Sitokina primer akan menginduksi
dan meghasilkan messenger sitokina IL-6 untuk merangsang hati memproduksi C
reaktive protein (CRP) pada fase akut. Platelet dan jaringan adiposa dapat
menghasilkan mediator peradangan yang sama dengan aterotrombosis sehingga
terjadi aterosklerosis.
Darah pada radang, sisa pembuluh darah, sel otot polos, dan konstituen sel
imun merupakan bagian penting dari ateroma. Ateroma di awali dengan
pembentukan garit lemak dan merupakan kumpulan lipid dibawa oleh endotel.
Pada umumnya garit lemak berisi makrofag bersama-sama sel T (Hansson, 2005).
Pusat ateroma berisi sel busa, droplet lipid ekstraseluler membentuk bagian dari
inti dikelilingi oleh sel-sel otot polos yang kaya matrik kolagen. Sel-sel T,
makrofag dan mast sel berinfiltrasi ke lesi untuk berkembangnya ateroma, sel-sel
imun yang teraktivasi akan memproduksi sitokina radang (Hansson, 2005;
91
Hansson 2009). Sel busa merupakan metabolit aktif yang dapat mensekresikan
berbagai sitokina dan mediator radang, yang pada akhirnya akan merekrut sel otot
polos untuk berproliferasi (Crowther 2005).
Makrofag yang bergabung dengan limfosit sel T pada intima pembuluh
darah, dapat beradaptasi langsung dan mensekresikan kemokina; sitokina
proinflamasi seperti IL-1, IL-6 dan TNF-α; oksigen reaktif dan spesies nitrogen:
penyebab LDL teroksidasi dan kerusakan sel; ekspresi faktor jaringan
(trombogenositas); menangkap LDL teroksidasi (pembentuk sel busa); dan
mensekresikan protease untuk degradasi sel otot (Robetson & Hansson 2006).
Molekul TNF-α secara biologis mengaktivitasi gen dari sel-sel endotel dalam
mengatur berinteraksinya sel endotel dengan leukosit, seperti VCAM-1, ICAM-1,
P-selektin, faktor jaringan, sitokina radang dan kemokina (Inoue et al. 2006).
Secara normal, sel endotel resisten terhadap adhesi leukosit. Rangsangan
awal pada peradangan, seperti diet tinggi asam lemak jenuh, hiperkolsterolemia,
obesitas, resisten insulin, hipertensi dan merokok akan menstimuli molekul adhesi
seperti P-selektin, VCAM-1 dan ICAM-1 sehingga monosit dan limfosit yang ada
pada peredaran darah dapat menempel pada permukaan endotel (Packard &
Libby, 2008). Molekul VCAM-1dan ICAM-1 merupakan suatu bentuk protein
yang muncul pada permukaan endotel apabila terjadi rangsangan. Monosit yang
melekat pada permukaan sel endotel, berpenetrasi ke intima menjadi makrofag
lalu mengekspresikan macrophage colony stimulating factor (M-CSP). Molekul
M-CSP berfungsi merangsang terjadinya radang. mengekspresikan reseptor
skavenger yang dapat mengenali LDL termodifikasi sehingga membentuk sel
busa. Dalam waktu bersamaan, proliferasi makrofag memperkuat respon radang
dengan mensekresikan sejumlah faktor pertumbuhan dan sitokina, termasuk faktor
tumor nekrosis-ά (TNF-α) dan IL-1β (Hansson 2009; Linton & Fazio, 2003).
Sel imun sel T yang dapat menyesuaikan diri pada lesi aterosklerosis,
berperan penting dalam pengaturan aterogenesis, termasuk lesi dalam merespon
monokin yang diinduksi oleh interferon-γ (IFN-γ) dan IFN. Sub tipe CD4+, akan
mengenali antigen yang dibawa oleh Major histocompatibility complex clas II
(MHC-II) yang merupakan prediposisi terjadinya lesi. Lesi yang berisi CD4+ sel T
sebagai antigen reaktif dalam mengikat LDL teroksidasi yang telah di klon dari
92
lesi manusia. Pengaktifan CD8+ sel T pada mencit yang apoE dikeluarkan dapat
menyebabkan kematian dinding arteri dan mempercepat aterosklerosis. Ada dua
tipe sel Th yaitu Th-1 dan Th-2, tipe Th-1 mengaktifkan respon makrofag dan
menginisiasi hipersensitivitas terhadap patogen intraseluler. Sedangkan tipe Th-2
berespon pada alergi. Aterosklerosis yang berisis sitokina akan meningkatkan
respon T helper-1 (Th1) sehingga sel T teraktivasi untuk berdeferensiasi menjadi
sel-sel Th1 efektor. Sel efektor akan memproduksi macrophage activating colony
interferon-γ. Interferon γ meningkatkan efisiensi penyajian antigen dan sintesis
sitokin peradangan TNF dan IL-1 (Hansson, 2009; Linton & Fazio 2003; Packard
& Libby, 2008).
Menurut Keaney (2004), kejadian oksidatif terlibat dalam pengaturan
molekul adhesi seluler sel endotel. Sitokina akan menginduksi ekspresi molekul
VCAM-1 sel endotel. Sedangkan senyawa O‾2 intraseluler memproduksi efek
dalam mengaturan induksi sitokina. Pada kondisi yang sama, O‾2 merupakan
signal dalam pengaturan ICAM-1 sel endotel akibat dari osilator shear stress.
Sitokina yang menginduksi VCAM-1 dapat juga meningkatkan oksidasi LDL atau
oksidasi asam lemak. Sel arteri endotel manusia yang diinduksi dengan LDL
teroksidasi dapat mengekpresikan VCAM-1, ICAM-1dan E-selektin. Kondisi ini
semua menandakan adanya gangguan oksidatf yang mengekspresikan molekul
adhesi sel endotel.
Penelitian ini dimaksudkan untuk mengkaji dan mendapatkan informasi
tentang potensi kurkuminoid ekstrak temu mangga, dalam menghambat ekspresi
molekul adhesi dari sel endotel yang diinkubasi dengan LDL teroksidasi secara in
vitro. Diharapkan, data yang diperoleh dapat dibuat suatu rekomendasi tentang
manfaat kurkuminoid temu mangga yang dapat mengobatan penyebab awal
aterosklerosis.
BAHAN DAN METODE
93
Bahan dan Alat
Bahan penelitian yang digunakan antara lain line cell coronary pulmonary
arterial endothelial (CPAE) yang diperoleh dari laboratorium mikrobiologi dan
virologi PSSP LPPM-IPB. DMEM, 10% fetal bovine serum (FBS), monoclonal
mouse anti human ICAM-1(CD 54) cat. No: C 2969; antibodi primer mouse anti
VCAM-1 cat. No: V9263, PBS, 3,3-diaminobenzidine tetrahydro chloride (DAB,
sigma, cat. No. D-5905), Avidin-Biotin- conjungated (Elite Vecta StainR, Vector
Lab. Cat. No: PK 6100), PBS, penisilin dan streptomisin.
