ANTIBAKTERI DARI EKSTRAK KASAR DAUN GAMBIR (Uncaria

Antibakteri Ekstrak Kasar daun Gambir – Magdalena, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 3 No 1 p.124-135, Januari 2015
ANTIBAKTERI DARI EKSTRAK KASAR DAUN GAMBIR
(Uncaria gambir var Cubadak) METODE MICROWAVE-ASSISTED EXTRACTION
TERHADAP BAKTERI PATOGEN
Antibacterial from Gambier Leaves Crude Extract (Uncaria gambir var
Cubadak) Microwave-Assisted Extraction Method against Bacterial Pathogens
Novi Vensia Magdalena1*, Joni Kusnadi1
1) Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, FTP Universitas Brawijaya Malang
Jl. Veteran, Malang 65145
*Penulis Korespondensi, Email: [email protected]
ABSTRAK
Gambir (Uncaria gambir) varietas Cubadak merupakan tanaman perdu yang memiliki
kadar polifenol tinggi, yaitu katekin dan tanin yang bersifat sebagai antibakteri. Metode
ekstraksi yang digunakan adalah MAE (Microwave-Assisted Extraction). Penelitian ini
bertujuan untuk mengetahui pengaruh daya microwave dan rasio bahan:pelarut (b/v)
terhadap perlakuan analisis. Metode penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak
Kelompok (RAK) dengan 2 faktor, yaitu daya microwave (320, 560 dan 800 Watt) dan rasio
bahan:pelarut (1:25, 1;35 dan 1:45 (b/v)). Hasil terbaik diperoleh dari perlakuan daya
microwave 560 Watt dan rasio bahan:pelarut 1:35 (b/v) dengan hasil rendemen 63.29%,
total fenol 5581.58 ppm, aktivitas antibakteri Escherichia coli ATCC 25922 12.07 mm,
Salmonella typhimurium 12.57 mm, Staphylococcus aureus ATCC 29213 13.99 mm dan
Bacillus cereus 14.38 mm. KHM untuk Escherichia coli ATCC 25922 100%, Salmonella
typhimurium 90%, Staphylococus aureus ATCC 29213 90% dan Bacillus cereus 80%,
sedangkan KBM belum dapat diketahui.
Kata kunci: Aktivitas Antibakteri, Bakteri Patogen, Daun Gambir Cubadak, Microwave
Assisted Extraction
ABSTRACT
Gambier (Uncaria gambir) Cubadak variety is a shrub plant which has high levels of
polyphenols, those are catechins and tannins can be used as antibacterial. The extraction
method which is used is MAE (Microwave-Assisted Extraction). Objectives of this research
were to find out the effect of microwave power and material: solvent ratio (w/v) against
analysis treatment using Randomized Block Design (RBD) by two factors, those are
microwave power (320, 560 and 800 Watt) and material:solvent ratio (1:25, 1:35 and 1:45
(w/v)). The best result was obtained from microwave power 560 Watt and material:solvent
ratio 1:35 (w/v) with the result of yield 63.285%, total phenol 5581.581 ppm, antibacterial
activity of Escherichia coli ATCC 25922 12.07 mm, Salmonella typhimurium 12.57 mm,
Staphylococcus aureus ATCC 29213 13.99 mm and Bacillus cereus 14.38 mm. MIC of
Escherichia coli ATCC 25922 100%, Salmonella typhimurium 90%, Staphylococus aureus
ATCC 29213 90% and Bacillus cereus 80%, while MBC could not be known.
Keywords:
Antibacterial Activity, Bacterial Pathogens, Cubadak Gambier Leaves,
Microwave Assisted Extraction
PENDAHULUAN
Gambir (Uncaria gambir) merupakan salah satu komoditas perkebunan rakyat yang
berorientasi ekspor, dimana Indonesia adalah negara pemasok utama gambir dunia (80%)
124
Antibakteri Ekstrak Kasar daun Gambir – Magdalena, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 3 No 1 p.124-135, Januari 2015
[1]. Secara tradisional, tanaman ini dimanfaatkan sebagai bahan penyamak kulit dan
pewarna, sebagai bahan campuran dalam menyirih dan telah banyak digunakan sebagai
obat tradisional, diantaranya untuk obat luka bakar, obat diare dan disentri serta obat kumurkumur pada sakit kerongkongan [2].
Pemanfaatan gambir pada produk pangan selama ini masih terbatas sehingga
menyebabkan gambir belum dimanfaatkan secara optimal serta kurangnya pengetahuan
masyarakat dalam metode mengekstraksi gambir. Varietas gambir yang paling banyak
ditanam petani dan memiliki kadar polifenol yang tinggi adalah tipe gambir Cubadak [3].
Komponen fitokimia terbanyak pada daun gambir ialah flavonoid dengan komponen
utamanya katekin sebesar 75%, yang mengindikasikan bahwa tanaman gambir diduga
memiliki aktivitas sebagai antibakteri [4]. Oleh karena itu, dibutuhkan senyawa antibakteri
yang mampu menghambat atau membunuh pertumbuhan bakteri patogen penyebab
kerusakan pangan, seperti Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium,
Staphylococcus aureus ATCC 29213 dan Bacillus cereus.
Pemilihan dan penggunaan metode ekstraksi yang tepat diperlukan agar
mendapatkan ekstrak daun gambir dengan konsentrasi senyawa fenolik yang tinggi.
Pemilihan metode ekstraksi sangat penting dilakukan karena hasil ekstraksi akan
mencerminkan tingkat keberhasilan metode tersebut dalam mengeluarkan senyawa fenol
dari matriks bahan ke dalam pelarut [5].
MAE adalah metode ekstraksi yang memanfaatkan radiasi gelombang mikro untuk
mempercepat ekstraksi selektif melalui pemanasan pelarut secara cepat dan efisien [6].
