DISERTASI PROGRAM STUDI S3 ILMU KEDOKTERAN FAKULTAS

ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Diterbitkan untuk Ujian Tahap II (Terbuka)
DISERTASI
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA (Punica granatum L)
TERSTANDAR TERHADAP DEGRADASI SEL MUKOSA RONGGA
MULUT MENCIT YANG MENGALAMI TRANSFORMASI MELALUI
EKSPRESI BCL-2, VEGF, Wild p53 DAN APOPTOSIS
(Studi Eksperimental Pada Hewan Model Transformasi Sel)
SRI HERNAWATI
PROGRAM STUDI S3 ILMU KEDOKTERAN
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2012
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
DISERTASI
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA (Punica granatum L)
TERSTANDAR TERHADAP DEGRADASI SEL MUKOSA RONGGA
MULUT MENCIT YANG MENGALAMI TRANSFORMASI MELALUI
EKSPRESI BCL-2, VEGF, Wild p53 DAN APOPTOSIS
(Studi Eksperimental Pada Hewan Model Transformasi Sel)
SRI HERNAWATI
PROGRAM STUDI S-3 ILMU KEDOKTERAN
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2012
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
PRASYARAT GELAR DOKTOR
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA (Punica granatum L)
TERSTANDAR TERHADAP DEGRADASI SEL MUKOSA RONGGA
MULUT MENCIT YANG MENGALAMI TRANSFORMASI MELALUI
EKSPRESI BCL-2, VEGF, Wild p53 DAN APOPTOSIS
(Studi Eksperimental Pada Hewan Model Transformasi Sel)
DISERTASI
Untuk Memperoleh Gelar Doktor
Dalam Program Studi S3 Ilmu Kedokteran
Pada Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga
Dan Dipertahankan Di hadapan Panitia Ujian Doktor Tahap II (Terbuka)
Oleh :
SRI HERNAWATI
090970133
PROGRAM STUDI S-3 ILMU KEDOKTERAN
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2012
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
LEMBAR PENGESAHAN
Telah Disetujui Untuk Ujian Doktor Tahap II (Terbuka)
pada tanggal 21 September 2012
Oleh
Promotor :
Prof. Dr. Fedik Abdul Rantam, Drh
Nip. 19591003 198701 1 001
Ko Promotor I
Ko Promotor II
Dr. I Ketut Sudiana, Drs. M.Si
Nip : 19550705 198003 1 005
Dr. A. Retno Pudji Rahayu, drg,M.Si
Nip. 19591114 198603 2 002
Mengetahui
Ketua Program Studi Ilmu Kedokteran
Program Pasca Sarjana Universitas Airlangga
Prof. Dr. Teddy Ontoseno,dr.SpA(k)Spjp.,AKK
Nip. 19501216 197703 1 002
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Disertasi ini telah diuji dan dinilai
oleh panitia penguji pada ujian Tertutup (Tahap I)
Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Pada Tanggal 17 September 2012
Panitia Penguji :
Ketua
: Prof. M.Coen Pramono D.,drg.,S.U.,Sp.BM
Anggota :
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Prof. Dr. Fedik Abdul Rantam, drh
Dr. I Ketut Sudiana, MS
Dr. A. Retno Pudji Rahayu, drg.,M.Kes
Dr. Hari Basuki Notobroto, M.Kes.,dr
Dr. Iwan Hernawan, drg.,M.Kes.,Sp.PM
Prof. Dr. Aulanni’am, Drh., DES
Ditetapkan dengan Surat Keputusan
Dekan Fakultas Kedokteran
Universitas Airlangga
Nomor : 182/H3.1.1/KD/2012
Tanggal : 11 September 2012
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
UCAPAN TERIMA KASIH
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat ALLAH SWT atas segala rahmat
dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan disertasi dengan judul
“Mekanisme Kerja Ekstrak Buah Delima (Punica granatum L) Terstandar
Terhadap Degradasi Sel Mukosa Rongga Mulut Mencit Yang Mengalami
Transformasi Melalui Ekspresi BCL-2, VEGF, Wild p53 dan Apoptosis”
Penelitian Disertasi ini menjadi salah satu persyaratan yang harus ditempuh oleh
mahasiswa Program Pendidikan S-3 Ilmu Kedokteran di Universitas Airlangga.
Disertasi ini dapat diselesaikan berkat dorongan, bimbingan, arahan, saran
dan perbaikan dari banyak pihak. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati,
perkenankan saya menghaturkan terimakasih yang tulus serta penghargaan yang
setinggi-tingginya kepada yang terhormat :
Prof. Dr. Fedik Abdul Rantam, Drh. selaku promotor yang dengan penuh
perhatian telah meluangkan waktu, memberikan dorongan semangat dengan
penuh kesabaran, memberikan bimbingan dan saran sehingga ujian disertasi ini
dapat diselesaikan.
Dr. I Ketut Sudiana, Drs. M.Si, selaku Ko-Promotor I yang dengan penuh
perhatian dan kesabaran, telah memberikan dorongan, bimbingan dan saran,
sehingga ujian Disertasi ini dapat diselesaikan.
Dr. A. Retno Pudji Rahayu, drg, M.Si. selaku Ko-Promotor II yang dengan
penuh perhatian dan kesabaran, telah memberikan dorongan, bimbingan dan
saran, sehingga ujian disertasi ini dapat diselesaikan.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya juga saya haturkan kepada :
Rektor Universitas Airlangga, Prof. Dr. H. Fasich, Apt. yang telah memberi
kesempatan kepada saya untuk mengikuti pendidikan Program Doktor pada
Program Ilmu Kedokteran Pascasarjana Universitas Airlangga Surabaya.
Prof. Dr. Agung Pranoto, dr., M.Kes., SpPD.,KEM.,FINASIN Dekan
Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga yang telah memberi kesempatan
kepada saya untuk mengikuti Pendidikan Program Doktor pada Program Ilmu
Kedokteran Pascasarjana Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Surabaya.
Direktur Program Pascasarjana, Prof .Dr.Hj.Sri Hajati,SH.,MS., beserta
seluruh pimpinan dan staf Program Pascasarjana Universitas Airlangga atas
kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada saya untuk menjadi mahasiswa
Program Doktor pada Program Ilmu Kedokteran Pascasarjana Universitas
Airlangga.
Prof. Dr. Teddy Ontoseno, dr. SpA(k)Spjp.,AKK, selaku Ketua Program
Studi Program Doktor Ilmu Kedokteran Pascasarjana Universitas Airlangga yang
telah banyak membantu dalam kelancaran proses pelaksanaan ujian disertasi ini.
Rektor Universitas Jember dan Dekan Fakultas Kedokteran Gigi Universitas
Jember yang telah banyak membantu saya dalam menempuh Program Doktor
pada Program Pascasarjana Universitas Airlangga.
Prof. M. Coen Pramono D., drg., SU., Sp. BM, Dr. Hari Basuki Notobroto,
Mkes, dr, Dr. Iwan Hernawan, drg.,M.Kes.,Sp.PM, Prof. Dr. Aulanni’am, Drh.,
DES, Prof. Dr. Sukardiman., Drs., M.S yang telah banyak memberikan saran dan
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
bimbingan yang sangat berharga mulai penyusunan pra usulan penelitian hingga
penyusunan disertasi ini.
Para dosen pengajar S-3 Kedokteran dan karyawan di laboratorium
biokimia, laboratorium mikroskop elektron Gramik Fakultas Kedokteran
Universitas Airlangga.
Terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Kementerian
Pendidikan Nasional yang telah memberikan Beasiswa Pendidikan Pascasarjana
demi kelancaran studi saya.
Teman-teman angkatan 2009/2010 pendidikan Program Doktor Bidang Ilmu
Kedokteran pada Program Pascasarjana Universitas Airlangga. Selama ini kita
telah saling menemani, memotivasi, mengingatkan dan memberi masukan yang
semuanya memberi nilai tambah dalam rangkaian penyusunan disertasi ini.
Pada kesempatan ini saya menyampaikan terimakasih ,rasa hormat dan
penuh kasih kepada :
Orangtua saya, ayahanda tercinta Samiruddin (Alm) dan ibunda Sunaryati,
tidak lupa kepada seluruh saudara dan keluarga besar saya ucapkan terimakasih
yang tak terhingga. Terimakasih atas semua kebaikan dan doa yang telah
diberikan.
Suami saya, Rahardja Putranto,drg.,M.Mkes tercinta, yang hingga saat ini
mendampingi saya menjalani kehidupan, memberikan dorongan. Kepada anakanakku tercinta Amelia Clarissa Putranto dan Safira Rahmaningtyas Putranto,
terima kasih banyak atas cinta dan pengorbanan yang telah kalian berikan selama
ini.Mama mohon maaf atas berkurangnya waktu kebersamaan selama Mama
menyelesaikan pendidikan.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Saya ucapkan terima kasih pada semua pihak yang telah membantu dalam
terselesaikannya disertasi ini. Saya berharap disertasi ini akan dapat memberikan
manfaat bagi masyarakat, khususnya bagi pengembangan dunia pendidikan dan
kesehatan. Semoga Allah SWT melimpahkan taufik dan hidayah-Nya kepada
semua pihak yang telah membantu penyelesaian disertasi ini. Amien Ya Rabbal
Allamin.
Surabaya,
September 2012
Penulis
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
RINGKASAN
Mekanisme Kerja Ekstrak Buah Delima
(Punica granatum L) Terstandar Terhadap Degradasi Sel Mukosa Rongga
Mulut Mencit Yang Mengalami Transformasi Melalui Ekspresi BCL-2,
VEGF, Wild p53 Dan Apoptosis
Karsinoma sel skuamosa rongga mulut adalah kanker urutan keenam di
dunia, setiap tahun angka kejadiannya semakin meningkat. Di negara
berkembang, kejadian ini mempunyai angka yang tinggi. Kemajuan di bidang
bedah, radiasi dan kemoterapi telah berkembang dengan pesat, tetapi hasilnya
masih relatif belum menggembirakan. Pasien yang mempunyai umur panjang
kurang dari 50%. Terjadinya kanker bisa disebabkan karena hambatan apoptosis.
Apoptosis merupakan suatu mekanisme yang efisien untuk mengeliminasi sel
yang tidak diperlukan dan mungkin berbahaya sehingga dapat menyelamatkan
organisme. Delima (PGL) salah satu tanaman obat yang memiliki aktivitas
sebagai antikanker. Fakta ini mempunyai harapan bahwa ekstrak buah delima
(PGL) dapat membunuh sel yang mengalami transformasi ke karsinoma sel
skuamosa rongga mulut mencit melalui penurunan ekspresi BCL-2,VEGF dan
peningkatan ekspresi wild p53, apoptosis. Tujuan penelitian ini adalah untuk
menguji secara eksperimental mekanisme kerja ekstrak buah Delima (Punica
granatum L) terstandar terhadap sel mukosa rongga mulut mencit yang
mengalami transformasi melalui ekspresi BCL-2,VEGF, Wild p53 dan Apoptosis.
Metode penelitian ini adalah eksperimental laboratories. Hewan coba yang
digunakan adalah mencit Strain Swiss Webster (Balb/c), 30 ekor mencit jantan
umur 5 bulan, dibagi 5 kelompok. Kelompok kontrol (K0/K-, K1/K+) dan 3
kelompok perlakuan (P1, P2, P3). Paparan benzopirene diberikan untuk hewan
coba pada kelompok (K1, P1, P2, P3) dengan dosis 0,04 mg benzopirene / 0,04 ml
olium olivarum diberikan 3 kali seminggu selama 4 minggu. Pemberian ellagic
acid, PGL, mahkota dewa pada kelompok (P1, P2, P3 ) dengan dosis 75 mg/kg
bb mencit, diberikan tiap hari selama 4 minggu per oral. Teknik pemeriksaan
dengan teknik imunohistokimia dan tunnel assay analisis data menggunakan uji
MANOVA, LSD, uji korelasi dan regresi.
Hasil pemeriksaan dengan teknik imunohistokimia dan pemberian ekstrak
buah delima (PGL)/P2 terstandar dapat menurunkan ekspresi Bcl-2, dan tidak
berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K0, P1, P3, tetapi
berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K1. Ekstrak buah
delima (PGL)/P2 terstandar dapat menurunkan ekspresi VEGF, dan tidak berbeda
secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K0, P1, P3, tetapi berbeda
secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K1. Ekstrak buah delima
(PGL)/P2 terstandar dapat meningkatkan ekspresi wild p53, tidak berbeda secara
signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K0, P1, P3, tetapi berbeda secara
signifikan dengan kelompok K1. Pemeriksaan preparat dengan teknik tunnel
assay menunjukkan pemberian ekstrak buah delima (PGL)/P2 terstandar dapat
meningkatkan apoptosis, dan tidak berbeda secara signifikan dengan kelompok
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
P1, P3, tetapi berbeda secara signifikan dengan kelompok K0 dan K1. Hasil uji
korelasi menunjukkan, ada korelasi positif antara penurunan ekspresi Bcl-2
dengan penurunan ekspresi VEGF, tetapi ada korelasi negatif antara penurunan
ekspresi Bcl-2 dengan peningkatan ekspresi wild p53, dan ada korelasi positif
antara peningkatan wild p53 dengan peningkatan ekspresi apoptosis.
Kesimpulan penelitian ini adalah bahwa ada mekanisme kerja ekstrak buah
delima (PGL) terhadap apoptosis melalui jalur intrinsik dan ada korelasi positif
dua arah antara ekspresi Bcl-2 dengan ekspresi VEGF.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
SUMMARY
Mechanism of Action of Standardized Pomegranate Extracts
(Punica Granatum L) on Degradation of Mice Oral Cavity Mucosal Cells
Transforming through Expression of Bcl-2, VEGF, p53 Wild and Apoptosis
Squamous cell carcinoma of the oral cavity is the sixth cancer in the
world, every year the number of events increases. In developing countries, these
events have a high number. The developments in the field of surgery, radiation
and chemotherapy have improved dramatically, but the results are still relatively
encouraging. In facts, patients who have a long life are still less than 50%. The
occurrence of cancer could be due to apoptosis resistance. Apoptosis is an
efficient mechanism to eliminate cells that are unnecessary and potentially
dangerous so as to save the organism. Pomegranate (PGL) is one of medicinal
plants that have anticancer activity. This fact has the expectation that pomegranate
extract (PGL) can kill cells undergoing transformation into squamous cell
carcinoma of the oral cavity of mice with decreased expression of BCL-2, VEGF
and increased expression of p53 wild, apoptosis. The purpose of the research was
to experimentally test the mechanism of action of Pomegranate extract (Punica
granatum L) standardized to oral mucosal cells of mice undergoing a
transformation through the expression of BCL-2, VEGF, p53 and Apoptosis Wild.
The research method was experimental laboratories. Experimental animals used
were Swiss Webster mice strains (Balb / c), 30 male mice aged 5 months, divided
5 groups. The control group (K0/K-, K1 / K +) and 3 treatment groups (P1, P2,
P3). Exposure benzopirene was given to experimental animals in the group (K1,
P1, P2, P3) at a dose of 0.04 mg benzopirene / 0.04 ml olium olivarum given 3
times a week for 4 weeks. Usage of ellagic acid, PGL, mahkota dewa on the
groups (P1, P2, P3) at a dose of 75 mg / kg bb mice, given daily for 4 weeks per
oral. Examination techniques with imunohistokimia technique and tunnel assay
data analysis using MANOVA test, LSD, correlation and regression testing.
The results of the examinations with imunohistokimia technique and pomegranate
extract (PGL) / P2 standardized could reduce the expression of Bcl-2, and did not
differ significantly when compared to the K0, P1, P3, but significantly different
when compared with group K1. Pomegranate Extract (PGL) / P2 standardized
could reduce the expression of VEGF, and did not differ significantly when
compared to the K0, P1, P3, but significantly different when compared with group
K1. Pomegranate Extract (PGL) / P2 standardized could increase the expression
of p53 wild, did not differ significantly when compared to the K0, P1, P3, but
differs significantly with the K1. Examination preparations tunnel assay
techniques showed the extract of pomegranate (PGL) / P2 standardized to enhance
apoptosis, and did not differ significantly by group P1, P3, but differed
significantly with the K0 and K1. Correlation test results showed that there was a
positive correlation between the decreased expression of Bcl-2 with decreased
VEGF expression, but there is a negative correlation between the decreased
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
expression of Bcl-2 with increased expression of p53 wild, and there is a positive
correlation between the increase in p53 wild with increased expression of
apoptosis.
The conclusion of the research was that there was a mechanism of action of
pomegranate extract (PGL) to apoptosis through the intrinsic pathway, and there
was a positive correlation in both directions between the expression of Bcl-2 and
VEGF expression.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
ABSTRAK
Mekanisme Kerja Ekstrak Buah Delima
(Punica granatum L) Terstandar Terhadap Degradasi Sel Mukosa Rongga
Mulut Mencit Yang Mengalami Transformasi Melalui Ekspresi BCL-2,
VEGF, Wild p53 Dan Apoptosis
Karsinoma sel skuamosa rongga mulut adalah merupakan kanker urutan
keenam di dunia. Perkembangan kemajuan di bidang bedah, radiasi dan
kemoterapi belum memberikan hasil yang signifikan. Pasien karsinoma sel
skuamosa rongga mulut yang berumur panjang kurang dari 50%. Terjadinya
kanker salah satu disebabkan oleh karena hambatan apoptosis sel dan mutasi.
Delima (PGL) merupakan alternatif dan salah satu tanaman obat yang memiliki
aktivitasnya sebagai antikanker. Fakta ini mempunyai harapan bahwa ekstrak
buah delima (PGL) terstandar dapat membunuh sel yang mengalami transformasi
ke karsinoma sel skuamosa rongga mulut mencit melalui penurunan ekspresi
BCL-2,VEGF dan peningkatan ekspresi wild p53, apoptosis. Tujuan penelitian ini
adalah untuk menguji secara eksperimental mekanisme kerja ekstrak buah Delima
(Punica gr anatum L) terstandar terhadap sel mukosa rongga mulut mencit yang
mengalami transformasi melalui ekspresi BCL-2,VEGF, Wild p53 dan Apoptosis.