Alat yang digunakan antara lain laminar flow hood, inkubator CO2,
mikroskop, kultur flask, pipet mikro, spektrofotometer, sentrifugasi, kultur slide
chamber, dan alat gelas lainnya.
Metode Penelitian
Respon Ekspresi Molekul Adhesi pada Permukaan Sel Endotel terhadap
Efek Kurkuminoid Ekstrak Temu Mangga.
Kultur sel lestari CPAE pra-inkubasi dengan penambahan ekstrak
kurkuminoid temu mangga (2 ppm/ml dan 8 ppm/ml) pada suhu 370C selama 48
jam dalam DMEM yang mengandung 20% FBS (v/v), sehingga diperkirakan
50% sel konfluen. Sebagai kontrol, dibuat tanpa menambahkan kurkuminoid
ekstrak temu mangga. Kemudian sel dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali dan
diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam sehingga sel konfluen. Setelah 24 jam,
molekul adhesi ditentukan dengan reaksi antibodi anti VCAM-1 dan antibodi anti
ICAM-1 (imunohistokimia).
Respon Ekspresi Molekul Adhesi pada Permukaan Sel Endotel yang
Diinduksi dengan Ion Cu2+.
Kultur sel lestari CPAE pra-inkubasi pada suhu 370C selama 48 jam dalam
DMEM yang mengandung 20% FBS (v/v), dengan penambahan ekstrak
kurkuminoid temu mangga (2 ppm/ml dan 8 ppm/ml) sehingga diperkirakan 50%
sel konfluen. Sebagai kontrol dibuat tanpa kurkumioid ekstrak temu mangga.
Kemudian sel dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali, lalu diberi ion Cu2+ 5 μM
94
dan diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam sehingga sel konfluen. Setelah 24
jam molekul adhesi ditentukan dengan reaksi antigen antibodi (imunohistokimia).
Respon Ekspresi Molekul Adhesi Permukaan Sel Endotel yang Diinkubasi
dengan LDL
Kultur sel endotel diinkubasi pada suhu 370C selama 48 jam dalam DMEM
yang mengandung 20% FBS (v/v), dengan atau tanpa penambahan ekstrak
kurkuminoid temu mangga (2 ppm/ml dan 8 ppm /ml) dan diperkirakan 50% sel
konfluen. Sebagai kontrol dibuat kultur sel tanpa kurkuminoid ekstrak temu
mangga. Setelah itu sel dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali lalu masing masing
ditambahkan LDL 200 μg dan diinkubasi kembali pada suhu 370C selama 24 jam
hingga sel konfluen. Molekul adhesi ditentukan dengan reaksi antigen antibodi
(imunohistokimia).
Respon Ekspresi Molekul Adhesi pada Permukaan Sel endotel yang
diinkubasi dengan LDL teroksidasi
Kultur sel endotel dipra-inkubasi pada suhu 370 C selama 48 jam dalam
DMEM yang mengandung 20% FBS (v/v), dengan penambahan ekstrak
kurkuminoid temumangga (2 ppm/ml dan 8 ppm/ml) sehingga diperkirakan 50%
sel konfluen. Sebagai kontrol sel dikultur tanpa ditambahkan kurkuminoid
ekstrak temu mangga. Kemudian kultur sel dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali,
diinkubasi dengan 200 ug LDL dan ion Cu2+ 5 μM pada suhu 370C selama 24
jam sehingga sel konfluen. Setelah 24 jam, molekul adhesi ditentukan dengan
reaksi antigen antibodi (imunohistokimia).
Pewarnaan Imunohistokimia terhadap VCAM-1 dan ICAM-1 (Ramos
2005 & Danskey et al. 2002). Preparat monolayer dicuci dengan larutan DMEM
dan difiksasi dengan larutan aseton selama 2-3 menit lalu dikeringkan. Preparat
dicuci dengan 0,1 M buffer fosfat salin pH 7,4 (3x selama 10 menit), lalu
diinkubasi dengan protainase-K (10 ug/ml) selama 30 menit pada suhu 370C,
kemudian dibilas dengan 0,1M PBS sebanyak 3 kali, masing-masing 10 menit.
Aktivitas endogenous peroksidase pada sel diblok dengan 0,3% hidroksi
peroksida (H2O2) selama 15 menit, kemudian dibilas dengan akuades sebanyak 3
kali masing-masing 10 menit. Preparat kemudian diinkubasi dalam 2% non95
immune goat serum pada suhu kamar selama 60 menit dan dikeringkan (udara)
tanpa dibilas. Preparat diinkubasi kembali selama 24 jam dalam refrigenerated,
dengan antibodi primer monoclonal mouse anti human ICAM-1(CD 54) cat. No:
C2969 yang diencerkan 100 kali dan antibodi primer mouse anti VCAM-1 cat. No:
V9263 dengan pengenceran 1:25. Pada kontrol tidak ditambahkan antibodi
primer, hanya diberi antibodi sekunder dan slide dibiarkan pada suhu kamar
selama 10 menit lalu dibilas dengan 0,1M PBS masing-masing sebanyak 3 kali
selama 15 menit. Preparat diinkubasi dengan antibodi sekunder biotinylated goat
anti-mouse (1:200) (Vector Elite, Vector Labs) dalam PBS pada suhu kamar
selama 30 menit. Selanjutnya preparat dibilas sebanyak 3 kali masing-masing 10
menit dengan 0,1 M PBS lalu diinkubasi dalam Avidin-Biotin- conjungated (Elite
Vecta StainR, Vector Lab. Cat. No: PK 6100) (1:200) dalam PBS selama 60
menit. Preparat dibilas kembali dengan fosfat bufer sebanyak 3 kali masingmasing 15 menit.
Segera setelah selesai dibilas, preparat diinkubasi dengan larutan 3,3diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB, sigma, cat. No. D-5905) selama 5
menit dan dilanjutkan dengan 3% H2O2 yang dipersiapkan dalam DAB selama 20
menit. Slide dicuci beberapa kali sampai bersih dalam bufer fosfat, lalu
dikeringkan dalam inkubator selama satu malam.
Peubah yang Diamati
Peubah yang diamati meliputi perbedaan intensitas warna terhadap ICAM-1
dan VCAM-1. Cara mengamati perbedaan warna sel pada preparat dalam satu
bidang pandang.
Analisis Data
Sel endotel dapat menghasilkan protein molekul adhesi yang akan bereaksi
membentuk ikatan dengan antibodi terhadap anti ICAM-1 dan anti VCAM-1.
DAB digunakan untuk memvisualisasikan warna coklat kekuningan terhadap sel
endotel yang imunoreaktif terhadap antibodi anti ICAM-1 dan antibodi anti
VCAM-1. Hasil pewarnaan molekul adhesi dianalisis secara diskriptif.