Ekstraksi berbantu gelombang mikro memiliki kelebihan dibandingkan esktraksi dengan
pemanasan konvensional. Kelebihan tersebut diantaranya, waktu ekstraksi yang lebih cepat,
kebutuhan pelarut lebih sedikit dan rendemen ekstraksi yang lebih tinggi.
Selama ini belum dilakukan penelitian mengenai pengaruh daya microwave dan rasio
bahan:pelarut terhadap proses ekstraksi daun gambir Cubadak menggunakan MAE
(Microwave Assisted Extraction). Daya microwave dan rasio bahan:pelarut merupakan dua
faktor yang mempengaruhi satu sama lain untuk hasil ektraksi yang baik. Volume pelarut
dan daya ekstraksi merupakan faktor kristis dalam MAE [7].
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun gambir Cubadak segar yang
dipasok dari perkebunan gambir di Medan dengan karakteristik meliputi warna daun hijau
muda, berada pada ranting urutan ke-4 atau 5 dari ujung dan usia tanaman 1.5-2 tahun.
Kultur murni Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213 dan
Bacillus cereus didapatkan dari laboratorium Mikrobiologi Pangan, Jurusan Teknologi Hasil
pertanian, Universitas Brawijaya. Sedangkan kultur murni Salmonella typhimurium diperoleh
melalui hasil isolasi dari pasien penderita demam typhoid yang didapat dari Laboratorium
Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya. Bahan kimia meliputi asam galat
standar 1000 μg/L, akuades, reagen Folin-Ciocalteau (diencerkan 1:10 dengan akuades)
dan larutan NaCO3 75 g/L.
Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi pengering kabinet, neraca
analitik (Mettle denver AA 200), ayakan 60 mesh (W.S Tyler), blender kering (Quantum),
microwave oven (Metrowealth MW 1125B, daya maksimum 850 W), kulkas (Toshiba),
spektrofotometer UV-VIS (Unico uv-210), autoklaf (HL-36 AE Hiramaya), mikropipet nonfixed 1000 μl (finnpipette labsystem), laminar air flow, borer 6 mm, kulkas (Toshiba),
inkubator (WTB Binder), jangka sorong (Ticle ketelitian 0.05 mm)
Desain Penelitian
Digunakan rancangan percobaan Rancangan Acak Kelompok dengan 2 faktor dan 3
aras dalam penelitian ini, yaitu daya microwave (320, 560 dan 800 Watt) dan rasio
125
Antibakteri Ekstrak Kasar daun Gambir – Magdalena, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 3 No 1 p.124-135, Januari 2015
bahan:pelarut (1:25, 1:35, dan 1:45 (b/v)). Analisis data dilakukan dengan metode Analysis
of Varian (ANOVA) untuk mengetahui apakah ada perbedaan atau pengaruh pada tiap
perlakuan dan dilanjutkan dengan uji BNT atau DMRT dengan taraf nyata (α=0.05).
Pemilihan perlakuan terbaik dengan metode Zeleny.
Tahapan Penelitian
Penelitian dilakukan dalam dua tahap, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian
lanjutan. Hasil penelitian pendahuluan berupa jangkauan daya microwave 320 W (power
level 4) - 800 W (power level 10), rasio bahan:pelarut 1:25, 1:35 dan 1:45 (b/v), adanya
aktivitas antibakteri pada daun gambir dan kurva pertumbuhan 4 bakteri uji. Penelitian
lanjutan dilakukan untuk mengetahui pengaruh daya microwave dan rasio bahan:pelarut
terhadap rendemen ekstrak kasar, total fenol, aktivitas antibakteri dan KHM (Konsentrasi
Hambat Minimal) serta KBM (Konsentrasi Bunuh Minimal) dari perlakuan terbaik.
Metode
Metode yang digunakan untuk perhitungan rendemen ekstrak kasar daun gambir
Cubadak adalah metode gravimetri, analisis total fenol menggunakan metode
spektrofotometri, pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi sumuran (well
diffusion plate assay), serta pengujian KHM dan KBM ekstrak kasar daun gambir Cubadak
menggunakan metode dilusi.
Prosedur Analisis
1. Pembuatan Serbuk Daun Gambir Cubadak
Daun gambir Cubadak segar dari perkebunan Gambir di Medan, Sumatera Utara
dipanen pukul 08.00 WIB. Pemanenan daun dari tanaman gambir dilakukan pada umur 1.52 tahun dengan cara pemangkasan ujung ranting. Daun gambir diterima di Malang
keesokan harinya pada pukul 13.00 WIB. Daun segar 1 kg dicuci dan disortasi berdasarkan
warna hijau muda, utuh, segar dan posisi daun 4-5 dari ujung ranting. Daun gambir segar
dikeringkan dalam pengering kabinet suhu 60°C selama 4 jam. Daun gambir kering
dihancurkan dengan blender kering selama 5 menit, lalu diayak 60 mesh [8].
2. Pembuatan Ekstrak Kasar Daun Gambir Cubadak
Serbuk daun gambir Cubadak ditimbang 1 gram, dilarutkan dalam akuades dengan
perbandingan rasio bahan dan pelarut adalah 1:25, 1:35, dan 1:45, diradiasi pada 320 W
(power level 4) pada gelas beaker 250 ml transparan Pyrex selama 4 menit untuk masingmasing perlakuan. Kemudian diulang dengan waktu dan rasio bahan:pelarut yang sama
pada daya yang berbeda, yaitu 560 W (power level 7) dan 800 W (power level 10). Ekstrak
kasar disaring dua kali dengan dengan kertas saring halus, ditempatkan pada botol kaca
yang telah dilapisi aluminium foil dan disimpan pada lemari pendingin suhu 4°C [8].