Metode penelitian yang digunakan adalah eksperimental laboratories, tiga
puluh ekor mencit jantan umur 5 bulan dibagi secara random menjadi 5
kelompok; 2 kelompok control (K0, K1), 3 kelompok perlakuan (P1,P2,P3).
Paparan benzopirene dengan dosis 0,04 mg benzopirene/0,04 ml olium olivarum
selama 4 minggu, 3 kali seminggu. Pemberian ellagic acid, PGL, mahkota dewa
dengan dosis 75 mg/kg bb mencit setiap hari selama 4 minggu. Pemeriksaan
dilakukan dengan menggunakan teknik imunohistokimia dan tunnel assay.
Hasil penelitian berdasarkan teknik imunohistokimia menujukkan bahwa
pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat menurunkan ekspresi Bcl2, VEGF, dapat meningkatkan ekspresi wild p53 dengan teknik pemeriksaan
tunnel assay, dan meningkatkan ekspresi apoptosis. Hasil uji korelasi
menunjukkan, ada korelasi positif antara penurunan ekspresi Bcl-2 dengan
penurunan ekspresi VEGF, ada korelasi negatif antara penurunan ekspresi Bcl-2
dengan peningkatan ekspresi wild p53, dan ada korelasi positif antara peningkatan
ekspresi wild p53 dengan peningkatan ekspresi apoptosis.
Kesimpulan penelitian ini adalah ada mekanisme kerja ekstrak buah delima
(PGL) terhadap apoptosis melalui jalur intrinsik dan ada korelasi positif dua arah
antara ekspresi Bcl-2 dengan ekspresi VEGF.
Kata Kunci : Delima, transformasi sel, apoptosis.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
ABSTRACT
Mechanism of Action of Standardized Pomegranate Extracts
(Punica Granatum L) on Degradation of Mice Oral Cavity Mucosal Cells
Transforming through Expression of Bcl-2, VEGF, p53 wild and Apoptosis
Squamous cell carcinoma of the oral cavity is the sixth cancer in the world. The
developments in the field of surgery, radiation and chemotherapy have not yielded
significant results. Patients with squamous cell carcinoma of the oral cavity that
have a long life is still less than 50%. One occurrence of cancer was caused by
cell apoptosis and mutation. Pomegranate (PGL) is an alternative and one that has
the medicinal plants as anticancer activity. This fact has the expectation that
pomegranate extract (PGL) standardized to kill the cells undergoing
transformation into squamous cell carcinoma of the oral cavity of mice with
decreased expression of BCL-2, VEGF and increased expression of p53 wild,
apoptosis. The purpose of this study was to experimentally test the mechanism of
action of Pomegranate extract (Punica granatum L) standardized to oral mucosal
cells of mice undergoing a transformation through the expression of BCL-2,
VEGF, p53 and Apoptosis Wild.
The research method used was experimental laboratories, thirty male mice
aged 5 months were randomly divided into 5 groups: 2 groups of control (K0,
K1), 3 treatment groups (P1, P2, P3). Exposure of benzopirene with a dose of 0.04
mg benzopirene/ 0.04 ml olium olivarum for 4 weeks, 3 times a week. Usage of
ellagic acid, PGL, mahkota dewa with a dose of 75 mg / kg bb mice every day for
4 weeks. Examinations were done by using imunohistokimia and tunnel as say
techniques.
The results based on the technique of imunohistokimia showed that
pomegranate extract (PGL) standardized could reduce the expression of Bcl-2,
VEGF, p53, could increase the expression of wild-tunnel as say examination
techniques, and could increase expression of apoptosis. Correlation test results
showed that there was a positive correlation between the decreased expression of
Bcl-2 and decreased expression of VEGF, there was a negative correlation
between the decreased expression of Bcl-2 and increased expression of p53 wild,
and there was a positive correlation between the increased expression of p53 and
increased expression of wild apoptosis.
The conclusion of this study was that there was mechanism of
pomegranate extract (PGL) on apoptosis through the intrinsic pathway, and there
was a positive correlation in both directions between the expression of Bcl-2 and
VEGF expression.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL........................................................................................
i
LEMBAR PENGESAHAN .............................................................................
iv
UCAPAN TERIMA KASIH ............................................................................
vi
RINGKASAN ..................................................................................................
x
SUMMARY ..................................................................................................
xii
ABSTRAK
..................................................................................................
xiv
DAFTAR ISI ..................................................................................................
xvi
DAFTAR TABEL ............................................................................................
xx
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................
xxi
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xxvi
DAFTAR SINGKATAN ................................................................................. xxvii
BAB 1 PENDAHULUAN .............................................................................
1
1.1
Latar Belakang..........................................................................
1
1.2
Rumusan Masalah ....................................................................
7
1.3
Tujuan Penelitian ......................................................................
7
1.3.1 Tujuan umum penelitian ...............................................
7
1.3.2 Tujuan khusus penelitian ..............................................
8
Manfaat penelitian ....................................................................
8
1.4.1 Manfaat teoritik ............................................................
8
1.4.2 Manfaat praktis penelitian ............................................
9
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................
10
Karsinogenesis .........................................................................
10
2.1.1 Transform sel ................................................................
12
2.1.2 Karsinoma Sel Skuamosa Rongga Mulut (KSSRM) ....
13
1.4
2.1
2.1.2.1 Etiologi dan faktor predisposisi sel skuamosa rongga
mulut (KSSRM) ............................................................
14
2.1.2.2 Patobiologi molekuler sel skuamosa rongga mulut
(KSSRM) ......................................................................
Disertasi
16
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
2.2
Kematian Sel ............................................................................
18
2.2.1 Apoptosis ..................................................................................
18
2.2.1.1 Apoptosis fisiologis .............................................................
20
2.2.1.2 Apoptosis patologis .............................................................
21
2.2.1.3 Jalur Utama Apoptosis .........................................................
24
2.2.2 Nekrosis ..................................................................................
26
2.3
Proliferasi sel ............................................................................
28
2.4
Regulasi Apoptosis ...................................................................
29
2.4.1 Bcl-2 ......................................................................................
29
2.5
Regulasi Proliferasi ..................................................................
31
2.5.1 Wild p53 ...................................................................................
31
2.6
Angiogenesis dan VEGF ..........................................................
34
2.6.1 Angiogenesis ............................................................................
35
2.6.2 Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) .........................
37
2.7
Benzopirene ..............................................................................
38
2.8
Punica granatum L (Delima) ...................................................
42
2.8.1 Klasifikasi, Nama Lain Komposisi Delima (National Plant
Date Centre, 2000) ...................................................................
42
2.8.2 Bahan Aktif Delima (PGL) ......................................................
43
2.8.3 Aktivitas Delima (PGL) sebagai Antikanker, Antioksidan, dan
Antiinflamasi.............................................................................
47
2.8.3.1 Aktivitas Antikanker ............................................................
47
2.8.3.2 Aktivitas Antioksidan...........................................................
52
2.8.3.3 Aktivitas Antiinflamasi ........................................................
53
Phaleria macrocarpa (Mahkota Dewa) ...................................
54
2.10 Imunohistokimia .......................................................................
55
2.11 Tunnel Assay ............................................................................
58
BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL ..........................................................
60
2.9
Disertasi
3.1
Kerangka Konsep .....................................................................
60
3.2
Penjelasan Kerangka Konsep ...................................................
61
3.3
Hipotesis Penelitian ..................................................................
64
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
BAB 4 METODE PENELITIAN...................................................................
65
4.1
Jenis dan Rancangan penelitian ................................................
65
4.2
Unit Eksperimental, Replikasi dan Randomisasi .....................
67
4.2.1 Unit Eksperimental ...................................................................
67
4.2.2 Replikasi ..................................................................................
68
4.2.3 Randomisasi .............................................................................
69
4.3
Variabel Penelitian dan Definisi Operasional Variabel............
69
4.3.1 Variabel Penelitian ....................................................................
69
4.3.2 Definisi Variabel Penelitian ....................................................
70
4.4
Unit Analisis .............................................................................
73
4.5
Alat penelitian ..........................................................................
73
4.6
Lokasi Penelitian ......................................................................
74
4.7
Pelaksanaan Penelitian .............................................................
74
4.7.1 Persiapan Penelitian..................................................................
74
4.8
Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data ........................
76
4.9
Cara Pengolahan dan Analisis Data .........................................
77
4.10 Kerangka Operasional Penelitian .............................................
79
BAB 5 HASIL PENELITIAN ......................................................................
80
5.1
Karakteristik Subyek Penelitian ...............................................
5.3
Ekspresi
80
Bcl-2, VEGF, wild p53 dan Jumlah sel yang
mengalami apoptosis ................................................................
82
5.4
Korelasi antara Bcl-2, VEGF, wild p53 dan Apoptosis ..........
102
5.5
Uji Regresi antara Bcl-2, VEGF, wild p53 dan Apoptosis .......
104
5.6
Kerangka Hasil Penelitian ........................................................
105
BAB 6 PEMBAHASAN ................................................................................
107
6.1
Aktivitas Ekstrak Buah Delima (PGL) terhadap Ekspresi
Protein Bcl-2 pada Sel Mukosa Rongga Mencit akibat
paparan Benzopirene. ...............................................................
6.2
Aktivitas Ekstrak Buah Delima (PGL) terhadap Ekspresi
VEGF Pada Sel Mukosa Rongga Mulut
Mencit Akibat
Paparan Benzopirene ................................................................
Disertasi
109
116
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
6.3
Efek Ekstrak Buah Delima (PGL) terhadap Ekspresi Protein
wild p53 pada Sel Mukosa Rongga Mulut Mencit Hewan
Coba Akibat Paparan Benzopirene ...........................................
6.4
120
Aktivitas Ekstrak Buah Delima (PGL) Terhadap Perubahan
Ekspresi Jumlah Sel Yang Mengalami Apoptosis Pada Sel
Mukosa Rongga Mulut Akibat Paparan Benzopirene ..............
124
Temuan baru .............................................................................
128
6.5.1 Kerangka Temuan Baru ............................................................
128
6.5.2 Keterangan Kerangka Temuan Baru ........................................
128
BAB 7 PENUTUP..........................................................................................
131
6.5
Disertasi
7.1
Kesimpulan ...............................................................................
131
7.2
Saran .........................................................................................
131
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................
133
LAMPIRAN
142
.............................................................................................
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 5.1 Uji Homogenitas Subjek Penelitian Berdasarkan Berat Badan
Awal dan akhir mencit percobaan .................................................
84
Tabel 5.2 Nilai Signifikansi Uji Normalitas Ekspresi Bcl-2, VEGF, wild
p53 dan jumlah sel yang mengalami apoptosis .............................
85
Tabel 5.3 Rerata dan Simpangan Baku Jumlah Sel yang Mengekspresikan
Bcl-2 Pada Hewan Percobaan ......................................................
86
Tabel 5.4 Rerata dan Simpangan Baku Jumlah Sel yang Mengekspresikan
VEGF pada Hewan Percobaan .....................................................
90
Tabel 5.5 Rerata dan Simpangan Baku Jumlah Sel yang Mengekspresikan
wild p53 Pada Hewan Percobaan ..................................................
94
Tabel 5.6 Rerata dan Simpangan Baku ekspresi sel yang mengalami
Disertasi
apoptosis Hewan Percobaan ..........................................................
98
Tabel 5.7 Uji korelasi antara wild p53, Bcl-2, VEGF terhadap apoptosis ....
102
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1
Tahapan-tahapan proses karsinogenesis (Kresno, 2011) .........
Gambar 2.2
Tiga jalur apoptosis yaitu jalur ekstrinsik (death-receptor
11
pathway), jalur intrinsik yang juga disebut jalur mitokhondria
dan jalur perforin/granzim (Jalur ekstrinsik dan jalur intrinsik
merupakan jalur utama) (Kresno, 2011) ...................................
24
Gambar 2.3
Struktur Kimia Benzopirene (Vidmar et all., 2004) ................
41
Gambar 2.4
Reaksi aromatik hidrosilasi dan epoksidasi (Sudiana, 2008) ..
41
Gambar 2.5
Punica granatum L (Delima) ( National Plant Data Center,
2000)
Gambar 2.6
..................................................................................
43
Struktur Kimia Punicalagin (a) dan Ellagic Acid (b) (Seeram
et al., 2005) ..............................................................................
45
Gambar 3.1
Kerangka Konsep .....................................................................
60
Gambar 4.1
Rancangan Penelitian ..............................................................
65
Gambar 4.2
Kerangka Operasional Penelitian ............................................
78
Gambar 5.1
Gambaran HPA (pembentukan keratin abnormal, proliferasi
sel-sel epitel skuamous, terlihat sel-sel atipia, sel tidak
beraturan) pada transform sel ke karsinoma rongga mulut
dosis 0.04 ml benzopirene, paparan 3 x seminggu selama 4
minggu
dan pembesaran 100 x dengan pewarnaan HE
(penelitian pendahuluan) ..........................................................
Gambar 5.2
81
Gambaran HPA (pembentukan keratin abnormal, bentuk sel
tidak beraturan) pada transform sel ke karsinoma rongga
mulut dosis
0.02 ml benzopirene, paparan
tiga kali
seminggu selama empat minggu pembesaran 100 x dengan
pewarnaan HE (penelitian pendahuluan)..................................
Disertasi
82
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Gambar 5.3
Gambaran secara klinis dari hasil penelitian pendahuluan
dengan dosis benzopirene 0,04 ml menunjukkan gambaran
mikroskopis (kemerahan, indurasi, tumor) ...............................
Gambar 5.4
Grafik Uji Homogenitas Subjek Penelitian Berdasarkan Berat
Badan Awal dan akhir mencit percobaan .................................
Gambar 5.5
84
Grafik Rerata dan Simpangan Baku Jumlah Sel yang
Mengekspresikan Bcl-2 Pada Hewan Percobaan ....................
Gambar 5.6
82
86
Kelompok K0 / Kontrol negatif (mencit normal)→ (Positif)
Pengecatan imunohistokimia dengan antibodi poliklonal
terhadap ekspresi Bcl-2, pembesaran 400 x pada transform
sel .............................................................................................
Gambar 5.7
87
Kelompok K1 / Kontrol positif (Benzopirene) → (Positif)
Pengecatan imunohistokimia dengan antibodi poliklonal
terhadap ekspresi Bcl-2, pembesaran 400 x pada transform
sel .............................................................................................
Gambar 5.8
Kelompok P1 (Benzopirene + EA) → (Positif) Pengecatan
imunohistokimia
dengan
antibodi
poliklonal
terhadap
ekspresi Bcl-2, pembesaran 400 x pada transform sel .............
Gambar 5.9
88
88
Kelompok P2 (Benzopirene + PGL) → (Positif) Pengecatan
imunohistokimia
dengan
antibodi
poliklonal
terhadap
ekspresi Bcl-2, pembesaran 400 x pada transform sel .............
89
Gambar 5.10 Kelompok P3 (Benzopirene + MD) → (Positif) Pengecatan
imunohistokimia
dengan
antibodi
poliklonal
terhadap
ekspresi Bcl-2, pembesaran 400 x pada transform sel .............
89
Gambar 5.11 Grafik Rerata dan Simpangan Baku Jumlah Sel yang
Mengekspresikan VEGF pada Hewan Percobaan ...................
90
Gambar 5.12 Kelompok K0 / Kontrol negatif (mencit normal)→ (Positif)
Pengecatan imunohistokimia dengan antibodi poliklonal
terhadap ekspresi VEGF pembesaran 400 x pada transform
sel .............................................................................................
Disertasi
91
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Gambar 5.13 Kelompok K1 / Kontrol positif (Benzopirene) → (Positif)
Pengecatan imunohistokimia dengan antibodi poliklonal
terhadap ekspresi VEGF pembesaran 400 x pada transform
sel .............................................................................................
92
Gambar 5.14 Kelompok P1 (Benzopirene + EA) → (Positif) Pengecatan
imunohistokimia
dengan
antibodi
poliklonal
terhadap
ekspresi VEGF pembesaran 400 x pada transform sel .............
92
Gambar 5.15 Kelompok P2 (Benzopirene + PGL) → (P ositif) Pengecatan
imunohistokimia
dengan
antibodi
poliklonal
terhadap
ekspresi VEGF pembesaran 400 x pada transform sel .............
93
Gambar 5.16 Kelompok P3 (Benzopirene + MD) → (Positif) Pengecatan
imunohistokimia
dengan
antibodi
poliklonal
terhadap
ekspresi VEGF pembesaran 400 x pada transform sel .............
93
Gambar 5.17 Grafik Rerata dan Simpangan Baku Jumlah Sel yang
Mengekspresikan wild p53 Pada Hewan Percobaan ................
94
Gambar 5.18 Kelompok K0 / Kontrol negatif (mencit normal)→ (Positif)
Pengecatan imunohistokimia dengan antibodi poliklonal
terhadap ekspresi wild p53 pembesaran 400 x pada transform
sel .............................................................................................
95
Gambar 5.19 Kelompok K1 / Kontrol positif (Benzopirene) → (Positif)
Pengecatan imunohistokimia dengan antibodi poliklonal
terhadap ekspresi wild p53 pembesaran 400 x pada transform
sel .............................................................................................
96
Gambar 5.20 Kelompok P1 (Benzopirene + EA) → (Positif) Pengecatan
imunohistokimia
dengan
antibodi
poliklonal
terhadap
ekspresi wild p53 pembesaran 400 x pada transform sel .........
96
Gambar 5.21 Kelompok P2 (Benzopirene + PGL) → (Positif) Pengecatan
imunohistokimia
dengan
antibodi
poliklonal
terhadap
ekspresi wild p53 pembesaran 400 x pada transform sel .........