HASIL DAN PEMBAHASAN
96
Respon Ekspresi Molekul Adhesi VCAM-1 pada Permukaan terhadap Efek
Kurkuminoid Ekstrak Temu mangga
Percobaan ini bertujuan menentukan respon ekspresi VCAM-1 pada
permukaan sel endotel terhadap kurkuminoid ekstrak temu mangga dan
divisualisasikan dengan DAB (Gambar 21). Kultur sel endotel dalam percobaan
ini tanpa diberi perlakuan apapun seperti pada preparat 21a dan 21b, kecuali pada
preparat 21c dan 21d diinkubasi dengan kurkuminoid 2 ppm dan 6 ppm. Hasil
percobaan tidak memperlihatkan terekspresinya VCAM-1. Kondisi ini sesuai
dengan harapan karena sampel tanpa perlakuan.
a
b
c
d
Gambar 21 Gambaran mikroskopis pewarnaan imunohistokimia VCAM-1 sel
endotel (SE), perbesaran 160x. (a) SE + Ab 40 µg, (b) SE tanpa Ab,
(c) SE + Ab1 40 µg + ET 2 ppm (d) SE + Ab1 40 µg + ET 8 ppm
(ET, ekstrak temu mangga).
Antibodi anti VCAM-1 akan bereaksi dengan antigen (VCAM-1) yang
diekspresikan ke permukaan sel endotel, apabila terjadi reaksi antigen antibodi
yang bersifat monoklonal. Dalam percobaan ini, antibodi yang digunakan bersifat
monoklonal dan reaksi ikatan antigen-antibodi (Ag-Ab) dapat terlihat apabila
diwarnai dengan pewarnaan imunohistokimia. Ikatan antigen-antibodi yang
terbentuk dapat divisualisasikan dengan pewarnaan DAB. Intensitas warna yang
terjadi dipengaruhi oleh kondisi ikatan antigen antibodi pada saat pewarnaan.
97
Molekul VCAM-1 merupakan gejala awal yang dapat muncul ke
permukaan sel apabila terjadi gangguan terhadap membran sel (Silverman et al.
2001). Dalam percobaan ini, sel endotel yang dikultur tidak diberi perlakuan
kimia apapun, kecuali medium pertumbuhan yang telah sesuai untuk pertumbuhan
sel. Pada preparat 21a, 21b dan 21d, sel masih terlihat jelas dan utuh tanpa ada
kerusakan, sedangkan untuk preparat 21c tampak jelas telah terjadi kerusakan.
Kerusakan ini kemungkinan terjadi secara teknis saat pencucian, pewarnaan, atau
ketika sel dikultur dalam medium pertumbuhan. Atau disebabkan reaksi antigen antibodi
tidak
terjadi
setelah
preparat
diwarnai
dengan
pewarnaan
imunohistokimia meskipun telah divisualisasikan dengan DAB.
Pada percobaan selanjutnya, sel endotel diinkubasi dengan kurkuminoid
ekstrak temu magga dan diinduksi dengan 5 µM Cu2+, dengan
harapan dapat
memunculkan molekul VCAM-1(Gambar 22). Namun hasil percobaan tidak
menunjukkan terekspresinya molekul VCAM-1. Dari masing-masing preparat
pada Gambar 22a, 22b, 22c dan 22d, tidak memperlihatkan adanya perbedaan
intensitas warna yang jelas sebagai tanda terekspresinya molekul VCAM-1. Hal
ini kemungkinan disebabkan dosis ion Cu2+ yang ditambahkan saat sel dikultur
terlalu kecil, sehingga tidak cukup membuat tekanan dan merusak sel membran
sel ketika dikultur. Kemungkinan lain ikatan antibodi antigen tidak terjadi ketika
preparatsel dilakukan imunohistokimia, meskipun preparat telah direaksikan
dengan antibodi primer (anti VCAM-1 antibody) dan divisualisasikan dengan
DAB.
Secara normal sel dapat menghasilkan berbagai senyawa kimia yang dapat
merusak sel apabila diberi senyawa ion logam. Ion logam Cu2+ merupakan salah
satu senyawa kimia yang dapat menyebabkan sel menjadi stres. Menurut Halliwel
et al. (1992), berbagai logam berat dan logam transisi diketahui sebagai katalis
radikal bebas. Radikal bebas inilah yang menyebabkan gangguan pada sel,
sehingga sel akan mengekspresikan berbagai senyawa kimia. Namun demikian sel
dapat mempertahankan diri dari rangsangan yang mempunyai aktivitas tinggi,
dengan cara mengekspresikan antibodi untuk melawan rangsangan yang datang.
Dalam percobaan ini, logam Cu2+ sebanyak 5 µM yang dikultur ke dalam sel
98
endotel tidak cukup mempengaruhi perubahan dan menggoyah struktur dari sel
endotel.
a
b
c
d
Gambar 22 Gambaran mikroskopis pewarnaan imunohistokimia VCAM-1 sel
endotel (SE) dengan 5 µM Cu2+, perbesaran 160x. (a) SE + Ab1 40
µg, (b) SE tanpa Ab, (c) SE + Ab 40 µg + ET 2 ppm, (d) SE + Ab
40 µg + ET 8 ppm (ET, ekstrak temu mangga).
Gambar 23 memperlihatkan efek LDL terhadap sel endotel yang dinkubasi
dalam medium pertumbuhan. Dalam percobaan ini diharapkan terjadi reaksi
oksidasi LDL di dalam sel endotel yang di kultur, sehingga molekul VCAM-1
dapat diekspresikan kepermukaan sel. Dari hasil percobaan molekul VCAM-1
tidak terekspresikan. Pada Gambar 23c dan 23d, sebelum dilakukan pewarnaan
imunohistokimia telah dipra-inkubasikan terlebih dahulu dengan kurkuminoid
ekstrak 2ppm dan 6 ppm. Kurkuminoid ekstrak yang ditambahkan diharapkan
mampu mencegah reaksi oksdasi LDL di dalam sel endotel sehingga sel yang
dikultur tetap stabil. Molekul LDL merupakan senyawa lipoprotein yang dapat
mengalami oksidasi di dalam sel apabila diinkubasikan dan dikondisikan sesuai
dengan kehidupan sel. Kondisi yang demikian ini dapat meningkatkan aktivitas
permukaan sel sehingga permebialitas sel menjadi tidak normal.
Molekul VCAM-1 yang diharapkan muncul kepermukaan sel endotel,
ternyata tidak juga terekspresikan meskipun telah direaksikan dengan antibodi anti
VCAM-1 dan didivisualisasikan dengan DAB (Gb 23a, 23b, 23 c dan 23d). Hal
99
ini kemungkinan tidak terbentuk reaksi antigen antibodi, atau antibodi primer
(anti VCAM-1 antibody) yang digunakan diisolasi dari manusia dan bersifat
monoklonal (kit). Sedang sel endotel yang digunakan dalam percobaan berasal
dari endotel yang diisolasi dari paru-paru sapi (sel lestari CPAE). Antibodi primer
(kit) tidak bereaksi dengan antigen yang berasal dari kultur sel endotel, karena
epitop yang dimiliki oleh antibodi primer tidak sesuai dengan paratop dari
antigen.
a
c
b
d
Gambar 23 Gambaran mikroskopis pewarnaan imunohistokimia VCAM-1 sel
endotel (SE) dengan LDL 200 ug, perbesaran 160x. (a) SE + Ab 40
µg, (b) SE tanpa Ab1, (c), SE + Ab40 µg + ET 2 ppm, (d) SE +Ab 40
µg + ET 8 ppm (ET, ekstrak temu mangga).