3. Analisis Rendemen
Ditimbang massa awal (simplisia+akuades) sebelum diradiasi gelombang mikro,
ditimbang massa akhir (ekstrak kasar cair hasil penyaringan dua kali) dan dhitung rendemen
(% b/b) dengan persamaan [9]:
rendemen (%b/b) = massa akhir x 100 %
massa awal
4. Prosedur Pembuatan Kurva Standar Asam Galat
Dibuat larutan asam galat stok 1000 μg/ml, diencerkan hingga diperoleh larutan
asam galat 25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml dan 400 μg/ml, diambil 1 ml tiap
konsentrasi larutan asam galat, dimasukkan ke tabung reaksi, ditambahkan larutan Na2CO3
75 g/L 4 ml dan reagen Follin-Ciocalteau (diencerkan 1:10) 5 ml, divortex, diinkubasi 1 jam
suhu ruang dalam kondisi gelap, dipipet 2 ml ke kuvet untuk di ukur absorbasi pada panjang
gelombang (λ) 765 nm, dibuat kurva standar asam galat dengan x=konsentrasi larutan asam
galat dan y=absorbansi, dihitung persamaan regresi dan R2 [10].
126
Antibakteri Ekstrak Kasar daun Gambir – Magdalena, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 3 No 1 p.124-135, Januari 2015
5. Prosedur Analisis Total Fenol
Diukur sampel yang akan diuji dengan volume 1 ml, ditambahkan larutan Na2CO3 75
g/L 4 ml dan reagen Follin-Ciocalteau (diencerkan 1:10) 5 ml, divortex, diinkubasi selama 1
jam di suhu ruang pada kondisi gelap, diambil 2 ml ekstrak diisikan ke dalam kuvet, diukur
absorbansi pada panjang gelombang (λ) 765 nm, dikalibrasikan dengan kurva standar asam
galat untuk didapatkan total fenol dalam μg GAE/ml dan ihitung total fenol dalam μg GAE/g
dengan persamaan [10]:
C = CGAE x V
G
Keterangan:
C
= kadar total fenol (μg/g)
CGAE = kadar total fenol dalam bentuk ekuivalen asam galat (μg/ml)
V
= volume ekstrak yang dihasilkan (ml)
G
= massa bahan (g)
6. Pembuatan Kurva Pertumbuhan
Kultur murni E. coli ATCC 25922, S. typhimurium, S. aureus ATCC 29213 dan B.
cereus masing-masing diambil 1 koloni dari stok kultur NA miring yang telah diremajakan.
Diinokulasi pada NB steril 8 ml secara aseptis, diinkubasi suhu 37°C selama 24 jam dan
divortex. Sebanyak 2.5 ml kultur umur 24 jam diambil dan dimasukan ke dalam erlenmeyer
100 ml berisi 97.5 ml media NB steril. Kemudian diinkubasi pada shaker waterbath pada
suhu 37ºC dengan kecepatan 125 rpm. Setiap interval waktunya dilakukan pengambilan 2
ml untuk dilakukan pengukuran nilai absorbansi awal menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang (ʎ) 630 nm. Selanjutnya, diambil 1 ml untuk 3 seri pengenceran akhir
tertentu dengan larutan pepton, untuk ditumbuhkan pada media NA steril dengan metode
pour plate. Diinkubasi di inkubator suhu 37°C dan dilakukan perhitugan jumlah koloni
dengan metode SPC [11].
7. Prosedur Analisis Aktivitas Antibakteri
Nutrient agar 20 ml untuk tiap cawan yang telah disterilisasi, didinginkan hingga suhu
37ºC, ditumbuhkan E. coli ATCC 25922 umur 8.7 jam, S. typhimurium 6.7 jam, B. cereus 8.6
jam dan S.aureus ATCC 29213 umur 9.8 jam (dengan memastikan absorbansi sesuai kurva
pertumbuhan agar jumlah bakteri 107 CFU/ml) dengan memasukkan 40 μL metode pour
plate, diinkubasikan di suhu kamar pada laminar air flow hingga agar memadat, dibuat
sumuran (well) dengan borer 6 mm untuk tiap perlakuan, diisi ekstrak sampel tiap perlakuan
60 μL pada sumuran, diberikan waktu penyerapan ekstrak ke dalam media dengan
ditempatkan pada lemari pendingin 12 jam, diinkubasi suhu 37ºC selama 24 jam, diukur
diameter hambat setiap 1 jam dengan jangka sorong, diameter hambat adalah besarnya
diameter pengukuran dikurangi diameter sumuran [12].
8. Prosedur uji KHM (Konsentrasi Hambat Minimal)
Disiapkan ekstrak hasil perlakuan terbaik dengan konsentrasi 10-100%, disiapkan
NB steril 8.8 ml per tabung per konsentrasi ekstrak yang diuji untuk tiap bakteri,
ditambahkan ekstrak pada konsentrasi tertentu sebanyak 1 ml secara aseptis, ditambahkan
kultur bakteri E. coli ATCC 25922, S. typhimurium, S. aureus ATCC 29213 dan B. cereus
dalam NB (jumlah bakteri 106 CFU/ml) sebanyak 200 μl, divortex agar homogen, diambil 2
ml untuk diukur absorbansi awal λ=630 nm, diinkubasi 18 jam suhu 37°C, divortex, diukur
absorbansi akhir λ=630 nm, jika selisih absorbansi akhir dan awal negatif maka dinyatakan
sebagai tabung positif. KHM merupakan konsentrasi terendah dari tabung positif [11].
9. Prosedur uji KBM (Konsentrasi Bunuh Minimal) (Sari, 2010)
Ditumbuhkan bakteri pada hasil uji positif KHM metode pour plate (1 ml) pada NA
steril suhu 37°C, diinkubasi 18 jam suhu 37°C dan dilakukan pengamatan ada atau tidaknya
pertumbuhan koloni pada agar cawan. Tidak adanya pertumbuhan koloni dinyatakan
sebagai KBM [13].
127
Antibakteri Ekstrak Kasar daun Gambir – Magdalena, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 3 No 1 p.124-135, Januari 2015
HASIL DAN PEMBAHASAN
1.