Disertasi
97
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Gambar 5.22 Kelompok P3 (Benzopirene + MD) → (Positif) Pengecatan
imunohistokimia
dengan
antibodi
poliklonal
terhadap
ekspresi wild p53 pembesaran 400 x pada transform sel .........
97
Gambar 5.23 Grafik Rerata dan Simpangan Baku Jumlah Sel yang
Mengekspresikan wild p53 Pada Hewan Percobaan ................
98
Gambar 5.24 Kelompok K0 / Kontrol negatif (mencit normal)→ (Positif)
Pengecatan teknik tunnel assay dengan antibodi poliklonal
terhadap ekspresi apoptosis pembesaran 400 x pada transform
sel .............................................................................................
99
Gambar 5.25 Kelompok K1 / Kontrol positif (Benzopirene) → (Positif)
Pengecatan teknik tunnel assay dengan antibodi poliklonal
terhadap ekspresi apoptosis pembesaran 400 x pada transform
sel .............................................................................................
100
Gambar 5.26 Kelompok P1 (Benzopirene + EA) → (Positif) Pengecatan
teknik tunnel assay dengan antibodi poliklonal terhadap
ekspresi apoptosis pembesaran 400 x pada transform sel ........
100
Gambar 5.27 Kelompok P2 (Benzopirene + PGL) → (Positif) Pengecatan
teknik tunnel assay dengan antibodi poliklonal terhadap
ekspresi apoptosis pembesaran 400 x pada transform sel ........
100
Gambar 5.28 Kelompok P3 (Benzopirene + MD) → (Positif) Pengecatan
teknik tunnel assay dengan antibodi poliklonal terhadap
ekspresi apoptosis pembesaran 400 x pada transform sel ........
101
Gambar 5.29 Korelasi antara Bcl-2 dengan VEGF ........................................
101
Gambar 5.30 Korelasi antara Bcl-2 dengan wild p53 ....................................
102
Gambar 5.31 Korelasi antara wild p53 dengan apoptosis .............................
103
Gambar 5.32 Hubungan antara Bcl-2, VEGF, wild p53 dan Apoptosis
dengan uji regresi, korelasi positif dan bermakna antara wild
p53 dengan Apoptosis, korelasi negatif dan bermakna antara
wild p53 dengan Bcl-2, korelasi negatif antara wild p53
dengan VEGF, korelasi positif dan bermakna antara Bcl-2
dengan VEGF ...........................................................................
Disertasi
104
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Gambar 5.33 Hubungan antara Bcl-2, VEGF, wild p53 dan Apoptosis
dengan uji regresi, korelasi positif dan bermakna antara wild
p53 dengan Apoptosis, korelasi negatif dan bermakna antara
wild p53 dengan Bcl-2, korelasi negatif antara wild p53
dengan VEGF, korelasi positif dan bermakna antara Bcl-2
Disertasi
dengan VEGF ...........................................................................
104
Gambar 5.34 Kerangka hasil penelitian .......................................................
105
Gambar 6.1
128
Kerangka temuan baru .............................................................
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1
Disertasi
Sertifikasi standarisasi (COA) ekstra buah delima (PGL) dan
ellagic acid ..............................................................................
142
Lampiran 2
Ethical Clearance .....................................................................
144
Lampiran 3
Hasil uji statistik .......................................................................
145
Lampiran 4
Prosedur pemeriksaan Imunohistokimia .................................
168
Lampiran 5
Prosedur pemeriksaan Tunnel Assay .......................................
170
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
DAFTAR SINGKATAN / ISTILAH
17p
: Kromosom 17 lengan pendek
AP-1
: Aktivator protein 1
APAAP
: Alkali fosfatase anti alkali fosfatase
APAF-1
: Apoptosis protein avtivating factor-1
ADCC
: Antibody dependent cell cytotoxicity
Bax
: Protein BAX pada membran mitokondria
BM
: Berat molekul
bFGF
: Basic fibroblast growth faktor
Bcl- 2
: Gen yang mengkode protein yang berperan sebagai
anti apoptosis
Disertasi
CTL
: Cytotoxic T-Lymphocyte
CPK
: Cystein protein kinase
CPSO
: Cold pressed seed oil
CDK
: Cyclin dependent protein kinase
CPK-K2
: Cystein protein kinase –K2
CTL
: Cytotoxic Tlymphocyte
CMC
: Carboxy methyl cellulase
COX
: Cyclooxygenase
DNA
: Deoxyribonucleic acid
DAB
: Diaminoenzidine
ELISA
: Enzyme linked immunoassay
FADD
: Associated protein death domain
Fase G-1
: Gap /jeda antara akhir fase M dengan awal fase S
Fase G-2
: Gap / jeda antara fase S dengan awal fase M
Fase S
: Interfase / fase sentesis
Fase M
: Fase mitosis
FRAP
: Ferric reducing antioxidan power
HSV
: Herpes simplex-1
HIV
: Human immudifisiency
HPV
: Human papilloma
HIF
: Hipoxia inducible factor
HTs
: Hydrolyzable tannins
HPLC
: Hight performance liquid chromatographi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
IAP
: Inhibitor of apoptosis protein
IKK
: IkB kinase
KSSRM
: Karsinoma sel skuamosa rongga mulu
LOX
: Lipoxygenase
MFO
: Mixed function oxidase
MAPK
: Mitogen activated protein kinase
MDM2
: Murine double minute 2
mRNA
: Messanger ribonucleic acid
NK
: Natural killer
NF-kB
: Nuclear factor kappa B
NER
: Nucleotide excision repair
NK-cel
:
NIK
: NF-kB inducing kinase
P21
: Gen p21, protein 21 (p21) dikode oleh gen p21(P21)
p53
: Gen p53, protein 53 (p53) dikode oleh gen p53
Natural killer cell
(P53)
PPE
: Pomegranate peel extract
Protooncogene
: Gen yang mengkode protein
PGL
: Punica granatum Linn
PFE
: Pomegranate flower ekstrak
PPJ
: Pomegranate pulp juice
PKC
: Protein kinase-C
PSA
: Prostat spesifik antigen
PAA
: Dihydrophenylacetic acid
PAP
: Peroksidase anti peroksidase
PAH
: Polycyclic aromatic hydrocarbon
PCNA
: Proliferating cell nuclear antigen
ROS
: Reactive oxygen species
RNA
: Ribonucleic acid
STAT3
: Signal transducer and activator of transkripsi 3
Tumor suppressor gene
: Protein yang berperan sebagai faktor pengendalian
pertumbuhan sel
Disertasi
Telomerase
: Enzim yang berperan pada apoptosis fisiologis
TRAIL
: Anggota superfamily TNF
Tdt
: Terminal deoxynucleotidyl transferase
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Disertasi
T2
: Ukuran tumor 2-4 cm
T3
: Ukuran tumor lebih dari 4 cm
TSG
: Tumor supressor gene
VEGF
: Vascular endothelial growth factor
VEGFR
: Vascular endothelial growth factor receptor
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Trasformasi sel merupakan sel yang mengalami perubahan perilaku
sebagai akibat adanya transkripsi dari suatu onkogen. Protooncogene yang
mengalami mutasi, gen tersebut dikenal dengan onkogen. Protein yang di
kode oleh gen tersebut akan overaktif dan dapat berkembang menjadi kanker
(Sudiana, 2008; Kresno, 2011)
Karsinoma sel skuamosa rongga mulut merupakan kanker keenam di
dunia, di India dilaporkan setiap tahun 75.000-80.000 kasus baru, di
Singapura dan negara-negara Asia lainnya juga dilaporkan tinggi angka
kejadiannya (Epstein and Waal, 2008; Solomon, 2010). Karsinoma sel
skuamosa rongga mulut merupakan kelanjutan dari kejadian transformasi sel
pada sel skuamosa rongga mulut.
Lebih dari 90% dari karsinoma rongga mulut berasal dari sel skuamosa
dan menjadi masalah kesehatan utama di negara berkembang serta merupakan
penyebab utama kematian. Indeks survival ini terus merosot (50%),
dibandingkan dengan kemajuan dalam hal diagnosis dan pengobatan kanker
(Mehrotra and Yadav, 2006).
Beberapa penelitian di Asia Tenggara, diketahui bahwa mukosa bukal
merupakan daerah karsinoma sel skuamosa yang paling umum yaitu sebesar
50%-72%. Karsinoma sel skuamosa rongga mulut pada dasarnya tidak
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
menimbulkan keluhan pada tahap awal, pasien dengan karsinoma sel
skuamosa pada mukosa bukal 68% diantaranya merupakan lesi T2 atau T3
dan sebesar 48% menyebar ke nodes limfa (Wahyuni, 2010).
Berbagai upaya penatalaksanaan penyakit kanker masih banyak
menemui kendala yang mengakibatkan kurangnya keberhasilan dalam
mencegah dan mengobati kanker. Pengobatan yang selama ini dilakukan
meliputi pembedahan, penyinaran radioterapi dan penggunaan obat-obat
kemoterapi. Tindakan operasi untuk mengangkat jaringan kanker belum
sepenuhnya menjamin kesembuhan dan ada kecenderungan untuk terjadinya
remultiplikasi sel kanker. Penggunaan radioterapi menimbulkan resiko
terjadinya kerusakan lain di sekitar jaringan yang terkena kanker. Pemberian
kemoterapi antikanker memiliki efek farmakologi kurang selektif, efek
samping yang merugikan dan dilaporkan adanya resistensi beberapa jenis
kanker (Rizali dan Auerkari, 2003; Sismindari, 2005).
Penanganan penyakit kanker yang kurang optimal pada kasus
karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang telah metastasis luas, didapatkan
sekitar 30-65% penderita meninggal dunia dalam kurang waktu 5 tahun.
Karsinoma sel skuamosa rongga mulut merupakan kanker yang sering terjadi
pada rongga mulut. Pemeriksaan DNA menunjukkan hampir 90% kasus
dijumpai adanya mutasi gen p53 (Syafriadi, 2008).
Pada dasarnya penanganan kanker melalui kemoterapi dan dengan obat
herbal tidak jauh berbeda. Keduanya untuk membunuh sel kanker, namun
efek yang ditimbulkan kedua sistem pengobatan ini sangat berbeda. Tanaman
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
obat dengan sifat alamiahnya akan meningkatkan daya tahan tubuh penderita
terutama sel yang berada di sekitar kanker. Senyawa-senyawa aktif tanaman
obat juga banyak mempunyai fungsi untuk menghambat pertumbuhan sel
kanker dan membunuhnya, memutus pasokan zat-zat makanan dan oksigen
ke jaringan sel kanker. Selain bebagai alasan tersebut di atas, penggunaan
obat herbal dalam menangani sel kanker merupakan cara pengobatan dengan
biaya murah (McCutcheon et a l.,2008). Delima (PGL) adalah Salah satu
tanaman obat yang mempunyai efek farmakologis terhadap penyakit kanker
telah banyak diteliti secara invitro dan sedikit penelitian yang di lakukan
secara invivo .
Penelitian ini tidak mungkin digunakan
penelitian, sehingga digunakan
manusia sebagai subjek
hewan coba mencit. Hewan coba yang di
gunakan mencit Strain Sw iss Webster (Balb/c) jantan, lokasi paparan pada
mukosa bukal sebelah kanan dengan dosis paparan benzopirene berdasarkan
penelitian pendahuluan
0,04 mg benzopirene / 0,04 ml olium ol ivarum,
diberikan 3 kali dalam semingggu selama 4 minggu.
Benzopirene
(B(a)P)
merupakan
senyawa
polisiklik ar omatik
hidrokarbon yang bersifat karsinogenik dan paling sering menyebabkan
kanker di rongga mulut (Cotran, 2005). Benzopirene menghasilkan metabolit
reaktif BP-7, 8-diol-9, 10-oxide yang dapat berikatan secara kovalen dengan
basa guanin DNA sehingga terjadi mutasi genetik (Sattar et al.,1999). Hal ini
akan menyebabkan transformasi sel normal menjadi sel kanker. Benzopirene
(B(a)P) yang banyak terdapat dalam asap rokok, asap kendaraan, asap dari
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
proses pembakaran bahan organik dan makanan yang diasap atau dipanggang.
Benzopirene dapat menimbulkan mutasi gen p53 sehingga menimbulkan
kanker (Martin et al., 2001).
Pada sel yang mengalami transformasi mutasi gen p53 akan mengubah
sifat protein yang diproduksinya sehingga menghilangkan kemampuan wild
p53 baik sebagai antiproliferasi, maupun sebagai pengatur proses apoptosis
(Mendelsohn et al., 2008).
Mutasi gen p53 menyebabkan inaktivasi wild p53 sehingga siklus sel
tidak berhenti pada fase G1 tetapi berlanjut ke fase S dan G2 atau M. Hal ini
berakibat DNA yang mengalami mutasi tetap dilipatgandakan. Sel yang
mengandung DNA mutasi tetap mitosis menghasilkan populasi sel yang
mengandung DNA cacat. Pada proses apoptosis wild p53 berperan memicu
faktor transkripsi terhadap p21 dan memicu aktivitas Bax dan menekan Bcl-2.
Apabila sistem yang menginduksi apoptosis tidak mampu bekerja
maka
akan mengalami pembelahan sel yang tidak terkendali, sehingga menjadi
kanker (Sudiana, 2008).
Apoptosis
merupakan
proses
kematian
sel
dalam
rangka
mempertahankan integritas tubuh secara keseluruhan. Program ini memiliki
peran yang penting untuk menjaga homeostatis, perkembangbiakan sel. Salah
satu peran penting apoptosis adalah untuk membatasi proliferasi sel yang
tidak diperlukan, mekanisme yang efisien untuk mengeliminasi sel yang tidak
diperlukan dan berbahaya. Pada sel kanker program apoptosis ini mengalami
gangguan (Salido et al., 2009).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Bcl-2 adalah sebuah onkogen anggota dari keluarga Bcl yang
mempunyai fungsi untuk menghambat proses apoptosi (hambatan kompetitif
terhadap aktivasi Bax). Apabila jumlah protein Bcl-2 sedikit, maka protein
pro apoptosis (Bax) akan menginduksi apoptosis (Kresno, 2011).
Angiogenesis merupakan pertumbuhan pembuluh darah baru dari
pembuluh darah yang sudah ada, merupakan salah satu faktor penting pada
pertumbuhan dan
pembentukan
perkembangan sel kanker. Faktor yang mempengaruhi
angiogenesis
adalah
VEGF,
VEGF
sebagai
inducer
angiogenesis dari sebagian besar kanker mengekspresikan VEGF (Hasina et
al., 2001; Kresno, 2011).
Dewasa ini telah dilakukan berbagai upaya penelitian guna pencarian obat
antikanker. Salah satu upaya di antaranya adalah menggali potensi tanaman
obat Indonesia termasuk delima atau Punica G ranatum L inn ( PGL), yang
banyak diteliti secara invitro tapi masih jarang diteliti secara invivo. Apabila
efek ekstrak buah delima (Punica Granatum L) pada mencit (Mus Musculus)
Strain Sw iss W ebster (Balb/c) dapat terungkap, maka ekstrak buah delima
(Punica Granatum L) dapat dijadikan sebagai salah satu alternatif pengobatan
terhadap karsinoma sel skuamosa rongga mulut.
Buah delima merupakan bagian tanaman delima yang memiliki
komponen paling lengkap bila dibandingkan bagian tanaman delima lainnya.
Buah delima banyak mengandung senyawa polyphenol yang terdiri dari
flavonoid, hydrolyzahle tannins (ellagitannins dan gallotannins) dan
condensed tannins (proantho cyanidins). Bahan aktif utama yang terkandung
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
di dalam buah delima adalah punicalagin dan ellagic acid (EA). Ekstrak buah
delima terstandar yang baik umumnya mengandung 40% atau lebih ellagic
acid. Ekstrak buah delima (PGL) dengan standar 40% ellagic a cid dapat
menghambat
perkembangan
sel
kanker,
antiproliferasi,
menginduksi
apoptosis dan antioksidan secara invitro (Seeram et al., 2006; Jurenka, 2008).
Ekstrak etanol buah delima dapat meningkatkan apoptosis secara invitro
pada biakan sel karsinoma skuamosa lidah manusia dengan dosis 250 ug/ml
(Kholifa, 2010). Standarisasi 40% ellagic ac id dengan tujuan 40% ellagic
acid dapat menggambarkan kekuatan delima yang bertanggung jawab
terhadap aktivitas farmakologi (Saifudin et al ., 2011). Dosis ekstrak buah
delima yang digunakan dalam penelitian ini adalah 75 mg/kg/hari (Valadares
et al.,2010).
Berdasarkan fakta tersebut, tidak menutup kemungkinan bahwa ekstrak
buah delima (PGL)
terstandar dengan komposisi yang
lengkap bila
dibandingkan dengan bagian tanaman delima lainnya, dapat dimanfaatkan
sebagai bahan antikanker melalui hewan percobaan yang sedang dalam proses
transformasi ke karsinoma sel skuamosa rongga mulut (KSSRM).
Langkah awal yang akan dilakukan pada
penelitian ini adalah
memberikan ekstrak buah delima (PGL) terstandar yang mengandung 40%
ellagic acid kepada hewan coba yang sedang dalam proses kearah karsinoma
sel skuamosa rongga mulut (KSSRM). Pemeriksaan dilakukan terhadap sel
mukosa yang mengalami transformasi ke karsinoma sel skumosa rongga
mulut pada bagian bukal kanan mencit. Digunakan metode imunohistokimia
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
untuk ekspresi Bcl-2, VEGF, wild p53 dan metode tunnel assay untuk sel
yang mengalami apoptosis.