Partikel LDL dapat teroksidasi apabila LDL terakumulasi dan menempel
pada permukaan sel endotel, yang mengakibatkan sel endotel teraktivasi. Partikel
LDL yang menempel pada permukaan pembuluh darah dapat masuk ke dalam
intima dan ditangkap oleh reseptor scavenger dari makrofag (Packard & Libby,
2008). Kondisi ini merangsang sel menghasilkan molekul adhesi, namun
kenyatannya, dalam percobaan VCAM-1 tidak terekspresikan baik yang diberi
perlakuan dengan LDL, ion Cu2+ maupun LDL yang ditambahkan ion Cu2+, serta
kontrol reagen. Keadaan ini diduga LDL yang diinkubasikan dalam kultur tidak
menggoyah permukaan pembuluh sel endotel yang dikultur, atau antibodi anti
VCAM-1 tidak bereaksi tidak sesuai dengan antigen yang muncul ke permukaan
100
sel yang dikultur setelah dilakukan pewarnaan imunohistokimia (Gambar 23a, 23b
dan 23c, 23d).
Percobaan yang sama terjadi pada kultur sel yang diinkubasi dengan LDL
teroksidasi. Partikel LDL sebelumnya telah direaksikan dengan Cu2+ 5µM. Secara
in vitro, oksidasi LDL dapat diinisisasi oleh ion logam seperti ion Cu2+ yang akan
memecah ikatan lipid peroksida dan menginisiasi reaksi propagasi (Gambar 24).
a
b
c
d
Gambar 24 Gambaran mikroskopis pewarnaan imunohistokimia VCAM-1 sel
endotel (SE) dengan LDL 200 µg, 5µM Cu2+, VCAM-1 perbesaran
160x. (a) SE + Ab 40 µg, (b) SE tanpa Ab, (c), SE+ Ab 40 µg + ET
2 ppm, (d) SE + Ab 40 µg + ET 8 ppm (ET, ekstrak temu mangga).
Dalam percobaan ini, sebelum sel endotel yang diinkubasikan dengan LDL
teroksidasi, sel pada Gambar 24 d dan 24c telah dipra-inkubasikan selama 48 jam
dengan kurkumminoid ekstrak 2 ppm dan 8 ppm. Kurkuminoid ekstrak yang
diinkubasikan ke dalam kultur, diharapkan mampu mencegah/ menghambat reaksi
oksidasi LDL di dalam sel endotel. Dalam percobaan ini memperlihatkan hasil
yang sama seperti pada percobaan sebelumnya, yaitu VCAM-1 tidak
terekspresikan.
Molekul VCAM-1 tidak tervisualisasikan dalam percobaan ini meskipun
sel endotel yang dikultur telah diinduksi dengan LDL dan diinkubasi dengan Cu2+
5µM. Adanya kerusakan sel terlihat pada preparat perlakuan pada preparat
Gambar 24a dan. 24c sedangkan pada preparat 24b dan 24d bentuk sel masih
101
terlihat utuh. Molekul LDL yang teroksidasi dan diinkubasi dengan sel endotel
dalam percobaan in, seharusnya membuat permukaan sel menjadi tidak stabil,
sehingga sel memproduksi antibodi (antigen/VCAM-1). Antibodi ini merupakan
molekul protein yang diproduksi oleh sistem imun pada sel apabila sel yang
dikultur mendapatkan rangsangan/ gangguan dari luar. Sesuai dengan pendapat
(Packard & Libby 2008), yang menyatakan bahwa LDL teroksidasi dapat
merangsang sel endotel untuk menghasilkan molekul adhesi.
Konsentrasi LDL yang tinggi dan terakumulasi pada permukaan sel,
merupakan antigen yang seharusnya dapat bereaksi dengan sel imun yang
disekresikan oleh sel. Ini menandakan ada radang pada permukaan sel dan
menyebabkan aktivitas sel meningkat. Meningkatnya aktivitas sel menyebabkan
perubahan dan intergritas fungsional sel menjadi terganggu. Akibatnya
memudahkan lipoprotein masuk ke subendotel. Keadaan ini memicu proses
peradangan, sehingga sel akan mengekspresikan berbagai tipe molekul adhesi sel
darah putih. Hansson (2005) menyatakan, sel endotel dapat mengekspresikan
berbagai molekul adhesi sebagai akibat adanya hiperkolesterolemia yang dapat
mengaktifkan permukaan sel endotel.
Protein antibodi akan bereaksi dengan antibodi primer yang sesuai dengan
epitop yang ada, ketika preparat diwarnai dengan pewarnaan imunohistokimia.
Sel lestari CPAE yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari arteri koronaria
pulmonaris sapi, sedangkan antibodi primer ( kit, anti VCAM-1 antibody) yang
digunakan
berasal dari manusia bersifat monoklonal. Antara antigen dengan
antibodi primer tidak klop reaksinya sehingga tidak terbentuk reaksi antigenantibodi. Keadaan inilah yang menyebabkan molekul adhesi VCAM-1 sel lestari
tidak terekspresikan. Meskipun biotinylated horse anti-mouse Ig G sebagai
antibodi sekunder telah digunakan untuk memperkuat ikatan antigen antibodi
primer secara enzimatis (Ramos, 2005). Karena tidak ada ikatan antigen antibodi,
maka molekul adhesi VCAM-1 tidak tervisualisasikan meskupun diberi substrat
avidin biotin kompleks horseradish peroksidase dan diwarnai dengan DAB.
Kemungkinan juga antibodi primer yang digunakan tidak bekerja secara optimal
dengan dosis yang diberi
102
Ekspresi Molekul Adhesi ICAM-1 pada Permukaan Sel Endotel terhadap
Efek Kurkuminoid Ekstrak Temu Mangga.
Gambar 25 memperlihatkan ekspresi molekul adhesi ICAM-1 pada
permukaan sel endotel yang di kultur dalam medium pertumbuhan secara in vitro.
Dalam percobaan ini, semua kultur sel endotel yang diinkubasikan tanpa diberi
perlakuan senyawa kimia apapun, kecuali pada preparat 25c dan 25d yang terlah
diinkubasi dengan kurkuminoid ekstrak 2ppm dan 6ppm. Hasil percobaan
menunjukkan bahawa, molekul ICAM-1 dapat diekspresikan ke permukaan sel
endotel. Terekspresikannya molekul ICAM-1 ditandai dengan munculnya warna
kuning kecoklatan pada sel endotel setelah dilakukan imunohistokimia dan
diwarnai dengan 3,3-diaminobenzidin tetrahydro chloride (DAB).
b
a
c
d
Gambar 25 Gambaran mikroskopis pewarnaan imunohistokimia ICAM-1 sel
endotel (SE), perbesaran 160x: (a) SE + Ab 20 µg, (b) SE tanpa Ab,
(c) SE + Ab 20 µg + ET 2 ppm, (d) SE + Ab 20 µg + ET 8 ppm (ET,
ekstrak temu mangga).