Rerata Rendemen Ekstrak Kasar
Daya microwave akan memberikan pengaruh dengan menguapkan pelarut
(akuades), sehingga volumenya berkurang. Daya microwave memberikan panas yang
menyeluruh dalam sampel, dimana panas tersebut bertindak sebagai kekuatan pendorong
untuk menghancurkan matriks bahan sehingga senyawa-senyawa dalam bahan dapat
berdifusi keluar dan terurai di dalam pelarut [14]. Rasio bahan:pelarut juga memberikan
pengaruh pada rendemen ekstrak kasar yang dihasilkan. Semakin banyak volume pelarut
yang digunakan, maka rendemen ekstrak kasar yang dihasilkan semakin banyak pula.
Pengaruh daya microwave dan rasio bahan:pelarut pada rendemen ekstrak kasar (% b/b)
disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1. Diagram Pengaruh Daya Microwave dan Rasio Bahan:Pelarut terhadap Rerata
Rendemen Ekstrak Kasar Daun Gambir Cubadak
Berdasarkan Gambar 1, dapat terlihat bahwa kombinasi tiap perlakuan daya
microwave dan rasio bahan:pelarut memberikan hasil rerata rendemen ekstrak kasar yang
berbeda-beda. Nilai rerata rendemen ekstrak kasar tertinggi, yaitu sebesar 78.18% terdapat
pada perlakuan daya 320 W dan rasio bahan:pelarut 1:45 (b/v). Kombinasi perlakuan daya
320 W dan rasio bahan:pelarut 1:45 (b/v) dapat menghasilkan rerata rendemen ekstrak
kasar dengan perolehan yang lebih tinggi dibandingkan dengan kombinasi perlakuan
lainnya.
Perolehan rendemen tertinggi pada kombinasi perlakuan daya 320 W dan rasio
bahan:pelarut 1:45 (b/v) diduga panas yang dihasilkan dari perlakuan daya rendah hanya
menguapkan sedikit pelarut dan pemberian volume pelarut yang lebih tinggi menyebabkan
perpindahan panas menjadi lebih sulit. Tingginya jumlah rendemen yang diperoleh akibat
perlakuan tersebut adalah rendemen yang diharapkan. Namun, rendemen ekstrak cair yang
tinggi akan menghasilkan senyawa target (fenolik) yang rendah. Secara umum dengan
meningkatnya daya ekstraksi, maka rendemen senyawa target yang diekstrak meningkat,
namun akan menurun karena mengalami degradasi secara termal [15].
Kombinasi perlakuan daya rendah, yaitu sebesar 320 W dan rasio bahan:pelarut
1:45 (b/v) menghasilkan rendemen tertinggi, tetapi pada perlakuan tersebut senyawa fenolik
yang diharapkan belum terekstrak dengan baik. Adanya pelarut air yang berlebih
mengakibatkan terjadinya pembengkakan berlebih (excessive swelling) pada material yang
diekstraksi yang berakibat timbulnya thermal stress yang berlebih yang disebabkan oleh
timbulnya panas yang cepat pada larutan akibat dari penyerapan gelombang mikro oleh air.
Thermal stress yang berlebih akan berakibat negatif terhadap senyawa-senyawa fitokimia
[16].
Berdasarkan analisis ragam, ditunjukkan bahwa perlakuan daya microwave, rasio
bahan:pelarut, serta interaksi antar perlakuan memberikan pengaruh yang nyata (α=0.05)
terhadap rerata rendemen ekstrak yang dihasilkan.
128
Antibakteri Ekstrak Kasar daun Gambir – Magdalena, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 3 No 1 p.124-135, Januari 2015
2.
Total Fenol
Pengaruh daya microwave dapat dilihat dari seberapa besar energi panas (Joule)
per detik yang diberikan pada bahan, sedangkan rasio bahan:pelarut mempengaruhi proses
kontak antara partikel dalam bahan dengan banyaknya pelarut yang digunakan. Gelombang
mikro berperan sebagai vektor energi kepada bahan yang mampu menyerap energi
elektromagnetik dan mengubahnya menjadi panas [6]. Panas tersebut akan membantu
proses pemecahan matriks sel daun gambir Cubadak, sehingga senyawa antibakteri
(katekin dan tanin) yang diharapkan dapat diekstrak oleh pelarut (akuades) dan dapat
terlihat dari total fenol yang diperoleh. Pengujian total fenol pada setiap perlakuan
percobaan diperoleh dengan nilai total fenol dalam satuan μg/g (berdasarkan per satu gram
bahan) atau ppm (part per million) GAE (Gallic Acid Equivalent). Hasil uji total fenol ekstrak
kasar akibat pengaruh perlakuan daya microwave dan rasio bahan:pelarut disajikan pada
Gambar 2.
Gambar 2. Diagram Pengaruh Daya Microwave dan Rasio Bahan:Pelarut terhadap Rerata
Total Fenol
Berdasarkan Gambar 2, dapat diketahui bahwa nilai rerata total fenol tertinggi
diperoleh dari proses ekstraksi dengan perlakuan daya 560 W dan rasio bahan:pelarut 1:35
(b/v), yaitu 5581.581 ppm. Hal ini membuktikan bahwa kombinasi perlakuan tersebut
menghasilkan total fenol yang paling tinggi dibandingkan dengan kombinasi perlakuan
lainnya. Waktu ekstraksi yang dilakukan selama proses pengekstraksian menggunakan
MAE tersebut adalah 4 menit pada setiap perlakuan. Waktu 4 menit adalah waktu terbaik
untuk bahan (daun gambir Cubadak) kontak dengan energi panas pada daya 510 W [17].
Perlakuan daya 560 W menjadi perlakuan daya ekstraksi terbaik dibandingkan daya
lainnya dan diduga dapat memecah matriks sel daun gambir Cubadak dengan efektif akibat
energi panas hasil penyerapan energi elektromagnetik oleh bahan, sehingga pelarut
akuades mampu melarutkan maupun mengekstrak senyawa fenolik dalam matriks sel daun
gambir Cubadak dengan baik. Peningkatan panas radiasi gelombang mikro memanaskan
dan menguapkan air sel bahan. Tekanan pada dinding sel meningkat, menyebabkan
peningkatan volume yang akan membuat sel pecah, melepaskan isinya ke dalam fase
cairan. Ketika fase cair menyerap gelombang mikro, energi kinetik molekul meningkat,
sehingga laju difusi meningkat dan menghasilkan transfer massa yang lebih cepat. Namun,
perlakuan daya yang terlalu tinggi dapat mengakibatkan energi panas yang terbentuk
menjadi berlebihan, sehingg senyawa fenolik dalam bahan menjadi rusak atau terdegradasi
[18].