1.2 Rumusan Masalah
Rumusan permasalahan dari penelitian ini adalah :
1.2.1 Apakah pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat
menurunkan ekspresi Bcl-2 pada sel mukosa rongga mulut mencit yang
mengalami transformasi ?
1.2.2 Apakah pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat
menurunkan ekspresi VEGF pada sel mukosa rongga mulut mencit yang
mengalami transformasi ?
1.2.3 Apakah pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat
meningkatkan ekspresi wild p53 pada sel mukosa rongga mulut mencit
yang mengalami transformasi ?
1.2.4 Apakah
pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat
meningkatkan
apoptosis pada sel mukosa rongga mulut mencit yang
mengalami transformasi ?
1.3 Tujuan Penelitian
1.3.1 Tujuan umum penelitian
Menjelaskan mekanisme kerja ekstrak buah delima (PGL) terstandar
terhadap hambatan / degradasi sel mukosa rongga mulut mencit Strain Swiss
Webster (Balb/c) yang mengalami transformasi ke karsinoma sel skuamosa.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
1.3.2 Tujuan khusus penelitian
Tujuan khusus dari penelitian ini adalah
a. Menganalisis hambatan/degradasi ekstrak buah delima (PGL) terstandar
terhadap sel mukosa rongga mulut mencit Strain Swiss Webster (Balb/c)
yang mengalami transformasi melalui penurunan ekspresi Bcl-2.
b. Menganalisis hambatan/degradasi ekstrak buah delima (PGL) terstandar
terhadap sel mukosa rongga mulut mencit Strain Swiss Webster (Balb/c)
yang mengalami transformasi melalui penurunan ekspresi VEGF
c. Menganalisis hambatan/degradasi ekstrak buah delima (PGL) terstandar
terhadap sel mukosa rongga mulut mencit Strain Swiss Webster (Balb/c)
yang mengalami transformasi melalui peningkatan ekspresi wild p53
d. Menganalisis hambatan/degradasi ekstrak buah delima (PGL) terstandar
terhadap sel mukosa rongga mulut mencit (Mus m usculus) St rain Sw iss
Webster ( Balb/c) yang mengalami transformasi melalui peningkatan
apoptosis.
1.4 Manfaat penelitian
1.4.1 Manfaat teoritik
Penelitian ini memberikan kontribusi keilmuan dalam mengungkap
mekanisme kerja ekstrak buah delima (PGL) terhadap penurunan
onkogenesis pada sel mukosa rongga mulut mencit (Mus m usculus) Strain
Swiss Webster (Balb/c) sebagai hewan coba yang mengalami transformasi
sel menjadi karsinoma sel skuamosa rongga mulut akibat paparan
benzopirene.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
1.4.2 Manfaat praktis penelitian
Ekstrak buah delima (PGL) dapat meningkatkan apoptosis melalui
jalur intrinsik melalui meningkatkan ekspresi wild p53, penurunan ekspresi
Bcl-2 dan menghambat angiogenesis melalui penurunan ekspresi VEGF,
sehingga menjadi dasar pengembangan terapi kanker khususnya kanker
rongga mulut.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Karsinogenesis
Pertumbuhan
kanker
merupakan
proses
mikroevolusioner
yang
berlangsung beberapa bulan atau beberapa tahun. Proses pertumbuhan ini
disebut karsinogenesis yang merupakan proses perubahan sekelompok sel
normal menjadi sel kanker akibat pengaruh karsinogen. Karsinogen adalah
bahan yang dapat memicu terjadinya kanker atau keganasan. Karsinogen
dapat mempengaruhi DNA atau suatu protein yang berperan pada pengaturan
siklus pembelahan sel, seperti protooncogene atau tumor s upressor ge ne
(Sudiana, 2008).
Karsinogenesis dimulai dari satu sel kanker yang memperbanyak diri dan
membentuk suatu koloni
dalam jaringan yang sama. Perkembangan
berikutnya akan terjadi perubahan genetik (seperti aktivasi oncogene).
Munculnya kanker dapat dipicu oleh beberapa faktor seperti, bahan kimia,
radiasi, dan virus. Faktor-faktor pencetus kanker ini memberikan pengaruh
pada suatu kelompok gen yang disebut gen kanker. Protooncogene secara
normal melakukan fungsi seluler yang berkaitan dengan pengaturan
pembelahan sel, tetapi beberapa faktor pemicu dapat mengubah fungsi
protooncogene menjadi oncogene yang menyebabkan terjadinya pembelahan
sel secara tidak normal dan terus-menerus, akhirnya terjadi kanker. Salah satu
10
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
cara yang dapat mengubah fungsi protooncogene adalah mutasi (Griffiths et
al.,1993; Kresno, 2011).
Proses karsinogenesis melalui beberapa stadium yang meliputi stadium
inisiasi, stadium promosi dan stadium progresi (fase pr evaskuler dan f ase
vaskuler).
Gambar 2.1 Tahapan-tahapan proses karsinogenesis (Kresno, 2011)
Pada stadium inisiasi zat-zat karsinogenik diaktivasi terlebih dahulu oleh
enzim di dalam tubuh menjadi senyawa metabolit. Senyawa metabolit ini
bersifat reaktif, mutagenik dan mampu berikatan dengan makro molekul
dalam tubuh seperti DNA. Stadium promosi merupakan kelanjutan stadium
inisiasi, stadium ini tidak melibatkan perubahan struktural dalam genom
secara langsung, tetapi biasanya ditandai dengan perubahan ekspresi gen dari
sel yang terinisiasi. Perubahan ini diduga terjadi interaksi perubahan genetik.
Stadium progresi, perubahan genetik semakin bertambah banyak sehingga
menambah koloni sel kanker, di tandai munculnya neoplasma ganas, diikuti
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
perubahan genetik nyata melibatkan perubahan struktur dalam inti sel.
Stadium progresi bersifat invasif dan seringkali diikuti dengan prosen
pembentukan pembuluh darah baru (angiogenesis) (Mendelsohn et al., 2001;
Sudiana, 2008).
2.1.1 Transformasi sel
Transformasi sel merupakan sel yang mengalami perubahan perilaku
sebagai akibat adanya transkripsi dari suatu oncogene. Oncogene adalah
protooncogene yang mengalami mutasi. Transformasi sel normal menjadi sel
kanker terjadi sebagai akibat terganggunya sistem regulasi atau siklus sel.
Secara fisiologi sel tumbuh dan berdiferensiasi, ada unsur genetik yang
diaktifkan (Switched o n) dan yang lain diinaktifkan (Switched of f) ..
Terganggunya sistem regulasi berakibat sel-sel kanker mampu membelah diri
menjadi lebih lebih banyak dan tidak menghasilkan pertumbuhan sel-sel
progenitor normal. Salah satu unsur penting dalam gangguan sistem regulasi
pertumbuhan sel adalah oncogene (Sudiana, 2008; Kresno, 2011).
Karsinoma in situ (CIS) adalah bentuk awal dari kanker yang
didefinisikan oleh tidak adanya invasi sel kanker ke jaringan sekitarnya,
biasanya sebelum penetrasi ke membram basal. Dengan kata lain, sel-sel
neoplastik berkembang biak di habitat normal (Mendelsohn et al., 2008).
Karsinoma sel skuamous merupakan kelanjutan dari transformasi sel
muncul sebagai akibat dari berbagai kejadian molekuler yang menyebabkan
mutasi
genetik yang mempengaruhi kromosom dan gen, yang akhirnya
menuju ke perubahan DNA. Akumulasi berbagai perubahan tersebut memicu
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
terjadinya disregulasi sel pada batas dimana terjadi pertumbuhan otonom dan
perkembangan yang invasif. Proses neoplastik mula-mula bermanifestasi
secara intraepitel dekat membran basal kemudian terjadi pertumbuhan klonal
keratinosit sel yang berubah secara berlebihan, menggantikan epitelium
normal. Setelah beberapa waktu atau beberapa tahun, terjadi invasi membran
dasar jaringan epitel menandakan awal kanker invasif (Wahyuni, 2010).
2.1.2 Karsinoma Sel Skuamosa Rongga Mulut (KSSRM)
Karsinoma merupakan
istilah
yang digunakan untuk menyebut
neoplasma ganas yang berasal dari epitel. Neoplasma diartikan sebagai massa
jaringan abnormal, yang tumbuh berlebih, tidak terkoordinasi dan
pertumbuhan terus berlanjut walaupun rangsangan telah hilang. Neoplasma
merupakan sel yang telah berubah struktur dan fungsi, sehingga sel tersebut
mengalami peningkatan jumlah yang abnormal, invasif, dapat menyebar
melalui pembuluh getah bening dan pembuluh darah serta dapat
menimbulkan metastasis di organ yang jauh (King, 2000).
Karsinoma sel skuamosa merupakan kanker yang sering terjadi pada
rongga mulut, secara klinis terlihat sebagai plak keratosis, ulserasi, tepi lesi
indurasi dan kemerahan. Pemeriksaan DNA menunjukkan mutasi p53 paling
umum dijumpai hingga 90% kasus (Syafriadi, 2008).
Karsinoma sel skuamosa secara histologis menunjukkan proliferasi selsel epitel skuamosa. Terlihat sel-sel yang atipia disertai perubahan bentuk ret
peg processus, pembentukan keratin yang abnormal, pertumbuhan proliferasi
basaloid, susunan sel menjadi tidak teratur, dan membentuk tumor nest yang
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
berinfiltrasi ke jaringan sekitarnya. Menurut WHO dalam (Syafriadi, 2008)
klasifikasi karsinoma sel skuamosa rongga mulut secara histopalogis dibagi :
1.
Well di fferentiated (Grade I ) : yaitu proliferasi sel-sel kanker di mana
sel-sel basaloid tersebut masih berdiferensiasi dengan baik membentuk
keratin (keratin pearl).
2.
Moderate differentiated (Grade II) : yaitu proliferasi sel-sel kanker di
mana sebagian sel-sel basaloid tersebut masih menunjukkan diferensiasi
membentuk keratin.
3.
Poorly differentiated (Grade III) : yaitu proliferasi sel-sel kanker di mana
seluruh sel-sel basaloid tidak berdiferensiasi membentuk keratin,
sehingga sel sulit dikenali lagi.
2.1.2.1 Etiologi dan faktor predisposisi sel skuamosa rongga mulut
(KSSRM)
Faktor-faktor yang diketahui berimplikasi sebagai pemicu potensial atau
promotor karsinoma sel skuamosa rongga mulut adalah tembakau, alkohol,
bahan kimia, radiasi sinar matahari, radiasi, ionisasi, karsinogen yang
berhubungan dengan pekerjaan, polutan lingkungan, obat-obatan, agen
infeksi dan nutrisi (Mehrotra and Syadav, 2006).
Agen infeksi yang erat berhubungan dengan karsinoma sel skuamosa
rongga mulut adalah syphilis, candida dan virus (Suaitha and Gabriel, 2004).
Virus onkogen yang banyak dihubungkan dengan kejadian kanker di rongga
mulut adalah virus Herpes Si mplex-1 (HSV), virus H uman I mmudifesiency
(HIV) dan virus H uman P apilloma (HPV). Hubungan lansung infeksi virus
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
terhadap kejadian kanker rongga mulut hingga saat ini belum jelas (Sunitha
and Gabriel, 2004).
Karsinogen dari radiasi ada langsung dan tidak langsung. Secara tidak
langsung; radiasi yang memapar tubuh akan mempengaruhi komponen air
yang ada di dalam sel, sehingga terbentuk suatu bahan yang dikenal sebagai
radikal bebas. Radikal bebas yang terbentuk dapat memicu mutasi DNA
sehingga terbentuk klon baru (transform c ell), selanjutnya dapat memicu
terjadinya suatu keganasan (malignant) (Sudiana, 2008 ; Kresno, 2011).
Bahan kimia yang bersifat karsinogenik memiliki sifat yang sama, yaitu
memicu terjadinya mutasi gen. Bahan kimia akan mengadakan ikatan dengan
rantai DNA, sehingga DNA menjadi cacat (defect) (Sudiana, 2008).
Pertumbuhan KSSRM sangat dipengaruhi faktor eksogen dan endogen.
KSSRM dapat terjadi akibat fungsi protein yang abnormal, akibat mutasi gen.
Proliferasi berlebihan dan tidak terkendali dari sel yang abnormal dapat
terjadi akibat gangguan siklus sel. Apoptosis yang mengalami kegagalan juga
berperan terhadap karsinogenesis pada mukosa rongga mulut. Terdapat 4
golongan gen mengatur pertumbuhan normal yaitu protooncogene, tumor
suppressor gene, apoptosis gene serta DNA repair gene (Epstein and Waal,
2008).
Karsinoma sel skuamous rongga mulut dapat diturunkan, akan tetapi
herediter sendiri tidak memainkan peranan utama, kebanyakan dihubungkan
dengan lesi prekanker, khususnya leukoplakia (Syafriadi, 2008).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
2.1.2.2 Patobiologi molekuler sel skuamosa rongga mulut (KSSRM)
Perkembangan kanker dipengaruhi oleh banyak faktor dan pada
umumnya merupakan interaksi antara faktor gen dan faktor lingkungan (genenvironment interaction), khususnya lingkungan mikro yang ada di sekitar
kanker, yaitu hubungan antara perubahan genetik yang menyebabkan kanker
dengan aktivasi reaksi inflamasi pro-kanker (Kresno, 2011).
Patogenesis molekuler karsinoma sel skuamosa rongga mulut merupakan
akumulasi perubahan genetik yang melibatkan gen-gen, protooncogene dan
gen s upresor t umor (TSG), faktor-faktor lain yang terlibat antara lain;
kematian allel pada kromosom lain, mutasi
protooncogene dan TSG,
perubahan epigenetik seperti metilasi DNA atau deasetilasi histone (Epstein
and Waal, 2008).
Karsinogenesis skuamosa rongga mulut merupakan proses kejadian
genetik, yang mengubah fungsi normal protooncogene dan tumor suppressor
gene, hal ini dapat mengakibatkan peningkatan produksi faktor pertumbuhan,
peningkatn produksi faktor transkripsi. Hilangnya aktivitas penekan tumor
menghasilkan fenotip sel yang mampu meningkatkan proliferasi sel yang
cacat/abnormal. Secara fisiologis sistem pertumbuhan sel dalam individu
diatur oleh sistem keseimbangan antara apoptosis dan proliferasi. Apabila
pada individu terjadi proliferasi secara berlebihan, maka akan terjadi massa
tumor (William, 2000; Sudiana, 2008).
Keganasan pada umumnya dapat terjadi melalui dua mekanisme yaitu
pertama, pemendekan waktu siklus sel sehingga akan menghasilkan lebih
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
banyak sel yang diproduksi dalam satuan waktu. Kedua, penurunan jumlah
kematian sel akibat gangguan pada proses apoptosis. Gangguan pada
berbagai protooncogen yang merangsang sel dan gen penekan tumor (TSGs)
yang menghambat penghentian proses siklus sel (Mendelsohn et al, 2008).
Gen p53 merupakan
tumor s upresor ge n, yang berfungsi mencegah
replikasi sel pada sel yang cacat atau rusak secara genetik melalui
penghentian siklus sel, sehingga sel mempunyai waktu untuk menginduksi
apoptosis. Gen p53 tidak bisa berfungsi akan menyebabkan proses apoptosis
tidak bisa berjalan sehingga sel yang cacat akan terus berproliferasi
(Lumongga, 2008).
Dalam kaitan dengan pengendalian onkogenesis, apoptosis merupakan
mekanisme penting untuk mencegah proliferasi sel yang mengalami
kerusakan DNA, agar sel-sel dengan lesi DNA tersebut tidak dilipatgandakan.
Apoptosis berfungsi sebagai salah satu kontrol dalam siklus sel. Kegagalan
sel-sel tumor untuk melaksanakan mekanisme apoptosis merupakan salah
satu faktor yang mendasari pertumbuhan kanker yang makin lama makin
besar. Selain akibat instabilitas genetik dan akumulasi kelainan genetik, juga
akibat perubahan terhadap aturan yang ditentukan pada checkpoint siklus sel
untuk menginduksi apoptosis (Budhy, 2004).
Salah satu upaya mengatasi masalah kanker adalah mengembalikan
fungsi gen yang terganggu, salah satu diantaranya adalah mengembalikan
fungsi apoptosis. Hingga saat ini khemoterapi maupun radiasi yang ditujukan
untuk membunuh sel kanker melalui apoptosis, tetapi seperti telah diuraikan
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
di atas fungsi apoptosis pada kanker seringkali terganggu, sehingga tidak
jarang menyebabkan resistensi terhadap terapi. Karena itu pengetahuan rinci
tentang jalur apoptosis dapat membantu untuk memberikan terapi yang lebih
spesifik (Kresno, 2011).
2.2 Kematian Sel
Kematian sel terjadi setiap saat, kematian dapat bersifat fisiologis
maupun patologis, keduanya adalah akibat serangkaian jejas atau stimulus.
Pertumbuhan dan kematian sel adalah untuk upaya tubuh mencapai
homeostatis jaringan (Pelengaris, et al.,2006). Kematian sel, secara morfologi
dapat menunjukkan gambaran campuran apoptosis dan nekrosis (Yakovlev
and Faden, 2004).
2.2.1 Apoptosis
Apoptosis merupakan mekanisme alamiah yang dialami oleh sel. Ada dua
alasan utama mengapa sel melakukan mekanisme ini. Pertama apoptosis
memang diperlukan untuk proses pertumbuhan atau perkembangan sel,
jaringan atau organ lebih lanjut. Alasan kedua adalah untuk menghancurkan
sel-sel yang dianggap membahayakan bagi integritas organisme itu sendiri,
seperti sel yang terinfeksi oleh virus, sel dengan kerusakan DNA maupun
kanker (Meir, 2000; Nurhayati dan Lusiyanti, 2006).
Apoptosis merupakan kematian sel melalui mekanisme genetik yang
melibatkan kerusakan atau fragmentasi kromosom maupun DNA. Apoptosis
merupakan kematian yang terprogram sebagai respons terhadap rangsang
tertentu.