Masing-masing preparat memperlihatkan intensitas warna molekul adhesi
yang cukup jelas. Intensitas warna molekul adhesi yang diekspresikan berwarna
coklat kekuningan dan lebih pekat yang ditunjukkan Gambar 25a, 25c, 25d
dibandingkan dengan Gambar 25b yang tidak menunjukkan warna. Pada Gambar
25a, sebagai kontrol positif sel tanpa diberi ekstrak kurkuminoid tetapi dalam
pewarnaan imunohistokimia perlakuannya sama seperti Gambar 25c dan 25d.
103
Pada Gambar 25d terjadi reduksi warna dan jumlah sel bila dibandingkan dengan
Gb.25c, kaadaan ini disebabkan efek dari pemberi ekstrak kurkuminoid 8ppm,
sedangkan Gb. 25c hanya diberi kurkuminoid ekstrak sebanyak 2ppm tanpa
terlihat jelas dibandingkan dengan kontrol sel tanpa ekstrak. Kondisi ini
menandakan bahwa ekstrak kurkuminoid temu mangga 8 ppm, mampu
mengurangi oksidasi sel endotel yang dikultur dalam medium pertumbuhan.
Secara in vitro, sel yang diinkubasi dapat melepaskan radikal bebas
sehingga meningkatkan aktivitas permukaan sel. Aktivitas permukaan sel akan
memicu terekspresinya molekul adhesi ICAM-1. Antibodi anti ICAM-1 akan
bereaksi dengan molekul ICAM-1 yang muncul pada permukaan sel endotel.
Radikal bebas merupakan produk yang dihasilkan oleh sel secara in vitro, sebagai
akibat gangguan oksidatif sehingga akan terbentuk peradangan (Keaney 2004).
Selama peradangan sel akan memproduksi sitokina maupun sel imun sehingga sel
dapat mengekspresikan molekul adhesi leukosit.
Menurut Sadikin (2001) serangan radikal bebas terhadap molekul
sekelilingnya
akan
menyebabkan
terjadinya
reaksi
berantai,
kemudian
menghasilkan senyawa radikal baru. Dampak reaktivitas senyawa radikal bebas
dapat bermacam-macam dimulai dari kerusakan sel atau jaringan, penyakit
autoimun, penyakit degeneratif hingga kanker. Pada patogenesis aterosklerosis,
ekspresi molekul adhesi pada sel endotel mengawali datang dan menempelnya
sel radang ke permukaan lumen pembuluh darah, aktivasi sel radang dan
pembebasan sitokina serta menumpuknya lipid pada plak aterosklerosis
(Crowther 2005). Berbagai rangsangan yang dapat menimbulkan terjadinya
radang (pro-inflammatory) adalah hiperkolesterolemia, hipertensi, obesitas,
merokok, hiperglikemia. Semua rangsangan ini dapat menginduksi ekpsresi
molekul adhesi seperti P-selektin dan VCAM-1(Packard & Libby 2008). Secara
lebih spesifik lagi karena radikal bebas ROS akan mengaktifkan sel endotel
sehingga memproduksi sitokina yang selanjutnya akan menginduksi terbentuknya
molekul adhesi (Libby dan Ridker 2006). Molekul adhesi VCAM-1 dilaporkan
dapat terekspresi secara berlebihan melalui induksi pakan aterogenik pada hewan
coba (Li 1993). Demikian pula LDL teroksidasi juga dapat meningkatkan
ekspresi molekul adhesi pada sel endotel (Libby & Ridker 2006).
104
Efek logam transisi berupa ion Cu2+ pada permukaan sel endotel dapat
menyebabkan kerusakan pada komponen penyusun membran sel (Caterina et
al.200; Pakard & Libby 2006). Kerusakan terjadi pada asam lemak tak jenuh yang
merupakan bagian dari fosfolipid penyusun membrane sel. Membran merupakan
barier penting agar sel dapat berfungsi normal, demikian juga dengan sistem
membran sel imun untuk berbagai antigen. Respon ekspresi molekul adhesi
ICAM-1 pada permukaan sel endotel yang diinduksi dengan ion Cu2+5 µM dalam
medium pertumbuhan, menunjukkan terekspresinya molekul ICAM-1 (Gambar
26).
b
c
d
Gambar 26 Gambaran mikroskopis pewarnaan imunohistokimia ICAM-1 sel
endotel (SE) dengan Cu2+ 5 µM: (a) SE + Ab 20 µg, (b) SE tanpa
Ab, (c) SE + Ab 20 µg + ET 2 ppm, (d) SE + Ab 20 µg + ET 8 ppm
(ET, ekstrak temu mangga).
Preparat sel endotel yang dikultur dalam medium pertumbuhan mampu
mengekspresikan molekul adhesi ICAM-1 yang ditandai dengan munculnya
warna
kuning
kecoklatan
pada
sel
endotel.
Masing-masing
preparat
memperlihatkan warna yang cukup jelas. Intensitas warna kekuningan coklat yang
diekspresikan oleh molekul adhesi warnanya lebih pekat ditunjukkan Gambar 26a;
26c; dan 26d. Jika dibandingkan dengan Gambar 26b yang tidak menunjukkan
adanya molekul ICAM-1. Pada Gambar 26a, sebagai kontrol positif sel tanpa
diberi
ekstrak
perlakuannya
kurkuminoid
sama
tetapi
seperti Gambar
dalam
26c
pewarnaan
dan 26d.
imunohistokimia
Dalam
pewarnaan
105
imunohistokimia, Gambar 26a
26c 26d masing-masing dereaksikan dengan
antibodi primer dan anti bodi sekunder. Sedangkan pada preparat Gambar 26 b
digunakan sebagai kontrol reagen tanpa diberi antibodi primer, tetapi hanya
diinkubasikan dengan antibodi sekunder.
Pada Gambar 26d , sel endotel yang dikultur dengan ion Cu2+ sebelumnya
telah dipra-inkubasikan dengan kurkuminoid ekstrak 8ppm. Hasil pewarnaan
imunohistokimia terhadap preparat tersebut terjadi reduksi ekspresi ICAM-1, bila
dibandingkan dengan preparat Gambar 26c yang diinkubasi dengan kurkuminoid
ekstrak 2 ppm. Hal ini disebabkan ion Cu2+ yang digunakan dalam percobaan
dapat menginduksi oksidasi lipid pada membran sel endotel yang dikultur. Efek
yang ditimbulkan pada proses oksidasi lipid oleh ion Cu2+ adalah,
sel akan
mengekspresikan ICAM-1 ke permukaan. Namun demikian , efek ion Cu2+ ini
dapat dihambat oleh kurkuminoid ekstrak temu mangga 8 ppm dengan cara yang
menghambat laju oksidasi lipid pada sel endotel sehingga ekspresi ICAM-1
berkurang.