Rasio bahan:pelarut 1:35 (b/v) merupakan perlakuan yang paling baik karena
terjadinya kontak bahan dengan pelarut lebih efektif daripada penggunaan volume pelarut
25 ml dan 45 ml, sehingga total fenol yang dihasilkan lebih tinggi. Selain itu, pada rasio
bahan:pelarut 1:25 (b/v) terjadi perubahan suhu yang lebih cepat dan lebih tinggi
dibandingka rasio bahan:pelarut 1:35 (b/v) dan 1:45 (b/v), sehingga mengakibatkan
tingginya kerusakan senyawa fenolik dalam bahan secara termal. Rasio optimal dari pelarut
pada rasio bahan atau padatan menjamin kehomogenan dan pemanasan yang efektif.
129
Antibakteri Ekstrak Kasar daun Gambir – Magdalena, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 3 No 1 p.124-135, Januari 2015
Pelarut yang berlebihan menyebabkan pemanasan microwave menjadi kurang baik,
sehingga radiasi microwave diserap oleh pelarut dan penambahan daya dibutuhkan [14].
Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa perlakuan daya microwave, rasio
bahan:pelarut, serta interaksi antar perlakuan memberikan pengaruh yang nyata (α=0.05)
terhadap rerata total fenol ekstak kasar daun gambir Cubadak yang diperoleh.
3.
Aktivitas Antibakteri
Berdasarkan hasil analisis ragam, perlakuan daya microwave, rasio bahan:pelarut
dan interaksi antar perlakuan memiliki pengaruh nyata (α=0.05) terhadap rerata diameter
hambat yang terbentuk. Daya microwave dan rasio bahan:pelarut merupakan faktor dalam
MAE yang mempengaruhi hasil ekstraksi, khususnya total fenol. Terdapat korelasi positif
antara total komponen fenol dengan aktivitas antibakteri [19]. Rerata diameter daya hambat
bakteri uji tiap perlakuan disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Rerata Diameter Daya Hambat Bakteri Uji pada Tiap Perlakuan
Perlakuan
Rerata Diameter Daya Hambat (mm)*
Rasio
Daya
E. coli
S. typhimurium
S. aureus
B. cereus
Bahan:Pelarut
(W)
ATCC 25922
ATCC 29213
(b/v)
1:25
320
7.45 b
7.65 b
7.74 b
8.66 b
1:25
560
8.79 d
9.24 cd
9.04 c
10.01 c
1:25
800
6.62 a
6.64 a
6.79 a
7.74 a
1:35
320
9.64 e
9.84 d
10.8 d
11.19 d
1:35
560
12.07 g
12.57 f
13.99 e
14.38 e
1:35
800
8.12 c
8.60 c
9.19 c
9.24 bc
1:45
320
8.28 cd
8.96 c
9.31 c
9.55 bc
1:45
560
10.39 f
10.65 e
11.53 d
11.72 d
1:45
800
7.40 b
7.71 b
8.24 b
8.17 ab
Keterangan : * Angka yang didampingi huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata
(α=0.05) pada tiap bakteri
Berdasarkan Tabel 1, dapat dilihat bahwa rerata diameter daya hambat yang paling
tinggi pada setiap bakteri uji ditunjukkan pada perlakuan daya 560 W dengan rasio
bahan:pelarut 1:35 (b/v). Hal ini membuktikan bahwa proses ekstraksi serbuk daun gambir
Cubadak yang dilakukan pada rasio bahan:pelarut 1:35 (b/v) dengan daya sebesar 560 W
dapat mengoptimalkan perolehan senyawa fenolik yang bersifat antibakteri (katekin dan
tanin), sehingga aktivitas antibakteri yang dihasilkan memiliki pengaruh yang optimal pula.
Daya 560 W diduga merupakan perlakuan daya terbaik yang dapat memecah sel
daun gambir, sehingga senyawa antibakteri yang diharapkan dapat diperoleh dengan jumlah
yang lebih tinggi. Dalam ekstraksi tanaman, daya microwave yang tinggi dapat
menyebabkan hasil ekstraksi yang buruk akibat degradasi senyawa-senyawa yang sensitif
terhadap panas. Pada daya microwave yang tinggi, yaitu 1000 W dalam ekstraksi flavonoid
dari akar Radix astragali, yield ekstraksi menurun jika suhu ekstraksi lebih tinggi dari 110ºC
dikarenakan ketidakstabilan flavonoid pada suhu-suhu tersebut. Paparan gelombang mikro
yang berlebihan pada microwave akan menyebabkan hilangnya flavonoid akibat degradasi
termal [20].
Rasio bahan:pelarut 1:35 (b/v) menjadi perlakuan yang paling optimal dikarenakan
kontak bahan dengan pelarut yang terjadi lebih efektif bila dibandingkan dengan rasio
bahan:pelarut 1:25 (b/v) dan 1:45 (b/v). Pada perlakuan rasio bahan:pelarut 1:25 (b/v),
kontak antara partikel dalam pelarut lebih kecil dibandingkan dengan perlakuan lain.
Tejadinya penurunan aktivitas antibakteri pada perlakuan rasio bahan:pelarut 1:45 (b/v)
dikarenakan semakin banyak pelarut yang ditambahkan hanya akan melakukan proses
130
Antibakteri Ekstrak Kasar daun Gambir – Magdalena, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 3 No 1 p.124-135, Januari 2015
pengenceran. Semakin besar perbandingan bahan dengan pelarut maka proses pelarutan
semakin baik karena kontak antara partikel dalam bahan pelarut semakin sering, namun
jumlah pelarut yang berlebihan tidak akan mengekstrak lebih banyak [21].