Disertasi
Berbagai
rangsangan
tersebut
diantaranya
adalah
radiasi,
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
kemoterapi, infeksi virus, gangguan hormonal, bahan-bahan kimia dan faktor
pertumbuhan (Salido et al., 2009).
Apoptosis merupakan bentuk kematian sel yang diperlukan baik untuk
perkembangan sel normal maupun homeostatis jaringan. Peristiwa ini
dikendalikan secara ketat oleh berbagai gen, baik gen yang bersifat apoptotik
maupun anti apoptotik. Apoptosis terjadi melalui 3 fase yaitu; fase inisiasi,
fase efektor dan fase ekskusi atau degradasi (Kresno, 2011).
Apoptosis adalah program bunuh diri intraseluler, terlaksana dengan
mengaktifkan caspase. Apoptosis diawali oleh aksi termasuk yang dimediasi
oleh reseptor dari kompleks sinyal yang menginduksi kematian DISC (Death
Inducing Signaling C omplex). Komponen utama dari DISC adalah FasL
(CD95L), TRAIL (Tumor Necroting F actor-Related A poptosis I nducing
Ligand). Sekali teraktivasi oleh mekanisme aktifasi atau autokatalisator,
maka kerusakan sel bermula pada caspase 8 yang melepaskan DISC, yang
menyebabkan aksi selanjutnya. Caspase ini juga dinamakan caspase
pengekskusi (Baert, 2008).
2.2.1.1 Apoptosis fisiologis
Kematian sel yang diprogram. Proses kematian sel ini sangat berkaitan
dengan suatu enzim yang dikenal telomerase. Pada sel embrional enzim ini
mengalami aktivasi, sedangkan pada sel somatik enzim ini tidak mengalami
aktivasi, kecuali sel yang bersangkutan mengalami transformasi menjadi
ganas (Salido et al., 2009).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Telomer yang terletak pada ujung kromosom merupakan salah satu faktor
yang sangat penting dalam melindungi kromosom. Pada sel normal, telomer
ini akan mengalami pemendekan pada waktu sel melakukan pembelahan diri.
Bila ukuran telomer mencapai ukuran tertentu (level kritis) sebagai akibat dari
pembelahan berulang, maka sel tersebut tidak dapat melakukan pembelahan
diri lagi. Selanjutnya akan terjadi fragmentasi kromosom dan akhirnya sel
mengalami apoptosis secara fisiologis (Sudiana, 2008).
Pada sel ganas, pemendekan telomer sampai pada level kritis tidak akan
terjadi, karena pada sel ganas terjadi aktivitas dari enzim ribonukleoprotein
(telomerase) secara terus menerus, dimana enzim ini sangat berperan pada
sentesis telomeric DNA, sehingga berbagai elemen yang dibutuhkan pada
pembentukan telomer dapat dibentuk secara terus menerus dan keberadaan
ukuran telomer pada ujung kromosom dapat dipertahankan. Pada sel normal,
aktivitas telomerase waktunya terbatas, tetapi pada sel kanker enzim ini
sangat aktif, sehingga terjadi pemblokiran proses pemendekan telomer pada
waktu pembelahan diri. Oleh karena itu, maka sel ganas dapat bersifat
immortal (Mendelsohn et al., 2008).
2.2.1.2 Apoptosis patologis
Kematian sel karena adanya suatu rangsangan. Proses kematian sel
(apoptosis) ini dapat melalui beberapa jalur, antara lain;
a.
Aktivitas wild p53
Terjadinya apoptosis yang dipicu oleh aktivitas wild p53 karena sel
yang bersangkutan memiliki gen yang cacat (gene defect). Kecacatan gen
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
dalam suatu sel dapat dipicu oleh banyak faktor antara lain bahan kimia,
radikal bebas, maupun virus (oncovirus). Gen yang cacat dapat memicu
aktivitas beberapa enzim seperti PKC dan CPK-K2. Dimana kedua enzim
memicu aktivitas wild p53, wild p53 merupakan faktor transkripsi
terhadap pembentukan p21. Peningkatan p21 yang disentesis akan
menekan semua CDK. Terjadinya siklus pembelahan sel sangat
tergantung pada ikatan kompleks antara CDK dengan cyclin (Kresno,
2011).
CDK yang muncul pada fase M adalah CDK-1. Demikian juga
halnya CDK yang muncul pada fase S adalah CDk-2, CDK-4, CDK-6.
Cyclin adalah suatu protein yang dihasilkan oleh sel, dimana protein ini
dapat muncul dan hilang pada fase siklus sel, cyclin pada fase M adalah
cyclin A dan cyclin B, pada fase G-1 adalah cyclin-D dan cyclin-E.
Sementara pada fase S adalah cyclin-A dan cyclin-E (Sudiana, 2008).
Apabila terjadi peningkatan p21, maka semua CDK akan ditekan,
dengan terjadinya penekanan semua CDK pada fase siklus sel, maka
siklus sel akan berhenti. Saat siklus sel berhenti, wild p53 akan memicu
Bax, protein Bax akan menekan aktivitas Bcl-2 pada membran
mitokondria, sehingga terjadi perubahan permeabilitas membran dari
mitokondria. Perubahan ini mengakibatkan terjadi pelepasan cytokrom-c
ke sitosol. Di sitosol, cytokrom-c akan mengaktivasi Apaf-1 yang
selanjutnya akan mengaktivasi kaskade- kaspase. Kaspase yang aktif ini
akan mengaktifkan DNA-se. Kemudian DNA-se yang aktif menembus
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
membran inti dan merusak DNA, sehingga DNA sel yang bersangkutan
rusak (fragmentasi) dan akhirnya sel mengalami kematian (apoptosis),
(Mendelsohn et al., 2008).
b. Jalur sitotoksik
Terjadinya apoptosis melalui jalur sitotoksik ini dipicu oleh adanya
sel yang memiliki gen cacat (gene defect). Dengan adanya kecacatan gen
ini, maka sel tersebut akan mengekspresikan protein asing. Protein asing
yang dihasilkan dapat bersifat imunogenik, sehingga memicu terjadinya
proses pembentukan antibodi. Antibodi yang terbentuk dapat menempel
dipermukaan sel tertentu. Hal ini terjadi karena ada beberapa sel yang
pada membrannya memiliki FC receptor dan antibodi (khususnya FC
receptor terhadap Ig-G), antara lain sel killer. Dengan adanya reseptor
tersebut, maka antibodi yang berada di permukaan killer, selanjutnya
akan mengikat protein asing yang berada di permukaan sel yang
memiliki gen cacat (Kresno, 2011).
Adanya ikatan sel killer akan melepaskan suatu enzim yang disebut
sebagai sitotoksin. Sitotoksin yang dilepas oleh sel killer tersebut
mengandung perforin dan granzyme. Perforin dapat memperforasi
membran sel yang memiliki gen cacat. Kemudian granzyme dimasukkan
ke dalam sel tersebut. Granzyme yang berada di dalam sitosolik dari sel
yang memiliki gen cacat tersebut akan mengaktivasi kaspase kaskade.
Selanjutnya, kaspase yang aktif ini mengaktivasi DNA-se. DNA-se inilah
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
yang merusak DNA yang berada di dalam inti, sehingga sel mengalami
kematian (apoptosis) (Mendelsohn, et al., 2008).
c.
Kompleks fas dan ligand
Terjadinya apoptosis melalui jalur ligand dan fas dapat terjadi
karena dipicu oleh adanya sel tumor atau sel kanker. Pada sel tumor atau
sel kanker, di permukaannya akan tereksperesi suatu protein yang disebut
fas. Sementara di dalam tubuh terdapat beberapa sel seperti NK-cell
(Natural Killer Cell) dan CTL (Cytotoxic T-Lymphocyte) (Baratawidjaja
dan Rengganis, 2010).
Cytotoxic T -Lymphocyte adalah suatu sel ketahanan tubuh yang
dapat mengekspresikan ligand, sehingga fas di permukaan sel tumor atau
kanker akan diikat oleh ligand yang berada di permukaan NK-cell atau
CTL. Adanya ikatan antara fas-ligand tersebut menimbulkan sinyal
transduksi ke dalam sitosol pada sel kanker, sehingga di dalam sitosol
pada sel tersebut terjadi aktivasi suatu protein yang disebut sebagai Fas
Associated P rotein D eath D omain
(FADD).
FADD
kemudian
mengaktivasi kaskade-kaspase, kaskade-kaspase yang aktif mengaktifkan
DNA-se. DNA-se masuk ke dalam inti dan merusak DNA sehingga sel
mengalami apoptosis (Sudiana, 2008). Untuk mendeteksi jumlah sel
yang mengalami apoptosis diperiksa dengan pemeriksaan tunnel assay
(Sudiana, 2008).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
2.2.1.3 Jalur Utama Apoptosis
Jalur utama apoptosis ada dua yaitu jalur intrinsik (mitokondria ) dan
jalur ekstrinsik (death receptor pathway). Kedua jalur terhubung satu dengan
lain, molekul di jalur yang satu dapat mempengaruhi molekul di jalur yang
lain. Selain itu ada jalur tambahan yang melibatkan sitotoksisitas yang
dimediasi oleh sel T dan pembunuhan sel yang bergantung pada perforin
/granzim tetapi yang paling berperan dalam bidang onkologi adalah jalur
intrinsik dan jalur ekstrinsik (Nurhayati dan Lusiyanti, 2006; Kresno, 2011).
Gambar 2.2 Tiga jalur apoptosis yaitu jalur ekstrinsik (death-receptor
pathway), jalur intrinsik yang juga disebut jalur mitokondria
dan jalur perforin/granzim (Jalur ekstrinsik dan jalur intrinsik
merupakan jalur utama) (Kresno, 2011).
a.
Jalur Intrinsik
Jalur intrinsik yang mengawali apoptosis melibatkan sejumlah
besar stimulus yang tidak dimediasi reseptor, yang menghasilkan sinyal
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
intrasel dan berkaitan erat dengan mitokondria. Stimulus yang mengawali
jalur intrinsik menghasilkan sinyal intrasel yang dapat berupa sinyal
negatif atau sinyal positif. Semua stimulus menyebabkan perubahan pada
pori membran mitokondria sehingga menjadi permeable dan dilepaskan
dua kelompok protein pro-apototik ke dalam sitosol. Kelompok pertama
terdiri
atas
cytochrome-c,
Smac/DIABLO,
dan
serine
protease
HtrA2/Omi. Protein-protein ini mengaktivasi jalur mitochondria yang
bergantung caspase. Cytochrome-c mengikat Apaf-1 dan pro-caspase-9
dan
membentuk
apoptosom.
Smac/DIABLO
dan
HtrA2/Omi
mempromosikan apoptosis dengan cara menghambat IAP (inhibitor o f
apotosis pr otein). Kelompok kedua adalah AIF, endonuklease G dan
CAD, yang dilepaskan pada saat sel akan mengalami (committed)
apoptosis. Pengontrolan dan pengaturan proses dalam jalur mitochondria
dilakukan melalui keluarga protein Bcl-2 (Kreno, 2011).
b. Jalur Ekstrinsik
Jalur ekstrinsik melibatkan interaksi yang dimediasi oleh reseptor
transmembran, mencakup antara lain reseptor kematian (death-receptor)
keluaga TNF. Receptor dari keluarga memiliki domain ekstra sel yang
kaya akan cystein dan memiliki domain sitoplasmik yang disebut deathdomain yang berperan penting dalam meneruskan sinyal kematian dari
permukaan sel ke jalur persinyalan intrasel. Saat ini telah diketahui ada
beberapa jenis ligand untuk masing-masing reseptor yang karakteristik
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
dan fungsinya sudah jelas, yaitu Fas/FasR, TNFα/TNFR, Apo3L/DR3,
Apo2L/DR4 dan Apo2L/DR5.
Urutan peristiwa yang terjadi pada jalur ekstrinsik dimulai dengan
pengikatan ligand, misalnya FasL, dengan FasR, disusul dengan
rekrutmen protein-protein adapter sitoplasmik yang merupakan death
domain yang berikatan dengan reseptor tersebut. Dalam hal jalur
FsL/FasR, death domain-nya adalah FADD (Fas associated de ath
domain ), sedangkan pada jalur TNF/TNFR adapter protein yang terikat
adalah TRADD (TNF r eceptor as sociated de ath dom ain). FADD dan
TRADD kemudian berikatan dengan pro-caspase-8 melalui dimerisasi
domain efektor kematian (death efffector dom ain). Pada saat ini
terbentuklah
death
inducing s ignaling c omplex
(DISC)
yang
menyebabkan aktivasi autokatalitik pro-caspase-8. Setelah caspase-8
diaktivasi, terjadi stimulasi fase ekskusi. Apoptosis yang dimediasi oleh
reseptor kematian dapat dihambat oleh protein yang disebut c-FLIP yang
mengikat FADD dan caspase-8 sehingga keduanya menjadi tidak efektif
(Kresno, 2011).
2.2.2 Nekrosis
Nekrosis adalah kematian sel, yang terjadi pada kasus jejas berat dan
akut (misalnya anoksia yang mendadak) atau jejas karena faktor fisiko kimia
yang ekstrim (misalnya panas, detergen, basa kuat, dan radiasi). Tetapi
penelitian mutakhir, menunjukkan bahwa kematian nekrotik juga pada masa
perkembangan dan fisiologi sel normal. Khususnya pada beberapa kondisi
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
patologik (misal iskemia otak) atau kerusakan jantung yang disebabkan oleh
sitokin dan toksin, kematian sel dapat terjadi kedua-duanya melalui nekrosis
dan apoptosis. Secara morfologi, nekrosis ditandai dengan pembengkakan
seluler. Hal ini menyebabkan membran plasma pecah yang berakibat pada
pelepasan isi sitoplasma ke jaringan sekitarnya yang menyebabkan respons
inflamasi. Organel juga bengkak dan pecah, sedang inti masih utuh meskipun
dalam keadaan mmbengkak terjadi penggumpalan kromatin, degradasi DNA.
Degradasi DNA fragmen besar pada waktu nekrosis lebih mengendalikan
serin pr otease daripada kaspase untuk menginduksi aktifitas endonuklease.
Lebih jauh faktor kondensasi kromatin tidak bergantung kaspase AIF ini bisa
berperan juga, seperti merelokalisasi inti selama nekrosis. Keberadaan jalur
kematian sel seperti nekrosis ini diatur oleh program kematian intrinsik yang
khusus yang berbeda dengan apoptosis. Elemen pokok pada nekrosis
fosforilasi oksidatif mitokondria, produksi oksigen reaktif, dan kaskade
proteolitik non kaspase yang tergantung serin protease yaitu calpain atau cat
thepsin. Nekrosis merupakan kematian sebagian jaringan (Pulmeriastuti,
2006).
Nekrosis adalah kematian sel karena adanya kerusakan sistem membran.
Kerusakan membran ini disebabkan adanya aktivitas suatu enzim lisozim.
Aktivitas enzim lisosim dapat terjadi karena adanya kerusakan sistem
membran, oleh suatu faktor tertentu, yang mengakibatkan membran
pembungkus enzim lisozim tersebut mengalami kebocoran. Adanya
kebocoran mengakibatkan lisozim tampah ke sitosol dan akhirnya mencerna
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
protein-protein, baik yang berada pada sitosol maupun protein penyusun
sistem membran dari sel tersebut (Sudiana, 2008).
2.3 Proliferasi sel
Pada sel normal terdapat keseimbangan antara faktor pertumbuhan sel
dan faktor kematian sel (apoptosis) yang dipengaruhi oleh protooncogene dan
tumor suppresor ge ne. Pertumbuhan sel terjadi karena penambahan ukuran
dan jumlah sel dari populasi sel yang aktif melakukan siklus sel atau aktivitas
proliferasi. Keseimbangan dalam pertumbuhan harus terkontrol. Pada
manusia dewasa jumlah sel relatif tetap. Mitosis pada manusia dewasa
bertujuan untuk menggantikan sel yang mati karena proses apoptosis atau
nekrosis. Kegagalan kontrol keseimbangan mekanisme tersebut dapat
mengakibatkan siklus sel yang tidak terkendali (Mendelsohhn et al., 2008).
Siklus pembelahan sel :
Siklus pembelahan sel pada dasarnya dibagi dua fase :
1.
Fase mitosis (M)
2.
Fase (fase i nterval), fase antara akhir mitosis dan awal mitosis yang
disebut sebagai interfase. Penggandaan DNA terjadi pada interfase yang
disebut sebagai fase S (sintesis), sedangkan penggandaan sel terjadi pada
fase M (mitosis). Jeda antara akhir fase M dengan awal S disebut fase G1, sedangkan jeda akhir fase S dengan awal fase M disebut fase G-2.
Sehingga siklus sel dikenal ada empat fase, yaitu fase M, G-1, S dan G-2.
Pertumbuhan sel kanker berhubungan erat dengan proliferasi, kematian
sel dan derajat diferensiasi. Derajat diferensiasi sel makin jelek, sifat kanker
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
semakin ganas dan makin cepat pertumbuhannya. Aktivitas proliferasi sel
sangat tergantung pada waktu sel (cell c ycle tim e) yaitu waktu yang
diperlukan untuk suatu proses mitosis ke mitosis berikutnya. Siklus
pembelahan sel dikendalikan oleh suatu protein regulator yaitu cyclin dan
katalisator Cyclin D ependent K inase (CDK). Siklus proliferasi sel atau
pembelahan sel dihambat oleh inhibitor, antara lain ; p2, p21, p27 dan p57.
Inhibitor ini akan mengikat CDK-cyclin complex sehingga menghambat
aktivitas kinase yang akhirnya menghentikan siklus pembelahan sel (Roger
and Robin, 2006).