Ion Cu2+ merupakan senyawa kimia yang dapat mengaktifkan sel radang,
sehingga sel akan melepaskan sitokina yang dapat merangsang terbentuknya
molekul adhesi ICAM-1 maupun VCAM-1. Antibodi anti ICAM -1 dapat
bereaksi dengan molekul adhesi ICAM-1 yang diekspresikan oleh permukaan sel
endotel yang dikultur. Sesuai pendapat yang dikemukan oleh Halliwell et
al.(1992), berbagai logam berat dan logam transisi diketahui sebagai katalis
radikal bebas. Radikal bebas merupakan molekul kecil yang dapat merusak dan
mengoksidasi sel, sehingga sel menjadi tidak stabil yang mengakibatkan aktivitas
sel jadi terganggu.
Dalam kondisi patologis, keseimbangan normal antara
produksi senyawa oksigen reaktif dengan kemampuan pertahanan antioksidan
akan mengalami gangguan. Keadaan
ini akan mengganggu rantai oksidasi-
reduksi normal sehingga terjadi kerusakan oksidatf jaringan yang disebut sebagai
stress oksidatif (Halliwell & Chirico1993). Dalam penelitian ini, molekul ICAM-1
terekspresi ke permukaan sel sebagai akibat pengaruh Cu2+ yang mengoksidasi sel
endotel sehingga ICAM-1 dapat terekspresikan.
Garbacki et al. (2005) melakukan pewarnaan imunohistokimia terhadap
jaringan paru-paru. Hasil yang diperoleh menunjukkan terekspresinya VCAM-1
106
dan ICAM-1 pada permukaan sel. Pewarnaan yang sama dilakukan sel endotel
LT2 yang diinduksi dengan TNF-ά secara in vitro, ternyata molekul adhesi
(ICAM-1) dapat dieksperesikan ke permukaan sel endotel. Sedangkan secara, in
vivo proses aterosklerosis diawali dengan adanya gangguan fungsi endotel
Hewan yang diberi pakan aterogenik, akan memicu terekspresinya molekul
adhesi (VCAM-1) pada permukaan sel endotel dan merupakan tahap awal
kejadian aterosklerosis. Sesuai pendapat yang dikemukan oleh Crowther (2005),
peningkatan adhesi seluler berhubungan dengan adanya disfungsi endotel dan
pada tahap selanjutnya terjadi pengambilan sel-sel radang, pelepasan sitokina dan
pengambilan lipid yang pada akhir menjadi plak aterosklerosis .
Hal yang sama terjadi pada kultur sel endotel yang diinkubasikan dengan
LDL. Data yang diperoleh menunjukkan terekspresiknya molekul ICAM-1
berwarna kuning kecoklatan pada permukaan sel endotel. (Gambar 27). Molekul
ICAM-1 yang terekspresikan memberikan warna yang cukup mencolok seperti
pada Gambar 27a, 27c dan 27d. Ekspresi ICAM-1 yang sangat mencolok terlihat
pada Gambar 27a, 27c dibandingkan dengan preparat pada Gambar 27b dan 27d.
Namun tidak demikian dengan Gambar 27b sebagai kontrol reagen, molekul
ICAM-1 tidak terekpresi kepermukaan sel endotel. Molekul adhesi yang
terekpresi desebabkan adanya reaksi oksidasi LDL di dalam sel endotel yang
dikultur. Oksidasi LDL ini memicu molekul adhesi terekpresikan ke permukaan
sel endotel sehingga menarik monosit untuk menempel pada permukaan sel dan
infiltrasi ke dalam intima. Pada Gambar 27d terlihat penurunan ekspresi ICAM-1
pada permukaan sel endotel dibandingkan Gambar 27c. Penurunan ekspresi
ICAM-1 kemungkinan dipengaruhi dengan pemberian kurkuminoid 2 ppm dan 8
ppm sebelum sel diikubasikan dengan LDL.
Kurkuminoid ekstrak 8 ppm yang diinkubasikan (27d) memperlihatkan
reduksi/penurunan ekspresi ICAM-1, jika dibandingkan dengan preparat pada
Gambar 27a (kontrol positif) tanpa kurkuminoid ekstrak. Pada Gambar 27c,
preparat
yang
menunjukkan
dipra-inkubasikan dengan kurkuminoid
ekspresi ICAM-1 lebih dominan
dari
ekstrak
2
ppm,
Gambar 27d. Namun
demikian ekspresi ICAM-1 berkurang (Gambar 27 c) dibandingkan dengan
kontrol positif (27a) tanpa diberi kurkuminoid ekdtrak temu mangga.
107
a
b
c
d
Gambar 27 Gambaran mikroskopis pewarnaan imunohistokimia ICAM-1 sel
endotel (SE) dengan LDL 200 µg, perbesaran160x: (a) SE + Ab 20
µg, (b) SE tanpa Ab, (c) SE + Ab 20 µg + ET 2 ppm, (d) SE + Ab 20
µg + ET 8 ppm (ET, ekstrak temu mangga).
Terekspresinya ICAM-1 pada permukaan sel endotel tentu saja dapat terjadi.
Molekul LDL sebagai inisiator yang dapat memicu munculnya molekul adhesi ke
permukaan sel. Sesuai pendapat yang dikemukan oleh Packard dan Libby (2008),
kolesterol terutama LDL merupakan agen yang dapat menstimuli senyawasenyawa radang kepermukaan sel sebagai lesi awal dari ateroskleroisi. Hal yang
sama dikemukan oleh Hansson (2008) bahwa LDL yang menempel pada
permukaan sel endotel dapat memicu sel memproduksi sitokina maupun radikal
bebas. Molekul kimia yang diproduksi sel ini menandakan adanya reaksi
peradangan sehingga molekul adhesi terekpresikan.
Pewarnaan imunohistokimia memperkuat hasil penelitan yang diperoleh
Reaksi antigen-antibodi (ag-ab1) pada pewarnaan ini, menunjukan bahwa sel
endotel yang dikultur dan diinduksi dengan ion Cu2+, LDL dan LDL teroksidasi
dapat mengekspresikan ICAM-1. Adanya biotinylated horse anti-mouse Ig G
sebagai antibodi sekunder memperkuat ikatan ag-ab1 secara enzimatis. Ikatan agab1, menyebabkan molekul ICAM-1 tervisualisasikan setelah diberi substrat
avidin biotin kompleks horseradish peroksidase dan diwarnai dengan DAB
(Danskey et al. 2002, Ramos 2005). Pada kontrol reagen dalam penelitian ini,
molekul ICAM-1 tidak tervisualisasikan meskipun telah diberi substrat avidin
biotin kompleks horseradish peroksidase dan diwarnai dengan DAB
108
Molekul LDL yang teroksidasi merupakan salah satu penyebab terjadinya
ateroskleroriss yang ditandai dengan pembentukan awal plak ateroma. Plak
ateroma terbentuk sebagai akibat proses oksidasi yang terjadi di dalam tubuh.