Berdasarkan Tabel 1, dapat diketahui pula tingkat kerentanan bakteri uji, dimana
rerata diameter daya hambat bakteri Gram negatif (Escherichia coli ATCC 25922,
Salmonella typhimurium) cenderung lebih kecil daripada rerata diameter daya hambat pada
bakteri Gram positif (Staphylococcus aureus ATCC 29213, Bacillus cereus). Nilai rerata
diameter daya hambat yang semakin kecil menunjukkan bahwa bakteri uji tersebut memiliki
tingkat keresistensian yang lebih tinggi.
Perbedaan aktivitas antibakteri yang terjadi pada bakteri Gram negatif dan bakteri
Gram positif kemungkinan disebabkan oleh perbedaan komposisi dan struktur dinding sel
pada kedua jenis bakteri tersebut. Struktur dinding sel bakteri gram positif lebih sederhana,
yaitu berlapis tunggal dengan kandungan lipid yang rendah (1-4%) sehingga memudahkan
bahan bioaktif masuk ke dalam sel. Struktur dinding sel bakteri gram negatif lebih kompleks,
berlapis tiga, yaitu lapisan luar lipoprotein, lapisan tengah lipopolisakarida yang berperan
sebagai penghalang masuknya bahan bioaktif antibakteri, dan lapisan dalam berupa
peptidoglikan dengan kandungan lipid tinggi (11-12%) [22].
Kandungan flavonoid pada ekstrak kasar daun gambir Cubadak sangat efektif untuk
menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dibandingkan bakteri Gram negatif.
Flavonoid bersifat polar sehingga lebih mudah menembus lapisan peptidoglikan yang juga
bersifat polar pada bakteri Gram positif daripada lapisan lipid yang nonpolar pada bakteri
Gram negatif. Di samping itu, pada dinding sel Gram positif mengandung polisakarida (asam
terikoat) merupakan polimer yang larut dalam air. Sifat larut inilah yang menunjukkan bahwa
dinding sel Gram positif bersifat lebih polar [11]. Aktivitas penghambatan senyawa
antibakteri pada ekstrak kasar daun Gambir Cubadak terhadap bakteri Gram positif
menyebabkan terganggunya fungsi dinding sel sebagai pemberi bentuk sel dan melindungi
sel dari lisis osmotik. Dengan terganggunya dinding sel akan menyebabkan lisis pada sel.
4.
Konsentrasi Hambat Minimal (KHM)
Pada penelitian ini diperoleh perlakuan terbaik, yaitu daya microwave 560 W dan
rasio bahan:pelarut 1:35 (b/v). Pada perlakuan tersebut, dapat dilakukan uji Konsentrasi
Hambat Minimal (KHM) pada hasil proses ekstraksi untuk mengetahui toksisitas selektif
bahan aktif antimikroba serta konsentrasi minimal yang dapat menghambat pertumbuhan
bakteri uji. Pertumbuhan bakteri dapat diketahui dengan mengukur selisih antara absorbansi
sebelum dan sesudah inkubasi. Jumlah sel bakteri dapat diukur dengan cara mengetahui
kekeruhan (turbiditas) kultur [11]. Hasil pengukuran absorbansi pada uji KHM ekstrak kasar
daun gambir Cubadak pada setiap bakteri uji dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil Pengukuran Absorbansi pada Uji KHM Ekstrak Kasar Daun Gambir pada
Bakteri Uji
Nilai Absorbansi
Konsentrasi
Bakteri Uji
Sebelum
Setelah
Ekstrak (%)
ΔOD
Inkubasi
Inkubasi
Escherichia coli
10
0.02
0.55
0.53
ATCC 25922
20
0.05
0.52
0.47
30
0.06
0.46
0.40
40
0.07
0.42
0.36
50
0.07
0.36
0.29
60
0.11
0.37
0.26
70
0.13
0.32
0.19
80
0.18
0.25
0.08
90
0.20
0.22
0.02
100
0.23
0.22
-0,02
131
Antibakteri Ekstrak Kasar daun Gambir – Magdalena, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 3 No 1 p.124-135, Januari 2015
Salmonella typhimurium
Staphylococcus aureus
ATCC 29213
Bacillus cereus
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0.03
0.04
0.05
0.07
0.11
0.12
0.14
0.20
0.22
0.23
0.03
0.03
0.05
0.06
0.08
0.09
0.12
0.17
0.20
0.22
0.03
0.04
0.05
0.07
0.09
0.10
0.12
0.16
0.20
0.22
0.51
0.47
0.49
0.41
0.35
0.29
0.27
0.24
0.22
0.22
0.48
0.41
0.36
0.29
0.32
0.28
0.23
0.21
0.19
0.20
0.42
0.38
0.36
0.32
0.27
0.22
0.19
0.15
0.17
0.17
0.48
0.43
0.43
0.34
0.25
0.17
0.13
0.04
-0.01
-0.01
0.45
0.38
0.31
0.23
0.25
0.18
0.11
0.04
-0.01
-0.02
0.39
0.35
0.31
0.25
0.18
0.12
0.07
-0.01
-0.03
-0.04
Tabel 2 menunjukkan bahwa hasil uji KHM ekstrak kasar daun gambir Cubadak
perlakuan terbaik dengan bakteri uji Escherichia coli ATCC 25922 memiliki kemampuan
menghambat pada konsentrasi ekstrak 100%. Pada bakteri uji Salmonella typhimurium dan
Staphylococus aureus ATCC 29213, konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat
masing-masing pertumbuhannya adalah 90% dan 100%. Pada bakteri uji Bacillus cereus,
konsentrasi ekstrak 80%, 90%, dan 100% sudah mampu menghambat pertumbuhannya.
Konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat suatu pertumbuhan bakteri uji ditunjukkan
dengan nilai ΔOD yang negatif, dimana nilai absorbansi setelah inkubasi lebih kecil daripada
nilai absorbansi sebelum inkubasi. Pada konsentrasi dengan nilai ΔOD positif menandakan
bahwa ekstrak kasar daun gambir Cubadak pada konsentrasi tersebut belum mampu
menghambat pertumbuhan bakteri uji. Semakin tinggi konsentrasi suatu zat antimikroba
semakin tinggi zat antimikrobanya, artinya banyak bakteri akan terhambat atau terbunuh
lebih cepat bila konsentrasi zat tersebut lebih tinggi [23]. Berdasarkan hasil tersebut, dapat
disimpulkan bahwa konsentrasi ekstrak 80% sudah mampu menghambat pertumbuhan
Bacillus cereus, konsentrasi ekstrak 90% sudah mampu menghambat pertumbuhan
Salmonella typhimurium dan Staphylococus aureus ATCC 29213, sedangkan pertumbuhan
Escherichia coli ATCC 25922 baru mampu dihambat pada konsentrasi ekstrak 100%.
132
Antibakteri Ekstrak Kasar daun Gambir – Magdalena, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 3 No 1 p.124-135, Januari 2015
5.
Konsentrasi Bunuh Minimal (KBM)
Konsentrasi Bunuh Minimal (KBM) merupakan konsentrasi terendah dari hasil positif
uji Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) yang dapat membunuh bakteri uji. Kemampuan daya
bunuh yang dimiliki suatu senyawa antibakteri pada ekstrak dapat diketahui dengan adanya
uji KBM dengan melihat pada konsentrasi minimal berapakah dari ekstrak perlakuan terbaik
yang mampu membunuh bakteri uji. Hasil positif uji KHM diperoleh dari seluruh konsentrasi
yang menunjukkan nilai selisih OD adalah 0 atau kurang dari 0 (ΔOD ≤0), sedangkan hasil
positif KBM ditunjukkan dengan tidak adanya koloni bakteri yang tumbuh dari konsentrasi
ekstrak positif uji KHM pada media agar (Nutrient Agar) setelah inkubasi 18 jam. Berikut
dapat dilihat hasil uji Konsentrasi Bunuh Minimal (KBM) dari hasil uji Konsentrasi Hambat
Minimal (KHM) pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil Uji Konsentrasi Bunuh Minimal (KBM)
Bakteri Uji
Konsentrasi
Hasil Uji KBM
Positif Hasil Uji
(Tumbuh/Tidak)
KHM (%)
Escherichia coli ATCC 25922
100
Tumbuh
Salmonella typhimurium
90
Tumbuh
100
Tumbuh
Staphylococcus aureus ATCC 29213
90
Tumbuh
100
Tumbuh
Bacillus cereus
80
Tumbuh
90
Tumbuh
100
Tumbuh
Berdasarkan Tabel 3, dapat terlihat bahwa senyawa antibakteri pada ekstrak kasar
daun gambir Cubadak dengan konsentrasi ekstrak hasil uji positif KHM belum mampu
membunuh masing-masing bakteri uji. Hal ini ditunjukkan dengan masih adanya
pertumbuhan bakteri Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium,
Staphylococcus aureus ATCC 29213 dan Bacillus cereus pada seluruh agar cawan,
sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak kasar daun gambir Cubadak tidak bersifat
membunuh (bakteriosida), tetapi hanya bersifat menghambat (bakteriostatik) pertumbuhan
setiap bakteri uji. Senyawa antibakteri tertentu aktivitasnya dapat meningkat dari
bakteriostatik menjadi bakteriosida bila kadar senyawa antibakterinya ditingkatkan [24].
Penanaman larutan hasil uji positif KHM pada media pertumbuhan baru (NA) yang tidak
terdapat senyawa penghambat menunjukkan hasil pertumbuhan koloni bakteri yang
mencapai tingkat TBUD (Terlalu Banyak Untuk Dihitung) pada jam ke-18. Hal ini
membuktikan bahwa senyawa fenolik dalam ekstrak kasar daun gambir Cubadak masih
belum mampu membunuh setiap pertumbuhan masing-masing bakteri. Kemungkinan
konsentrasi total fenol yang lebih tinggi diperlukan, sehingga mampu membunuh bakteri uji.
SIMPULAN
Kombinasi perlakuan daya microwave 560 W dan rasio bahan:pelarut 1:35 (b/v)
merupakan perlakuan terbaik berdasarkan hasil uji rendemen, total fenol dan aktivitas
antibakteri terhadap bakteri uji Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium,
Staphylococcus aureus ATCC 29213 dan Bacillus cereus, yang dihasilkan dari ekstrak kasar
daun gambir Cubadak. Pada perlakuan terbaik tersebut, diperoleh nilai rendemen 63.29%,
total fenol 5581.581 ppm, aktivitas antibakteri (diameter daya hambat) terhadap Escherichia
coli ATCC 25922 12.07 mm, Salmonella typhimurium 12.57 mm, Staphylococcus aureus
ATCC 29213 13.99 mm dan Bacillus cereus 14.38 mm.
Hasil uji Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) pada ekstrak kasar daun gambir
Cubadak perlakuan terbaik dengan bakteri uji Escherichia coli ATCC 25922 memiliki
133
Antibakteri Ekstrak Kasar daun Gambir – Magdalena, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 3 No 1 p.124-135, Januari 2015
kemampuan menghambat pada konsentrasi ekstrak 100%, Salmonella typhimurium pada
konsentrasi ekstrak 90%, Staphylococus aureus pada konsentrasi ekstrak 90% dan Bacillus
cereus pada konsentrasi ekstrak 80%. Sedangkan Konsentrasi Bunuh Minimal (KBM) belum
dapat diketahui.
DAFTAR PUSTAKA
1) Isnawati, A. 2010. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif Senyawa Katekin dan Kuersetin
pada 3 Mutu Ekstrak Gambir. Pusat Penelitian dan Pengembangan Biomedis dan
Farmasi Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Departemen Kesehatan RI.