2.4 Regulasi Apoptosis
2.4.1 Bcl-2
Regulasi dalam apoptosis antara lain adalah anggota keluarga Bcl-2. Ada
18 anggota keluarga Bcl-2 yang diketahui sampai saat ini, dibagi dalam tiga
sub kelompok, yang didasarkan atas strukturnya. Anggota sub kelompok
pertama diwakili oleh Bcl-2 dan Bcl-xl yang memiliki fungsi sebagai anti
apoptosis (Mendelsohn et al., 2008).
Bcl-2 ( B C ell L ymphoma) adalah suatu protein yang berukuran 26 kDa
yang berfungsi sebagai penekan kematian sel yang terprogram (apoptosis).
Bcl-2 menghambat apoptosis dan memperpanjang masa hidup sel saat ada
sinyal apoptosis (Baert, 2008).
Keseimbangan protein anti dan pro kematian sangat mempengaruhi
sel terhadap proses apoptosis. Bcl-2 dan Bax merupakan protein yang penting
dalam menentukan sel untuk proses apoptosis. Bcl-2 merupakan protein yang
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
mencegah apoptosis atau anti apopt osis dan mempromosikan pertumbuhan
sel, sedang Bax memicu terjadinya apoptosis yang menyebabkan kematian
sel. Keseimbangan antara Bcl-2 dan Bax adalah merupakan hal yang penting
apakah sel akan terus tumbuh atau mengalami apoptosis (Pelengaris et al .,
2006).
Bcl-2 merupakan protein regulator apoptosis sepanjang 25 kDa yang
terletak pada membran mitokondria bagian dalam retikulum endoplasma dan
selubung
neklues.
Ekspresinya
dikaitkan
dengan
proliferasi
sel,
perkembangan jaringan dan morfogenesis (Solomon et al., 2010).
Bcl-2 mengkode protein yang berperan sebagai anti apopt osis.
Dimana protein ini bekerja untuk menekan fungsi protein Bax pada membran
mitokondria karena protein Bax berperan membuka pt-pore, sehingga
cytochrome-c keluar dari mitokondria. Cytochrome-c kemudian mengaktifkan
Apaf-1. Selanjutnya, Apaf-1 mengaktivasi kaskade-kaspase, sehingga sel
mengalami kematian (apoptosis). Dengan adanya aktivasi dari protein Bcl-2,
maka apoptosis tidak terjadi (Sudiana, 2008).
Bcl-2 merupakan protein regulator apoptosis sepanjang 25 kDa yang
terletak pada membran mitokondria bagian dalam, retikulum endoplasma dan
selubung nukleus, ekspresinya dikaitkan dengan proliferasi sel kanker,
perkembangan jaringan sel kanker (Solomon, 2010).
Bcl-2 dikenal sebagai inhibitor apoptosis. Bcl-2 secara spesifik
menghambat kemampuan c-myc untuk menginduksi apoptosis. Ekspresi
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Bcl-2 dapat diperiksa melalui reaksi komplek antigen antibodi dengan
pemeriksaan imunohistokimia metode streptavidin-biotin.
2.5 Regulasi Proliferasi
2.5.1 Wild p53
Tumor suppressor protein adalah suatu protein yang berperan sebagai
faktor pengendalian pertumbuhan sel, yang termasuk kelompok ini adalah;
pRb, wild p53. Protein pRb dan wild p53 dapat bekerja di dalam inti sel,
khususnya pada proses pengendalian siklus pembelahan sel, dimana pRb
berperan pada pengendalian faktor transkripsi pada siklus pembelahan sel,
sedangkan wild p53 berperan pada pengendalian CDK pada siklus
pembelahan sel. Selain itu wild p53 juga mempunyai peran dalam pengaturan
kematian sel (apoptosis), yaitu merusak sel yang memiliki urutan nukleotida
yang abnormal (Mendelsohn et al., 2008).
Secara fisiologi pada sel, ada suatu sistem yang mengatur susunan
nukleotida pada rantai DNA yang mengalami perubahan (mutasi). Sistem
tersebut dikenal dengan DNA repair. Kerja dari sistem ini adalah dengan
memperbaiki urutan DNA yang mengalami mutasi. Artinya, apabila terjadi
kerusakan susunan DNA baik disebabkan oleh suatu karsinogen atau
ultraviolet, maka akan muncul suatu respons sel yang disebut sebagai NER
(Nucleotidie Excision Repair). Secara konseptual kerja NER ini dibagi dalam
lima fase, yaitu (1) Damage recognition (b) Incision (c) Excision (d)
Synthesis repair dan (e) Ligation. Oleh karena itu, secara normal sel yang
hanya dapat melakukan proliferasi dan diferensiasi adalah sel yang DNA-nya
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
memiliki susunan nukleotida yang tidak menyimpang. Apabila perbaikan
DNA gagal, maka akan dilakukan penghentian pertumbuhan sel melalui
penghambatan siklus pembelahan sel, dan selanjutnya terjadi apoptosis.
Selain p21 ekspresinya dikendalikan oleh wild p53, yang bekerja dengan
menghambat semua CDK, juga ditemukan beberapa protein yang berperan
pada siklus pembelahan sel, seperti p15 dan p16. Namun, pengaturan ekspresi
dari protein p15 dan p16 sampai saat ini belum jelas. Akan tetapi, target kerja
dari kedua protein tersebut telah diketahui dengan jelas, yaitu menghambat
CDK-4 dan CDK-6 pada fase G-1. Kinase yang bekerja memicu aktivitas
wild p53 untuk memodulasi protein Bax pada proses apoptosis, antara lain
CPK-2 (Cystein Protein Kinase-2) dan PKC (Sudiana, 2008).
Wild p53 adalah suatu tumor s uppressor gene dengan Berat Molekul
(BM) 53 kDa, terletak pada kromosom 17 lengan pendek (17p) dan
mempunyai 11 ekson serta memiliki tiga domain struktural yang
diekspresikan pada semua jaringan tubuh. Struktur
wild p53 terdiri atas
daerah N terminal trans-aktivasi, daerah DNA binding dan daerah C terminal.
Daerah N terminal trans-aktivasi bertanggung jawab mengatur stabilitas wild
p53 intrasel. Ikatan dengan MDM2 (Murine D ouble Minute 2) akan
menghambat trans-aktivasi wild p53 dan menyebabkan degradasi wild p53.
Daerah DNA binding spesifik berguna untuk menempel wild p53 pada DNA
di mana penempelan ini berefek menghambat proses transkripsi. Daerah C
terminal berfungsi untuk menempel wild p53 pada rantai tunggal DNA
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
menyebabkan wild p53 dapat berfungsi untuk aktivasi GADD45 pada proses
perbaikan DNA dan Bax pada apoptosis (Cotran, 2005).
Fungsi protein wild p53 mendeteksi sintesis DNA yang salah atau
kerusakan DNA dan mengatur kelangsungan perbaikan DNA. Salah satu
mekanisme kerja wild p53 adalah menghentikan siklus sel pada fase G1
melalui cell cycl e inhibitor. Wild p53 memicu transkripsi p21, peran p21
bekerja menghambat semua jenis CDK (Cyclin Dependent K inase). Jika
hambatan pertumbuhan sel melalui siklus pembelahan atau perbaikan DNA
kurang sempurna, maka terjadilah apoptosis. Fungsi wild p53 dalam
apoptosis dapat melalui aktivasi Bax dan menghambat aktivitas gen yang anti
apoptosis yaitu Bcl-2 dan Bcl-xl (Kresno, 2011).
Mutasi gen p53 pada umumnya adalah point mutation akan mengubah
sifat protein yang diproduksinya sehingga menghilangkan kemampuan
protein wild p53 baik sebagai materi antiproliferasi, maupun sebagai pengatur
proses apoptosis. Aktivitas wild p53 dapat diatur oleh Murine Double Minute
2 (MDM2). MDM2 dapat mengikat terminal amino (ujung N) dari wild p53,
menyebabkan wild p53 tidak stabil dan dikeluarkan dari inti sel ke
sitoplasma, menekan aktivitas wild p53 dan menyebabkan degradasi wild p53
yang diperantai proteosome. Gene MDM2 diregulasi secara positif oleh wild
p53 sehingga membentuk lingkaran umpan balik (Hui et al., 2004). Ekspresi
wild p53 dapat diperiksa melalui reaksi komplek antigen-antibodi dengan
pemeriksaan imunohistokimia metode streptavidin-biotin.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
2.6 Angiogenesis dan VEGF
Kemampuan kanker untuk menginduksi pembentukan pembuluh darah
baru (angiogenesis) sangat berpengaruh pada pertumbuhan kanker dan
metastasis. Aktivitas angiogenesis mengakibatkan ekspansi pertumbuhan
kanker
dan
meningkatkan
resiko
metastasis.
Pertumbuhan
kanker
berlangsung baik bila mendapat cukup suplai darah melalui vaskularisasi
untuk keperluan metabolisme dan proliferasi dan untuk memenuhi kebutuhan
ini kanker meningkatkan kemampuan neovaskularisasi. Kemampuan
angiogenesis dan metastasis menentukan tingkat keganasan kanker, karena
itu analisis kemampuan angiogenesis kanker dapat berperan dalam
menentukan prognosis dan penatalaksanaan penderita kanker (Kresno, 2011).
Angiogenesis adalah pertumbuhan pembuluh darah baru dari
pembuluh darah yang sudah ada, merupakan salah satu faktor penting pada
perkembangan sel kanker. Sel kanker akan meningkatkan jumlah inducer
angiogenesis
dan
mengurangi
jumlah
inhibitor
angiogenesis
yang
disekresikan (Hasina et al., 2001).
Banyak faktor yang berpengaruh pada mekanisme angiogenesis, salah
satu diantaranya adalah; hipoksia (hipoxia inducible factor), misalnya gen
yang menyandi enzim glikolitik seperti aldolase-A, enolase dan LDH-A. Ke
dalam kelompok ini juga termasuk VEGF (vascular e ndothelial gr owth
factor), sesuai namanya merupakan faktor pertumbuhan endotel yang
mendukung pembentukan pembuluh darah baru. Selama pembentukan kanker
terjadi gangguan keseimbangan antara produksi faktor pro dan anti
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
angiogenik dikenal dengan istilah angiogenik s witch, yang memungkinkan
berlangsungnya proliferasi dan pertumbuhan sel kanker. Banyak faktor yang
memberi kontribusi dalam perubahan keseimbangan itu, diantaranya adalah
faktor pertumbuhan yang diproduksi oleh kanker sendiri, perubahan
linkungan mikro (microenvironment), rekrutmen progenitor sel endotel dari
sumsum tulang dan penekanan inhibitor angi ogenesis alami (Mendelsohn et
al., 2008).
2.6.1 Angiogenesis
Angiogenesis atau neovaskularisasi merupakan proses penting untuk
pertumbuhan survival kanker. Proliferasi dan migrasi sel endotel diaktifkan
oleh beberapa faktor angiogenesis seperti tirosin k inase ,reseptor antara lain
vascular endothelial growth factor (VEGF) (Reuben et al.,2011).
Proses angiogenesis diatur melalui persinyalan, melalui berbagai jalur
transduksi sinyal seperti jalur tyrosine kinase. Diantara jalur-jalur itu, dalam
beberapa penelitian akhir-akhir ini terungkap jalur Natch memegang peran
kunci (sebagai koordinator) pada angiogenesis kanker dalam berbagai aspek
yang menyangkut sifat biologik sel endotel selama pembentukan pembuluh
darah. Aktivasi jalur Natch terbukti menghambat proliferasi dan migrasi sel
endotel, dan sebaliknya penekanan aktivitas jalur ini meningkatkan
proliferasi, motilitas dan peningkatan adhesi sel pada kolagen matrik
ekstraseluler, serta mengurangi kemampuan sprouting sel endotel (Kresno,
2011).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Banyak bukti-bukti penelitian yang menyatakan bahwa angiogenesis
atau neovaskularisasi merupakan proses penting untuk pertumbuhan kanker,
bahkan beberapa penelitian mengungkapkan bahwa pertumbuhan kanker
sangat bergantung pada angiogenesis. Beberapa penelitian yang langsung
mendukung teori adalah; 1) ditemukan inhibitor angiogenesis (AGM-1470)
yang menghambat proliferasi sel endotel in vivo maupun in vitro; 2)
ditemukan basic f ibroblast growth f actor (bFGF) yang mitogenik bagi sel
endotel vaskuler dan bersifat angiogenesis kuat. Bukti bahwa bFGF bersifat
angiogenesis diperoleh dari hasil yang mengungkap bahwa injeksi sistemik
bFGF merangsang densitas dan percabangan pembuluh darah dalam kanker
dan menambah volume kanker 2 kali lipat; 3) bukti lain yang mendukung
sifat angiogenik bFGF adalah apabila cDNA dari bFGF ditransfeksikan pada
fibroblast normal, fibroblast tersebut berubah menjadi angiogenesis
tumorigenik; 4) Pertumbuhan tumor otak pada mencit dihambat dengan cara
menekan fungsi reseptor VEGF, sehingga tidak terjadi sinyal angiogenesis
(Mendelsohn et al., 2011).
Proses terjadinya angiogenesis : 1) Jaringan yang rusak memproduksi
dan melepaskan faktor pertumbuhan (GF) yang berdifusi ke jaringan di
sekitarnya; 2) Faktor pertumbuhan angiogenik berikatan dengan reseptor
spesifik yang terdapatpada sel endotel pembuluh darah terdekat; 3) Setelah
GF berikatan dengan reseptornya sel endotel menjadi aktif. Sinyal
pertumbuhan diteruskan dari permukaan sel ke nukleus. Sel-sel endotel mulai
membentuk molekul-molekul baru termasuk enzim; 4) Enzim melarutkan
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
protein dan membentuk lubang-lubang kecil pada membran basal; 5) Sel
endotel mulai berproliferasi dan bermigrasi melalui lubang-lubang menuju
jaringan yang rusak ; 6) Molekul adhesi atau integrin berfungsi sebagai kait
membantu pembuluh darah yang baru; 7) Enzim-enzim misal MMP
diproduksi untuk menghancurkan jaringan didepan ujung pembuluh darah
baru; 8) Sel-sel endotel yang baru menggulung membentuk pembuluh darah
baru; 9) Setiap pembuluh darah saling berhubungan supaya darah dapat
bersirkulasi; 10) Pembuluh darah baru mengalami stabilisasi dengan bantuan
sel-sel otot yang menunjang struktur pembuluh (Kresno, 2011).
2.6.2 Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)
VEGF (Vascular endothelial growth factor) adalah suatu protein yang
berukuran 34- 42 kDa, memiliki kemampuan mitogenesis vaskulogenesis dan
angiogenesis (pertumbuhan pembuluh darah dari vaskuler yang sudah ada
sebelumnnya). Angiogenesis merupakan proses yang sangat kompleks,
diregulasi secara ketat oleh beberapa faktor proagiogenik (VEGF) dan faktor
antiangiogenik (Ellis, 2005).
VEGF merupakan regulator vaskulogenesisis maupun angiogenesis.
Sebagian besar jenis sel kanker mengekspresikan VEGF, seringkali dengan
kadar tinggi. Hal ini sejalan dengan bukti-bukti yang menyatakan bahwa
VEGF mudah mengalami perubahan genetik maupun epigenetik. VEGF
bersirkulasi memberikan sinyal melalui reseptor VEGFr-2, reseptor yang
memediasi sprouting angi ogenesis. Adanya temuan bahwa banyak jenis
kanker, termasuk kanker hematologik, mengekspresikan VEGFr (khususnya
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
VEGFr-1) dan sekaligus memproduksi VEGF mengindikasikan bahwa VEGF
dapat bertindak sebagai faktor pertumbuhan autocrine bagi sel kanker
(Kresno, 2011).
VEGF merupakan famili faktor-faktor pertumbuhan yang terlibat
dalam angiogenesis. VEGF mengikat ke tiga reseptor tirosin k inase yaitu;
VEGFr-1, VEGFr-2, VEGr-3 yang muncul pada sel-sel endotelial, peristiwa
pengikatan ini memicu proliferasi sel endotelial (Reuben et al., 2011).
Peningkatan VEGF dapat diinduksi oleh berbagai faktor lingkungan
mikro atau faktor epigenetik, misal hipoksia, sitokin, faktor pertumbuhan dan
khemokin, maupun kelainan genetik, misalnya mutasi gen p53. PTEN dan
aktivasi onkogen (diantaranya ras, EGFR dan her-2). Pengikatan VEGF pada
VEGFR mengaktifkan kaskade sinyal intraseluler yang berakibat peningkatan
permeabilitas vaskuler, proliferasi, survival, migrasi dan mobilisasi, dalam
hal ini sel-sel progenitor endotel (Mendelsohn et al., 2008).
Ekspresi VEGF dapat diperiksa melalui reaksi komplek antigenantibodi dengan pemeriksaan imunohistokimia metode streptavidin-biotin .
2.7 Benzopirene
Benzopirene (B(a)P) adalah senyawa polisiklik hidrokarbon aromatis
(PAH), dengan rumus kimia C 20 H 12 memiliki efek mutagenik yang terdapat
pada batu bara, minyak bumi, asap rokok, gas buangan motor dan makanan
yang dipanggang atau diasap. Benzopirene berupa kristal kuning, berbentuk
jarum, massa molekul : 252,3 dengan titik lebur 179-179,3oC. Benzopirene
adalah salah satu senyawa yang paling banyak diteliti karena sangat
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
karsinogenik (Guo et al ., 2002). Benzopirene menghasilkan senyawa
metabolit genotoksik BP-7,8 diol- 9,10-oxide. Senyawa genotoksik umumnya
diklasifikasikan berdasarkan susunan kimiawi, terbagi menjadi dua kategori
yaitu pertama senyawa yang secara langsung bersifat genotoksik dan kedua
senyawa yang metabolitnya bersifat genotoksik akibat proses biotransformasi,
bisa bersifat pro-mutagen atau secara langsung bersifat mutagen. Kerja
langsung agen genotoksik sering memiliki perangkat elektrofilik dan
kemudian bereaksi dengan molekul nukleofilik seperti DNA. Genotoksik tak
langsung
mempunyai
mekanisme
melalui
aktivasi
enzimatik
atau
biotransformasi. Sering bersifat lipofilik kemudian sel merubah mereka
menjadi produk larut air. Efek samping konversi ini dihasilkan elektrofilik
yang dapat beeaksi dengan beberapa nukleofilik yang ada yaitu protein, DNA
dan RNA, di sinilah awal terjadinya mutasi genetik (Walum et al., 2000).