Kondisi ini mengakibatkan radikal bebas yang ada di dalam tubuh akan
mengoksidasi lipid lebih lanjut menghasilkan produk oksidasi lipid seperti
malonaldehid. Adanya kerusakan pada permukaan sel pembuluh darah akan
mengakibatkan perubahan struktur sel dan aktivis sel menjadi tidak stabil. Apabila
kondisi ini berjalan terus menerus maka akan menimbulkan pembentukan
kumpulan sel membentuk sel busa. Sel busa yang terbentuk merupakan tahap
awal terjadinya proses aterosklerosis.
Gambar 28 memperlihatkan ekspresi molekul adhesi ICAM-1 dan
pembentukan sel busa pada permukaan sel endotel yang diinduksi dengan LDL
teroksidasi (LDL+ ion Cu2+).
Molekul ICAM-1 terekspresi dengan jelas dan terjadi pembentukan
kumpulan sel sel busa. Kondisi diduga terjadi oksidasi LDL pada sel endotel yang
dikultur (Gambar 278a, 28c dan 28d). Molekul LDL yang teroksidasi, kecuali
merangsang teraktivasinya permukaan sel endotel, juga dapat merusak permukaan
sel itu sendiri. Hasil uji terhadap kontrol positif (Gambar 28a), kultur sel endotel
tanpa dipra-inkubasikan dengan kurkuminoid dan hasil yang diperoleh terlihat
jelas adanya pembentukan sel-sel busa maupun ekspresi ICAM-, dibandingkan
dengan kontrol reagen (28b). Pada kontrol reagen, ketika sel endotel dikultur
tanpa
ditambahkan
kurkuminoid,
dan
ketika
dilakukan
pewarnaan
imunohistokimia tanpa diinkubasikan dengan antibodi anti ICAM-1. Demikian
juga hal yang sama terjadi pada perlakuan (Gambar 28c dan 28d), menunjukkan
adanya kumpulan sel-sel busa disamping terekspresinya molekul ICAM-1, bila
dibandingkan dengan kontrol reagen (Gambar 28c). Tidak adanya perbedaan yang
terjadi pada Gambar 28a,28c dan 28d (kontrol positif dan perlakuan),
mengindikasikan pada permukaan sel endotel yang dikultur akativitasnya
meningkat.
109
b
a
c
d
Gambar 28 Gambaran mikroskopis pewarnaan imunohistokimia ICAM-1 sel
endotel (SE), dengan 200µg LDL & 5µM Cu2 +, perbesaran 160x:
(a) SE + Ab20 µg, (b) SE tanpa Ab, (c) SE + Ab 20 µg + ET 2
ppm, (d) SE + Ab 20 µg + ET 8 ppm (ET: ekstrak temu mangga).
Menurut pendapat yang dikemukan oleh Crowther (2005), sel busa
merupakan metabolit aktif yang dapat mensekresikan berbagai sitokina dan
mediator radang, dan pada akhirnya akan menyebabkan sel otot polos untuk
berproliferasi sebagai akibat dari meningkatnya aktivitas sel.
Dalam percobaan ini, molekul adhesi ICAM-1 dan kumpulan sel-sel busa
nampak yang terbentuk sangat jelas. Semua ini terjadi setelah preparat sel endotel
(sel line CPAE) direaksikan dengan antibodi anti ICAM-1, sehingga terbentuklah
ikatan antigen antibodi (ag-ab). Terbentuknya reaksi ag-ab merupakan tanda awal
ada gangguan pada permukaan sel yang dikultur. Antibodi primer (kit, antiICAM-1 antibody) yang digunakan berasal dari manusia bersifat monoklonal.
Antara antigen dengan antibodi primer klop reaksinya karena epitop dari antibodi
primer sesuai dengan paratop dari ICAM-1 antigen. Antibodi sekunder digunakan
dalam pewarnaan imunohistokimia memperkuat ikatan antigen - antibodi secara
enzimatis. Sesuai dengan pendapat yang dikemukakan oleh Ramos (2005), bahwa
biotinylated horse anti-mouse Ig G merupakan antibodi sekunder yang akan
memperkuat ikatan antigen antibody secara enzimatis. Selanjunya dikatakan
bahwa, reaksi warna ini semakin jelas setelah diberi substrat avidin biotin
kompleks horseradish peroksidase dan diwarnai dengan DAB.
110
Molekul LDL yang diinkubasi pada sel endotel dapat mengoksidasi sel
sehingga merangsang pembentukkan molekul adhesi. Menurut Hansson (2005)
dan Libby (2002), molekul LDL teroksidasi sebagai akibat dari reaksi oksidasi
maupun bereaksi secara enzimatis terhadap intima pembuluh darah sehingga akan
terjadi pelepasan fosfolipid yang dapat mengaktifkan sel-sel endotel dalam
mengekspresikan molekul adhesi. Sedangkan menurut Packard & Libby (2008),
menyatakan bahwa LDL teroksidasi merupakan antigen yang akan merangsang
permukaan sel sehingga terjadi radang. Peradangan ini akan menghasilkan
sitokina maupun limfosit sel T, sehingga memproduksi molekul adhesi. Dalam
percobaan ternyata LDL terakumulasi pada permukaan sel, yang merupakan
penyebab utama terekspresinya molekul ICAM-1.Molekul ICAM-1 adalah
imunoglobulin (Ig) seperti sel molekul adhesi yang diekspresikan oleh beberapa
tipe sel yang melibatkan leukosit dan sel endotel pada perkembangan lesi
aterosklerosis (Lawson & Wolf 2009).
Adhesi leukosit pada sel dinding endotel merupakan mekanisme utama yang
merespon pembentukan oksigen radikal bebas (ROS), dan pada akhirnya akan
menghasilkan oksidan sitotoksik dan mediator peradangan yang mengaktifkan
sistem komplemen. Dalam kondisi normal, sel leukosit bergerak bebas di
sepanjang sel endotel. Selama iskemik dan peradangan, sel endotel akan
memebebaskan berbagai mediator. Kondisi ini menyebabkan molekul adhesi
leukosit muncul pada permukaan sel sehingga akan memobilisasi dan merangsang
granula-granula leukosit. Oksidan yang dihasilkan dapat menyebabkan kerusakan
jaringan sehingga terjadi radang (Caterina et al. 2000; Hoorn et al. 2003; Joris et
al.1983)
Sesuai dengan teori yang dikemukan oleh Steinberg (1993), lesi
aterosklerotik diawali oleh teroksidasinya LDL sehingga mengakibatkan endotel
mengekspresikan perlekatan monosit dan menghasilkan monocyte chemotatic
protein (MCP) dan macrophage colony stimulating factor (M-CSF). Induksi
tersebut mengakibatkan monosit berubah menjadi makrofag dan menempel pada
endotel. Selanjutnya makrofag akan memfagositose LDL teroksidasi, kemudian
akan terakumulasi pada dinding pembuluh darah membentuk sel busa dan
berakhir dengan terbentuknya lesi awal yang dikenal sebagai lempeng kolesterol.
111
Dalam penelitian yang telah dilakukan, ekstrak kurkuminoid temu mangga (ET)
yang ditambahkan ke dalam kultur pada sel lestari endotel (2 ppm dan 8 ppm)
tidak dapat menahan reaksi oksidasi LDLterhadap sel, sehingga kerusakan pada
sel lestari tetap terjadi.