Jakarta
2) Nazir, M. 2000. Gambir: Budidaya, Pengolahan dan Prospek Diversifikasinya. Yayasan
Hutanku. Padang
3) Murti, K. 2004. Analisis Status Hara N, P, K dalam Hubungannya dengan Hasil Tanaman
Gambir (Uncaria gambir. Roxb) di Siguntur Pesisir Selatan, Sumatera Barat. Stigma XIII,
177-180
4) Hidayani, R. 2010. Pengaruh Penggunaan Pelarut Etanol dan Etil Asetat pada Ekstraksi
Daun Gambir (Uncaria gambir Roxb.) Terhadap Aktivitas Antibakteri Patogen Pangan.
Skripsi. Universitas Andalas. Padang
5) Salas, P.G., Aranzazu M.-S., Antonio S.-C., and Alberto F.-G. 2010. PhenolicCompound-Extraction Systems for Fruit and Vegetable Samples. Molecules, 15, pp.
8813-8826
6) Jain, T., Jain V., Pandey R., Vyas A., and Shukla S.S. 2009. Microwave Assisted
Extraction for Phytoconstituents–An Overview. Asian Journal Research Chemistry 1(2):
19-25
7) Dhobi, M., Mandal V., and Hemalatha S. 2009. Optimization of Microwave Assisted
Extraction of Bioactive Flavonolignan-Silybinin. Journal of Chemical Metrology 1(3): 1323
8) Rao, K., Aradhana R., Banjii D., Chaitanya R., and Kumar A.A. 2011. In-Vitro AntiOxidant and Free Radical Scavenging Activity of Various Extracts of Tectona grandis
Linn Leaves. Journal of Pharmacy Research 2(4): 440-442
9) Widyawati, S.P., Wijaya C.H., Hardjosworo P.S., dan Sajuthi D. 2005. Evaluasi Aktivitas
Antioksidatif Ekstrak Daun Beluntas (Pluchea indica Less) Berdasarkan Perbedaan
Ruas Daun. Institut Pertanian Bogor. Bogor
10) Sharma, G.N. 2011. Phytochemical Screening and Estimation of Total Phenolic Content
in Aegle marmelos Seeds. International Journal of Pharmaceutical and Clinical Research
2(3): 27-29
11) Dewi, F.K. 2010. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Buah Mengkudu (Morinda citrifolia,
Linnaeus) terhadap Bakteri Pembusuk Daging Segar. Skripsi. Universitas Sebelas
Maret. Surakarta
12) Jagessar, R., Mars A., and Gomes G. 2008. Selective Antimicrobial Properties of
Phyllanthus acidus Leaf Extract Against Candida albicans, Escherichia coli and
Staphylococcus aureus Using Stokes Disc Diffusion, Well Diffusion, Streak Plate and a
Dilution Method. Nature and Science 2(6): 24-38
13) Sari, N. 2010. Daya Antibakteri Ekstrak Tumbuhan Majapahit (Crescentia cujete L.)
terhadap Bakteri Aeromonas hydrophila. Skripsi. Institut Teknologi Sepuluh November.
Surabaya
14) Chan, C.-H., Rozita Y., Gek-Cheng N., and Fabian W.-L.K. 2011. Microwave-Assisted
Extractions of Active Ingredients from Plants. Journal of Chromatography A, 1218: 62136225
15) Mandal, V., Mohan Y., and Hemalatha S. 2007. Microwave Assisted Extraction-An
Innovative and Promissing Extraction Tool for Medicinal Plant Research.
Pharmacognosy Reviews 1(1): 18
134
Antibakteri Ekstrak Kasar daun Gambir – Magdalena, dkk
Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 3 No 1 p.124-135, Januari 2015
16) Wang, Y.L., Xi G.S., Zheng Y.C., and Miao F.S. 2010. Microwave Assisted Extraction of
Flavonoids from Chinese Herb Radix puerariae (Ge Gen). Journal of Medicinal Plant
Research 4(4): 304-308
17) Ferdiyan, Y. 2013. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kasar Daun Gambir Cubadak (Uncaria
gambir var Cubadak) Metode Microwave-Assisted Extraction (Kajian Daya Microwave
dan Waktu Ekstraksi). Skripsi. Universitas Brawijaya. Malang
18) Calinescu, I., Ciuculescu C., Popescu M., Bajenaru S., and Epure G. 2001. Microwave
Assisted Extraction of Active Principles from Vegetal Material. Romanian International
Conference on Chemistry and Chemical Engineering, 12: 1-6
19) Inna, M., Atmania N., dan Prismasari S. 2010. Potential Use of Cinnamomum burmanii
Essential Oil-based Chewing Gum as Oral Antibiofilm Agent. Journal of Dentistry
Indonesia 17(3): 80-86
20) Xiao, W., Lujia H., and Bo S. 2008. Microwave-Assisted Extraction of Flavonoids from
Radix Astragali. Separation and Purification Technology, 62: 614–618
21) Setiawan, C. 2012. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kasar Daun Jati Mas (Tectona grandis)
Metode Microwave-Assisted Extraction terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus
aureus (Kajian Waktu Ekstraksi dan Rasio Pelarut:Bahan). Skripsi. Universitas
Brawijaya. Malang
22) Salni, Hanifa M., dan Ratna W.M. 2011. Isolasi Senyawa Antibakteri dari Daun Jengkol
(Pithecolobium lobatum Benth) dan Penentuan Nilai KHM-nya. Jurnal Penelitian Sains
14(1): 38-41
23) Haniah, M. 2008. Isolasi Jamur Endofit dari Daun Sirih (Piper Betle L.) Sebagai
Antimikroba terhadap Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Candida albicans.
Skripsi. Universitas Islam Negeri. Malang
24) Mulyati, E.S. 2009. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etil Asetat Daun Ceremai
(Phyllanthus Acidus (L.) Skeels) terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli
dan Bioautografinya. Skripsi. Universitas Muhammadiyah. Surakarta
135