Benzopirene merupakan bahan pro-karsinogenik yang akan menjadi
karsinogen jika terbentuk senyawa proximate c arcinogen dan ultimate
carcinogen dengan adanya aktivitas enzimatik. Pada tahap awal, B(a)P di
dalam sel mengalami reaksi epoksidasi pada posisi 7,8 oleh Mixed Function
Oxidase (MFO) yang mengandung bentuk sitokrom p-450 berlokasi pada
membran retikulum endoplasma dan DNA inti sel. Senyawa 7,8 arenoksida
B(a)P akan diubah menjadi senyawa non toksik jika menjadi 7-hidroksil
B(a)P melalui reaksi non enzimatik. Senyawa 7,8 arenoksida B(a)P akan
menjadi karsinogen dikatalis oleh enzim epoksida hidrolase menjadi 7,8 diol,
lalu dioksidasi oleh enzim monooksigenase membentuk ultimate carcinogen
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
yaitu 7,8 diol - 9,10 oxide yang merupakan senyawa yang sangat reaktif.
Mekanisme onkogenesis yang merupakan proses perubahan proto-oncogene
menjadi oncogene terjadi dengan cara mengikat basa guanin DNA sehingga
terjadi gannguan replikasi DNA mengakibatkan terjadi pertumbuhan kanker
(Guo et al., 2002).
Produk-produk metabolik benzopirene meliputi epoxide intermediates,
dihydrodiols, phenols, quinines dan kombinasi dari produk-produk tersebut.
Benzo
(a)
pyrene-7,8-hydrodiol-9,10-epoxide
adalah
toxicant
utama
benzopirene dan merupakan electrophilic epoxide yang diproduksi setelah
proses epoksidasi dua langkah (enzim cytochrome P450 dan epoxide
hydrolase). Benzo (a) pyrene-7,8-hydrodiol-9,10-epoxide adalah sebuah
epoxide electrophilic dan terbukti sangat mutagenik (Vidmar et al., 2004).
Benzopirene diserap melalui rute pemaparan oral, inhalasi dan dermal.
Absorbsi dari saluran gastrointestinal mencit dan kucing ditingkatkan ketika
dilarutkan dalam media yang memiliki sifat lipophilic dan hydrophilic (Faust
et al.,1994).
Benzopirene dimetabolisasi pada awalnya oleh sitokrom mikrosomal
P450 sistem monooxygenase ke beberapa arene ox ides, yang bisa tersusun
kembali secara spontan ke fenol, mengalami hidrasi ke trans-dihydrodiols,
atau bereaksi secara kovalen dengan glutathione-S-transferases. Salah satu
metabolik phenolic,6-hydroxybenzo (a) pyrene, dioksidasi menjadi 1,6- 3,6atau 6,12-quinones. Phenols, quinones dan dihydrodiols bisa didetoksifikasi
dengan konjugasi ke glucuronides dan sulfate e sters dan quinones bisa juga
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
membentuk glutathione c onjugate. Selain konjugasi, dihydrodiol ini
mengalami metabolisme oksidatif. Benzo (a) pyrene 7,8-dihydrodiol sebagian
dioksidasi menjadi 7,8-diol-9,10-epoxide, senyawa yang dianggap sebagai
metabolit karsinogenik utama Benzopirene (Faust et al.,1994).
Chemical Formula
: C 20 H 12
Chemical Structure
:
Gambar 2.3 Struktur Kimia Benzopirene (Vidmar et al., 2004)
Reaksi benzopirene setelah dipaparkan pada mencit seperti di bawah ini :
Gambar 2.4 Reaksi aromatik hidrosilasi dan epoksidasi (Sudiana, 2008)
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
2.8 Punica granatum L (Delima)
2.8.1 Klasifikasi, Nama Lain Komposisi Delima (National Plant Data Centre,
2000)
Klasifikasi delima adalah sebagai berikut :
Kingdom
: Plantae
Divisi
: Magnoliophyta
Kelas
: Magnoliopsida
Subkelas
: Rosidae
Ordo
: Mytales
Famili
: Lythraceae
Genus
: Punica
Spesies
: P. granatum L
Delima memiliki sebutan yang berbeda-beda tergantung dari daerah
mana buah berasal. Beberapa nama untuk delima adalah :
Inggris
: Wild pomegranata
Sumatera
: Glima (Aceh), Glimau mekah (Gayo), Dalimo (Batak),
Delima (Melayu)
Jawa
: Dlima (Jawa Tengah) Dhalima (Madura)
Nusa Tenggara : Jeliman (Sasak), Talima (Bima), Dila daelak (Roti),
Lekokae (Timor).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Gambar 2.5
Punica granatum L (Delima) (National Plant Data Center,
2000)
Ada 3 jenis delima yaitu; delima merah, delima putih dan delima hitam,
buahnya berwarna ungu tua yang sering dipakai sebagai penelitian adalah
delima merah. Delima merah kaya dengan kandungan anthocyanin
(pelargonidin dan c yanidins) dan merupakan antioksidan. Anthocyanin
dijumpai pada buah-buahan dan sayuran yang berwarna biru, ungu dan merah
(Seeram et al.,2005).
Jus delima merah memiliki antioksidan, antiinflamasi yang kuat dan
bersifat kemopreventif dan kemoterapi pada sel kanker prostat, kanker usus
besar secara invitro. Sifat antioksidan (menyumbang 92%), sifat antioksidan
yang kuat bersifat kemopreventif dan kemoterapi ( Seeram et al.,2005; Malik
et al.,2005).
2.8.2 Bahan Aktif Delima (PGL)
Berbagai kandungan fitokimia telah berhasil diidentifikasi dari bagian
tanaman delima. Kelompok utama fitokimia delima adalah polyphenol yang
banyak ditemukan pada buahnya. Polyphenol delima terdiri dari flavonoids
(flavonols, flavanols dan ant hocyanins), hydrolyzable t annins (ellagitannins
dan gallotannins) dan condensed tannins (proanthocyanidins). Fitokimia lain
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
yang ditemukan pada delima adalah organic dan phenolic a cid, sterols dan
triterpenoids, fatty acids, triglycerides dan alkaloids (Seeram et al., 2006).
Hydrolyzable tannins (HTs) sebagai bagian utama polyphenol dalam jus
delima memiliki aktivitas antioksidan
sebesar 92% (Gil et al ., 2000).
Punicalagin merupakan bagian HTs paling dominan, bertanggungjawab
terhadap hampir separuh dari aktivitas antioksidan jus delima, daun, batang
dan buah delima mengandung lebih dari 18 struktur HTs (Seeram et al .,
2006).
Flavonoid yang terkandung dalam delima telah terbukti memiliki
aktivitas antioksidan dengan melindungi membran sel dari pengaruh radikal
bebas. Senyawa yang termasuk flavonoid, yaitu lutheolin, quarcetin dan
kaempferol banyak ditemukan pada kulit delima, sedangkan anthocyanidins
banyak ditemukan pada bijinya (Seeram, et al., 2006).
Punicalagin, merupakan salah satu senyawa ellagitannins yang banyak
ditemukan pada selaput buah dan batang delima. Punicalagin yang
terkandung dalam jus delima memiliki aktivitas antioksidan hingga 89%.
Walaupun tidak dapat langsung diabsorbsi oleh tubuh karena ukurannya yang
besar, punicalagin akan mengalami hidrolisis di dalam usus sebelum
diabsorbsi. Proses hidrolisis yang ditandai dengan pembentukan ellagic acid
akan menyebabkan konsentrasi ellagic ac id yang stabil dalam hingga lebih
dari 6 jam setelah pemberian (Seeram et al., 2006).
Ellagic acid yang terbentuk akan dimetabolisme menjadi urolithin sekitar
12 jam setelah diabsorbsi dan urolithin dapat dideteksi dalam darah dan urin
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
hingga 48 jam setelah pemberian dosis tunggal. Ekstrak buah delima dan jus
delima memiliki metabolisme dan bioavailabilitas yang sama. Kandungan
ellagic ac id di dalam produk yang berasal dari delima digunakan sebagai
standart untuk menjamin bahwa produk tersebut mengandung ekstrak buah
delima yang asli.Standart ellagic ac id yang banyak digunakan dan optimal
untuk terapi adalah standarisasi 40% ellagic ac id (Jurenka, 2008; Zhang et
al., 2009).
Ellagic acid, suatu soluable polyphenol, telah terbukti memiliki aktivitas
antioksidan, antiinflamasi dan dapat mencegah destruksi gen p53 oleh sel
kanker. Ellagic acid dapat berikatan dengan sel kanker dan membentuk suatu
molekul kompleks, sehingga sel kanker menjadi inaktif. (Seeram et al., 2005).
Gambar 2.6 Struktur Kimia Punicalagin (a) dan Ellagic Acid (b) (Seeram
et al., 2005)
Ellagic acid merupakan inhibitor yang cukup potensial terhadap tyrosine
protein k inase, suatu molekul yang memiliki aktivitas yang berhubungan
dengan kemampuan virus tertentu untuk mentransformasi sel normal menjadi
sel kanker. Selain memiliki aktivitas kemoprotektif terhadap berbagai bahan
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
kimia yang mampu menginduksi kanker, ellagic acid juga memiliki aktivitas
anti bakteri dan antiviral. Fungsi lain dari ellagic acid adalah sebagai bahan
yang mampu melindungi kerusakan sel karena radikal bebas. Kemampuan ini
akan secara sinergis mengalami peningkatan apabila dikombinasi dengan
komposisi lain buah delima yang juga merupakan antioksidan yang cukup
kuat, yaitu anthocyanidin (Seeram et al., 2005; Lansky and Newman, 2007).
Anthocyanidins (pelargonidin dan c yanidins) merupakan antioksidan
yang telah terbukti dapat membantu memperbaiki fungsi pembuluh darah
baik pada manusia maupun hewan. Anthocyanidin banyak dijumpai pada
buah-buahan dan sayuran yang berwarma biru, ungu dan merah seperti
blueberries, blackberries, plum, cranberries, raspberries, strawberries,
delima, bayam merah dan kol merah. Anthocyanidin dapat ditemukan dalam
cairan sel (tidak seperti klorofil dan carotene yang menempel pada membran
sel). Warna pigmen dapat berubah-ubah sesuai dengan pH dari cairan sel.
Cairan sel yang sedikit asam akan membuat pigmen berwarna ungu.
Anthocyodin dapat dimanfaatkan untuk proses pembuatan makanan yang
menghindari pemakaian zat aditif sintetis (Seeram et al., 2006).
Empat kandungan kimia dalam buah delima merah (PGL), yaitu ellagic
acid, caffeic acid, luteolin dan punicid acid secara individual menunjukkan
aktivitas anti kanker pada sel kanker prostat secara invitro. Namun bila
dikombinasikan, keempatnya menunjukkan aktivitas yang berlipat ganda
(Seeram et al., 2006).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Delima (PGL) telah dikenal sejak lama di seluruh dunia karena memiliki
manfaat yang sangat luas bagi kesehatan. Secara garis besar, aktivitas yang
dimiliki oleh delima adalah sebagai antioksidan, antiinflamasi dan antikanker.
2.8.3 Aktivitas Delima (PGL) sebagai Antikanker, Antioksidan, dan
Antiinflamasi
Beberapa penelitian juga telah membuktikan bahwa buah delima (PGL)
memiliki kandungan fitofarmaka yang memiliki nilai pengobatan tinggi yang
dapat dilmanfaatkan untuk memperkaya kasanah bahan obat. Pohon dan buah
delima dapat dibagi menjadi beberapa kompartmen anatomi, seperti biji, sari
buah, kulit, dan bunga, batang dan akar, di mana kandungan masing-masing
bagian memiliki aktivitas farmakologi yang berbeda (Lansky and Nawman,
2007; Jurenka, 2008). Berbagai penelitian terhadap manfaat delima terhadap
berbagai penyakit adalah :
2.8.3.1 Aktivitas Antikanker
Kanker berkembang ketika keseimbangan antara proliferasi sel dan
kematian sel terganggu. Keganasan memerlukan pola terapi yang bersifat non
sitotoksik pada sel normal (Lansky and Newman, 2007) Fraksi polifenol yang
kaya akan flavonoid yang dimiliki delima telah terbukti memiliki aktivitas
anti invasi, antieicosanoid, bersifat menstimulasi apoptosis pada sel kanker
payudara dan prostat serta memiliki aktivitas anti angiogenik, baik invitro
maupun invivo. Jus delima mampu menurunkan ekspresi protein COX-2
sebasar 79% bila diberikan dengan konsentrast 50 mg/L. Dengan konsentrasi
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
yang sama, tannin delima hanya mampu mengurangi sebesar 55% dan
punicalagin sebesar 48% (Sartippour et al., 2008).
Penelitian secara invitro terhadap cell line
kanker prostat telah
membuktikan bahwa ekstrak berbagai tanaman delima potensial dalam
menghambat invasi dan proliferasi sel kanker prostat, menginduksi apoptosis
sel kanker dan menghambat pertumbuhan kanker. Penelitian ini juga
menemukan kombinasi ekstrak buah delima yang berasal dari berbagai bagian
buah lebih efektif bila dibandingkan dengan ekstrak tunggal bagian buah
(Albrecht et al., 2004 ; Lansky and Newman, 2007).
Penelitian tentang pengaruh delima terhadap penurunan prostate spesific
antigen (PSA) juga telah dilakukan. Setelah pemberian delima, terjadi
penurunan PSA hingga 27% yang disertai dengan penurunan proses
proliferasi sel serta peningkatan jumlah sel kanker yang mengalami
apoptosis. Hasil ini mengindikasikan bahwa delima memiliki aktivitas
antiproliferasi, antiinflamasi, antioksidan dan pro apoptosis pada sel kanker
(Pantuck et al., 2006).
Penelitian lain juga membuktikan bahwa delima dapat menghambat
angiogenesis melalui regulasi terhadap vascular e ndothelial gr owth f actor
(VEGF) pada kanker payudara, hal ini disebabkan karena produksi faktor
angiogenik tersebut diregulasi oleh NF-kB (Seeram et al., 2006).
Konsumsi oral delima dalm bentuk ekstrak dapat menghambat
penggandaan kanker paru-paru pada mencit yang diinduksi benzopirene.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Ekstrak delima mendownregulasi aktivasi MAPK, NF-kB, P13K/Akt serta
menurunkan proliferasi sel dan angiogenesis (Khan et al., 2007).
Pada penelitian secara invitro pada kanker prostat ekstrak buah delima
dapat menghambat invasi sel kanker prostat, anti proliferasi, menginduksi
apoptosis dan menghambat pertumbuhan kanker (Jurenka., 2008).
Delima (PGL) memiliki aktivitas antioksidan paling tinggi bila
dibandingkan dengan tanaman lainnya, contohnya red wine, jus blueberry, jus
jeruk dan t eh hijau (Azadzoi and Siroky, 2009). Perbedaan aktivitas tersebut
diduga disebabkan oleh komposisi kandungan senyawa polyphenol yang
berbeda.
Ekstrak buah delima (PGL) menghambat pertumbuhan sel dan
menginduksi terjadinya apoptosis pada sel PC3 karsinoma prostat pada
manusia yang sangat agresif (Bell and Hawthorne, 2008).
Penelitian invitro terhadap cell line kanker prostat telah membuktikan
bahwa ekstrak berbagai bagian tanaman delima (PGL) potensial dalam
menghambat invasi dan proliferasi sel kanker prostat, mengganggu siklus sel,
menginduksi apoptosis sel kanker dan menghambat pertumbuhan kanker.
Penelitian ini juga menemukan bahwa kombinasi ekstrak delima yang berasal
dari berbagai bagian buah lebih efektif bila dibandingkan dengan ekstrak
tunggal bagian buah (Albrecht et al., 2004; Lansky and Newman, 2005).
Whole ekstrak delima (PGL) yang dilakukan penelitian pada sel line
HaCaT, dengan dosis 0,1% dapat menstimulasi peningkatan IFN-γ
(Thongrakard, 2010). Punica granatum ekstrak ethanol yang diberikan secara
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
oral pada mencit dengan dosis 75 mg/kg/bb/hari selama 10 hari menunjukkan
hasil yang paling efektif sebagai anti mutagenic dan menghambat
perkembangan kanker (Valadares et al., 2010).
Empat kandungan kimia dalam buah delima, yaitu ellagic ac id, caffeic
acid, luteolin dan punicid ac id secara individual menunjukkan aktivitas
antikanker pada sel kanker prostat. Namun bila dikombinasikan, keempatnya
menunjukkan aktivitas berlipat ganda (Seeram et al., 2006).
Penelitian ini juga membuktikan bahwa delima dapat menghambat
angiogenesis melalui regulasi terhadap vascular e ndhothelial gr owth f actor
(VEGF) pada kanker payudara (Tio et al ., 2003). Hal ini disebabkan karena
produksi faktor angiogenik tersebut diregulasi oleh NF-kB (Seeram et al .,
2006).
Ellagic ac id salah satu komponen buah delima (PGL) masuk ke dalam
sel kanker melalui reseptor estrogen subtype ERα dan ERβ, ERα dan ERβ
termsuk reseptor inti sel, memidiasi/mengikat sebagai homodimer atau
heterodimer secara langsungke inti sel (Papoutsi et al., 2005).