Pada Gambar 21 - 24, terlihat jelas bawa molekul VCAM-1 tidak
terekspresikan walaupun telah direaksikan dengan antibodi primer dan
divisualisasikan dengan DAB. Sedangkan molekul
ICAM-1 (Gambar 25-28)
terekpresikan pada permukaan sel setelah divisualisasikan dengan DAB. Pada
Gambar 28 selain molekul ICAM-1 yang terbentuk, juga adanya kumpulan sel
busa. Hal ini disebabkan oleh akumulasi LDL teroksidasi pada sel endotel yang
dikultur. Akumulasi LDL teroksidasi ini akan ditangkap oleh reseptor scavenger
dari makrofag sehingga terbentuk sel busa. Molekul LDL teroksidasi merupakan
agen penyebab abnormalnya permukaan sel endotel, namun belum tentu
merupakan penyebab awal terjadinya aterosklerosis. Molekul adhesi seperti
VCAM-1 dapat terekspresi pada permukaan sel, tetapi tidak hanya dipengaruhi
oleh LDL teroksidasi maupun ion ligam transisi, dan juga banyak faktor yang
menentukan seperti faktor internal sel, lama waktu inkubasi, antigen yang dapat
meninduksi ekspresi VCAM, jenis antibodi primer yang digunakan, maupun dosis
efektif obat yang diberikan.
Pada prinsipnya pewarnaan imunohistokimia merupakan suatu metode
yang didasarkan atas reaksi antigen antibodi. Sel endotel (sel lestari CPAE)
ditumbuhkan dalam medium pertumbuhan dan diinkubasi dengan LDL
teroksidasi. Molekul adhesi dapat terekspresikan apabila sel lestari mengalami
gangguan akibat pemberian LDL oksidasi. Antibodi primer yang digunakan
adalah monoclonal anti VCAM-1 dan monoclonal antibody Human ICAM-1
(CD54). Biotinylated horse anti-mouse Ig G digunakan sebagai antibodi sekunder.
Antibodi skunder memperkuat ikatan antigen (molekul adhesi yang muncul ke
permukaan sel) dengan antibodi primer secara enzimatis, sehingga apabila
molekul ini diberi substrat avidin biotin kompleks horseradish peroksidase akan
tervisualisasikan dengan jelas. Slide preparat diwarnai dengan larutan 3,3diaminobenzidin tetrahydro chloride (DAB).
112
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan yang telah dilakukan dapat di tarik
beberapa simpulan sebagai berikut: Dalam percobaan ini, molekul VCAM-1 tidak
terekspresikan, sedangkan ICAM-1 dapat terekspresikan ke permukaan sel
endotel. Kurkuminoid ekstrak temu mangga 8 ppm mampu menekan efek ion
Cu+2, LDl dan LDL teroksidasi pada permukaan sel endotel. Selain itu
kurkuminoid 8 ppm mampu mereduksi ekspresi molekul ICAM-1. Secara in vitro,
efek ion logam transisi Cu2+ dan LDL teroksidasi dapat meningkatkan gangguan
permukaan pada sel endotel sehingga terbentuk sel-sel busa dan terekspresinya
ICAM-1.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengkaji mekanisme kerja
kurkuminoid ekstrak temu mangga dalam menekan ekpresi molekul adhesi
(ICAM-1, VCAM-1) secara in vitro. Selain itu, diperlukan orientasi konsentrasi
antibodi primer maupun konsentrasi kurkuminoid ekstrak temu mangga yang
digunakan.
DAFTAR PUSTAKA
Caterina DR, Liao JK, Libby P. 2000. Fatty acid modulation of endothelial
activation. http://www.ajcn.org/cgi/content/full/71/1/213 [23 maret 2001].
Crawther MA. 2005. Pathogenesis of atherosclerosis. The American Society of
hematology, 1-11.
Danskey HM, Barlow CB, Lominska C, Sikes JL, Kao C, Weinsaft J, Cybulsky
MI, Smith JD. 2002. Adhesion of monocyte to arterial endothelium and
initiation of atherosclerosis are critically dependent on vascular cell
adhesion molecule-1 gene dosage. Arterioscler Thromb Vasc Biol 21:16621667.
113
Garbacki N, Kinet M, Nusgens B, Desmecht D, Darr J. 2005. Proanthocyanidins
from Ribes nigrum leaves, reduce endothelial adhesion molecule ICAM-1
and VCAM-1. http://www.Journal-Inflammation.com/content/2/1/9 [9 Juni
2006].
Hansson GK. 2005. Inflamation, atherosclerosis and coronary atery disease.
Atheroscler Thromb Vasc Biol. 352:1685-1695.
Hansson GK. 2009. Atherosclerosis-an immune disease: the Atnitschove lecture
2007. Atheroscler, 202(1):2:10.
Halliwell B, Chirco S. 1993. Lipid peroxidation: its mechanisms, measurement
and significance. Am. J. Clin. Nutr. 57: 715S-715S.
Halliwell B, Gutteridge JMC, Cross CE. 1992. Free radicals, antioxidants and
human disease. J. Lab Clin Med. 119(6):598-620.
Hoorn van DE , Norren vK , Boelens PG, Nijveldt RJ, Leeuwen van PAM .2003.
Biological activities of flavonoids. Sci & Med 9(3):152-161.
Inoue K, Kobayashi M, Yano K, Miura M, Izumi A, Mataki C, Doi T, Hamakubo
T, Reid PC, Hume DA, Yoshida M, Aird WC, Kodama T, and Minami T.
2006. Histon deacetylase inhibitor reduce monocyte adheresion to
endothelium through the suppression of vascular cell adhesion molecule-1
expression. Ateriolscler, Thrombosis, and vascular biology. 26:2652.
Joris IT, Zand T, Nunnari TJJ, Krolokowski FJ, Majno G. 1983. Studies on the
pathogenesis of atherosclerosis. I. adhesion of mononuclear cells in the aorta
of hypercholesterolemic rats. Ams J. Pathol.113:341-358.
Lawson C & Wolf S. 2009. ICAM-i signalling in endothel cells. Pharmacology
Reports. 61:22-32.
Keaney JF et al. 2004. Vitamin E and vascular homeostasis: implication for
atherosclerosis. Faseb J. 13:965-972.
Li H, Cybulsky MI, Gimbrone MA, Libby P. 1993. An atherogenic diet rapidly
induces VCAM-1, a ytokine-regulatable mononuclear leukocyte adhesion
molecule, in rabbit aortic endothelium. Arterioscler Thromb.: 13(2):197204.
Libby P, Ridker PM. 2006. Inflammation and atherothrombosis: from population
biology and bench research to clinal practice. J Am Coll Cardiol 2006;
48:A33-46
Libby P. 2002. Inflamation in atherosclerosis. Nature 42:868-874.
Linton NF & Fazio. 2003. Macrophage, inflammation, and atherosclerosis. Int.J.
obesity. 27, 335-540.
114