Ellagic
acid
menunjukkan
sifat
antioksidan,
antiproliferatif,
kemopreventif pada berbagai jaringan dan sel kanker pada, payudara, kolon,
prostat, paru-paru, liver, leukemia. Ellagic a cid mengeluarkan efeknya
melalui aktivasi berbagai jalur khusus misalnya; apoptosis, perlindungan
terhdap kerusakn DNA, oksidtif atau oksidasi LDL, perubahan ekspresi faktor
pertumbuhn dan juga melalui ekspresi p53, NF-kB dan gen-gen responsif
famili PPAR (Papoutsi et al., 2005).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Ellagic ac id pada penelitian menggunakan cell line
MDA-MB-23
menunjukkan fungsi sebagai anti proliferatif menurunkan ekspresi BCL-xl
begitu juga dengan menggunakan cell line MCF-7 (human breast cancer)
berfungsi sebagai anti proliferatif (Kim et al., 2009).
Polyphenol dari jus delima yang difermentasi menunjukkan efek anti
kanker Terhadap sel-sel payudara manusia secara invitro. Ellagic acid salah
satu konstituen jus delima dan minyak biji dilaporkan bekerja melawan
kanker kulit, pankreas, payudara, prostat, kolon, usus, kandung kemih (Sai
Prakash and Indra Prakash, 2011).
Polyphenol merupakan salah satu komponen buah delima (PGL)
dilaporkan mempunyai kemampuan antikanker serta dapat menstimulasi IFNγ, menghambat MAPK (Suryanto, 2007). Polyphenol masuk ke dalam sel
kanker melalui reseptor laminin sebagai media pada proses apoptosis dengan
menstimulasi TRAIL. Reseptor laminin masuk ke sel kanker dan berikatan
dengan sel kanker melalui jalur fas- ligand (Burlado et al., 2010).
Penelitian yang terfokus pada interaksi aktivitas antiproliferasi caffeic
acid, 3,4-dihydrophenylacetic acid (PAA), syringe acid, protocatechuic acid
dan ferulic ac id pada T47D cell line kanker payudara manusia dengan
konsentrasi yang sama atau sedikit lebih rendah daripada yang diharapkan
dapat dikonsumsi secara normal. Hasil yang diperoleh juga mengindikasikan
bahwa phenolic acid yang dimiliki oleh delima mampu menghambat
pertumbuhan sel kanker secara invitro (Kim et al., 2002).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Luteolin merupakan flavonoid, flavonoid berkontribusi terhadap efek
protektif terhadap terjadinya kanker. Flavonoid berfungsi sebagai scavenger
radikal bebas melindungi organisme dari spesies oksigen reaktif (ROS), dari
kasinogenik. Flavonoid terbukti menunjukkan kapasitas antiinflamasi, karena
terjadiny kanker berhubungan dengan proses inflamasi (Seelinger et al .,
2008). Luteolin masuk ke dalam sel kanker melalui reseptor erostgen
(Papoutsi et al., 2005).
Punicid ac id pada buah delima (PGL) menghambat sel kanker melalui
reseptor estrogen (Hoang et al., 2010). Caffeid acid pada buah delima (PGL)
sebagai antikanker melalui reseptor estrogen (Burlando, 2010). Reseptor
estrogen termasuk superfamili reseptor inti, memediasi efek-efek estrogen
dengan mengikat sebagai homodimer atau heterodimer secara langsung ke
DNA dan menunjukkan aktivitas estrogenik / antiestrogenik, berperan
protektif terhadap kanker (estrogen ERβ), punicid acid dan caffeid acid dari
delima memodulasi Erα Sebagai antagonis dari kerja estrogen ERβ dan
merupakan ligan Erα dn ERβ (Papoutsi et al., 2005).
2.8.3.2 Aktivitas Antioksidan
Delima memiliki aktivitas antioksidan paling tinggi bila dibandingkan
dengan tanaman lainnya, contohnya red wine, jus bluberry, jus jeruk dan teh
hijau. Perbedaan aktivitas komposisi kandungan senyawa polyphenol yang
berbeda (Azadzoi and Siroky, 2009).
Seluruh bagian tanaman delima mengandung polyphenol dan memiliki
aktivitas anti oksidan. Bagian tanaman yang pling potensial digunakan
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
sebagai antioksidan adalah kulit, batang dan kulit batang. Pada buah delima,
membran buah yang mengandung banyak tannins dan anthocyanins memiliki
aktivitas anti oksidan paling tinggi. Gallic ac id, tannins dan anthocyanins
yang terkandung dalam delima dapat bertindak sebagai scavenger dan
chelating agent (Seeram et al., 2006).
Pomegranate pul p j uice (PPJ) pada manusia telah terbukti memiliki
aktivitas antioksidan lebih tinggi daripada jus apel. Dengan menggunakan
teknik atau metode ferric reducing/antioxidant power (FRAP), telah terbukti
bahwa konsumsi 250 ml PPJ setiap hari selama 4 minggu dapat memberikan
efek yang baik pada individu yang telah berumur dan meningkatkan kapasitas
antioksidan plasma dari 1,33 mmol menjadi 1,46 mmol (Gil et al., 2008).
2.8.3.3 Aktivitas Antiinflamasi
Senyawa yang terkandung dalam delima telah terbukti memiliki aktivitas
antiinflamasi dan antikanker. Aktivitas tersebut disebabkn karena pengaruh
delima terhadap NF-kB, cyclooxygenase (COX) dan lipoxygense (LOX) yang
terlibat dalam proses tersebut. Nuclear f actor k appa B (NF-kB) merupakan
faktor transkripsi yang akan teraktivasi sebagai respons terhadap karsinogen.
Delima telah terbukti memiliki aktivitas menghambat aktivasi NF-kB yang
terlibat dalam proses perkembangan berbagai jenis kanker. Delima juga
menghambat aktivitas COX-2, yaitu enzim yang terinduksi oleh aktivitas
agen mitogenik atau inflamatorik (Seeram et al., 2006).
Minyak biji delima terbukti menghambat cyclooxygense dan enzim
lypoxygenase secara invitro. Cyclooxygense, enzim utama dalam konversi
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
asam atachidonic menjadi leukotrine mediator inflamasi. Studi secara invitro
delima (PFE) memiliki efek inhibitor signifikan terhadap MMPs pada
penderita osteorthritis (Jurenka, 2008).
Berdasarkan uraian di atas diharapkan bahwa ekstrak buah delima dapat
dimanfaatkan sebagai agen antikanker pada karsinoma sel skuamosa rongga
mulut (KSSRM), hal ini di landasi bahwa ekstrak buah delima mempunyai
aktivitas antikanker pada kanker lain dan juga mempunyai komponen bahan
aktif lebih banyak sebagai antikanker dibanding ekstrak buah mahkota dewa,
yang hanya ada pada polyphenol saja. Disisi lain, ekstrak buah delima telah
terbukti memiliki aktivitas antioksidan, antiinflamasi, antiangiogenesis.
2.9 Phaleria Macrocarpa (Mahkota Dewa)
Adalah salah satu tanaman obat tradisional Indonesia, sebagai obat anti
kanker yang sudah di jual di pasar. Obat anti kanker ekstrak biji mahkota
dewa di jual oleh PT Mahkota Dewa Jakarta, dalam penelitian ini dipakai
sebagai kontrol. Kandungan zat aktif biji mahkota dewa antara ; alkaloid,
terpenoid, saponin, polyphenol. Polyphenol dapat menghambat pertumbuhan
kanker pada leukemia L1210 dan menginduksi apoptosis. Polyphenol juga
dapat menstimulasi produksi IFN-γ, yang penting dalam memacu aktivitas
CTL dan sel NK, mempunyai potensi sitostattika dan imunostimulator,
dilaporkan juga dapat menghambat aktivasi NF-k B (Suryanto, 2007).
Mahkota Dewa termasuk dalam famili Thymelaeaceae, memiliki aktifitas
antimikroba, hal ini berkaitan dengan toksisitas tanaman yang cukup tinggi
dan harus hati-hati dalam penggunaan dosis. Senyawa polyphenol mempunyai
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
efek memblok reseptor growth factor, menginhibisi MAPK (Mitogen
Activated Protein Kinase), mahkota dewa cukup bermakna untuk
meningkatkan indeks apoptosis peningkatan dosis diikuti kenaikan indeks
apoptosis karena kandungan polyphenol yang tinggi (Suryanto, 2007).
Ekstrak biji mahkota dewa menunjukkan efek antiproliferasi terhadap sel
kanker HM3KO dengan Ica 19.95 kurang lebih 3,57 ug/ml. sehingga dapat
dijadikan sebagai agen kemopreventif terhadap kanker (Kintoko et al., 2007).
Ekstrak biji mahkota dewa dosis 250 ug/ml dan 500ug/ml dapat
menaikkan ekspresi protein p53 secara bermakna dibanding dengan
kelompok kontrol (Wahyuningsih, 2006). Penelitian efek ekstrak etanol biji
mahkota dewa pada cell line ca kolon bersifat sitotoksi melalui peningkatan
caspase-3, peningkatan dosis menyebabkan peningkatan ekspresi caspase-3
aktif (Widyasari et al., 2011).
2.10 Imunohistokimia
Imunohistokimia
adalah
suatu
pemeriksaan
imunologik
dengan
menggunakan antibodi sebagai probe yang sifatnya spesifik bertujuan untuk
mendeteksi suatu antigen dan letaknya didalam jaringan biopsi (Rantam,
2003). Imunohistokima dapat digunakan untuk mendeteksi antigen pada sel
yang terfiksasi dengan menggunakan monoklonal antibodi apabila tidak
terdenaturasi walaupun dalam konsentrasi rendah, antigen tetap dapat
berikatan dengan antibodi. Prinsip metode ini adalah perpaduan antara reaksi
imunologi dan kimiawi yaitu reaksi antigen-antibodi dan reaksi antara enzym
dan substrat. Antibodi yang digunakan adalah spesifik untuk antigen tersebut
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
dan dilabel dengan enzim. Enzim yang dapat digunakan untuk melabel adalah
peroksidase (tehnik peroksidase-anti pe roksidase / PAP), alkali fosfatase
(tehnik alkali fosfatase-anti alkali fosfatase /APAAP) dan β-galaktosidase.
Reaksi enzimatik ditandai dengam indikator warna atau kromogen, yaitu
naftol yang berwarna biru dan DAB (3,3 diaminobenzidine) yang berwarna
kecoklatan (Rantam, 2003; Sudiana 2005).
Prinsip
dasar
pemeriksaan
imunohistokimia
sama
dengan
imunofluoresensi berdasarkan ikatan antigen antibodi yang dapat dideteksi
apabila antibodi yang mengikat telah diberi label. Pada imunohistokimia
labelisasi menggunakan aktifitas enzim, yang akan menghasilkan warna
setelah diberi tambahan kromogen. Warna akan tampak pada daerah
kompleks enzim antibodi di dalam jaringan yang terlihat dengan pemeriksaan
mikroskop cahaya. Pemeriksaan imunohistokimia dapat dilakukan dengan
berbagai tehnik pewarnaan antara lain metode peroksidase anti p eroksidase,
avidin bi otin, kompleks dan streptavidin biotin. Metode peroksidase ant i
peroksidase (PAP) merupakan varian dari metode uji imunoperoksidase
dimana prinsip kerjanya sama dengan pemeriksaan imunofluoresen. Hanya
pada uji imunohistokimia pemberian antibodi berlabel enzim tidak secara
langsung dimana antibodi yang terikat terdeteksi melalui labeled antiglobulin.
Teknik imunoperoksidase lebih menguntungkan dibanding imunofluoresen
karena pembacaan menggunakan mikroskop medan gelap. Sedian tercat
sedemikian rupa sehingga hubungan struktur jaringan atau sel lebih mudah
diamati Keuntungan lain sediaan yang sudah jadi dapat disimpan secara
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
permanen dan dapat diadaptasikan untuk pemeriksaan mikroskop elektron
(Wasito, 2001).
Prosedur pemeriksaan avidin-biotin didasarkan ikatan avinitas avidin
biotin. Biotin dapat dilekatkan secara kimia dengan antibodi primer
menghasilkan senyawa blotnilated yang ditambahkan pada irisan jaringan
akan menunjukkan tempat antigen pada jaringan. Uji avidin-biotin
mempunyai reaktan dengan afinitas yang lebih tinggi dan memberikan
peningkatan sensitivitas yang cukup tinggi dibandingkan PAP. Metode
streptavidin biotin banyak digunakan dalam bidang imunologi, karena
berbagai kelebihan antara lain biotin yang mudah berikatan dengan berbagai
protein dan ikatan yang amat kuat antara streptavidin dengan biotin.
Keuntungan lain adalah dapat mengeliminasi ikatan lain yang non spesifik,
sehingga tidak terjadi berbagai reaksi non spesifik yang sering terjadi pada
ikatan dengan avidin. Oleh karena itu streptavidin biotin dianggap lebih
bagus bila dibandingkan dengan avidin biotin kompleks, karena streptavidin
mempunyai kemampuan mengikat biotin lebih banyak dan sangat kuat,
sehingga hasil pewarnaan menjadi lebih jelas. Streptavidin bi otin juga
menguntungkan dibanding PAP, karena menggunakan reagen pelabel yaitu
conjugated s treptavidin enzyme sebagai ganti PAP kompleks yang berbeda
untuk setiap sistem organ (Wasito, 2001).
Pemeriksaan metode imunohistokimia dibagi 2 macam yaitu, metode
langsung apabila antibodi monoklonal yang digunakan untuk mendeteksi
suatu marker pada sel langsung dilabel dengan enzym dan metode tak
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
langsung bila antibodi monoklonal tidak dilabel dengan enzim, tetapi dengan
antibodi sekunder yang dilabel enzim atau menggunakan bahan perantara
seperti biotin-streptavidin atau biotin-avidin (Rantam, 2003; Sudiana, 2005).
2.11 Tunnel Assay
Tunnel assay adalah salah satu metode pemeriksaan sel apoptosis yang
spesifik di mana teknik ini mampu mendeteksi putusnya rantai tunggal dan
rantai ganda DNA yang berhubungan dengan apoptosis. Rantai DNA yang
putus dideteksi secara enzimatis melalui labelling terhadap gugus 3-OH,
fragmen DNA dilabel dengan digoxigenin-nucleotide yang kemudian diikat
oleh anti-digoxigenin antibody. Ikatan konjugat pe roxidase antibody secara
enzimatik akan membentuk warna dari substrat kromogenik yang permanent,
jelas dan terlokalisir sehingga menjadi deteksi apoptosis yang sensitive pada
sel. Sehingga dapat dibedakan antara sel nekrosis dengan apoptosis melalui
deteksi pemutusan rantai DNA dan kondensasi kromatin yang berhubungan
dengan apoptosis. Pada nekrosis juga terjadi putusnya rantai DNA dan tidak
menutup kemungkinan terbentuknya gugus 3-OH, tetapi gugus ini tidak
terbentuk sebanyak pada sel apoptosis, sehingga andaikata cacat sekalipun
akan membentuk warna yang sangat terang atau sangat muda, sehingga untuk
membedakan adalah dengan terdapatnya pewarnaan fokal in situ di dalam
apoptotic nuclei dan apoptotic bodies, demikian pula dengan sel yang sedang
membelah juga tidak menghasilkan gugus 3-OH dalam jumlah besar sehingga
tidak tercat. Reagen ini dapat menyambung ujung 3-OH secara in situ dengan
nukleotida yang dilabel dan tidak dilabel secara kimia. Nukleotida yang
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
terkandung dalam reaction buffer disambung dengan ujung 3-OH dari DNA
secara enzimatis dengan bantuan enzim TDT (Terminal de oxynucleotidyl
transferase) yang berfungsi sebagai katalisator reaksi penyambungan trifosfat
nukleotida ke ujung 3-OH. Pelabelan nukleotida dengan digoxigenin secara
acak bertujuan untuk memicu ikatan antibody anti digoxigenin dengan
digoxigenin. Fragmen DNA yang telah disambung dengan nukleotida yang
dilabel digoxigenin diikat anti digoxigenin p eroksidase c onjugate sehingga
dengan penambahan substrat kromogenin pada sel yang mengandung ujung
3-OH akan berwarna hijau flouresens dengan penambahan mikroskop
fluoresens (Spector et al., 1998).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
BAB 3
KERANGKA KONSEPTUAL
3.1 Kerangka Konsep
Delima
(PGL)
R. Estrogen
R. Laminin
Wild p53 ↑
Fas-ligand
PLC
p21 ↑
PI2P
Bax ↑
FADD
PI3P
Bcl-2
CDK
Cytocrom-C
Kaskadekaspase ↑
Ca2+
Apaf-1 ↑
DNA-se ↑
Phospholipase A2
KaskadeKaspase ↑
ER
Siklus sel
berhenti
Phosphootydil Colin
Lisophosphotydil C
DNA-se ↑
Asam
Arakidonat
Apoptosis
Cox-2
Prostaglandin
Angiopoitin
VEGF
Angiogenesis↓
yang diteliti
tidak diteliti
menghambat
Gambar 3.1 Kerangka Konsep.
60
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
3.2 Penjelasan Kerangka Konsep
Transformasi
sel pada hewan percobaan dapat diperoleh dengan
melakukan paparan benzopirene 0,04 mg/0,04 ml olium ol ivarum pada
mukosa bukal rongga mulut mencit sebelah kanan 3 kali seminggu selama 4
minggu. Benzopirene menghasilkan metabolit reaktif BP-7,8-dihydrodiol 9,10-epoxide yang akan berikatan secara kovalen dengan DNA pada sel dari
mencit sehingga terjadi mutasi. Gen yang mengalami mutasi mempunyai
kemampuan proliferasi dan diferensiasi yang sangat tinggi.
Gen yang mengalami mutasi khususnya gen-gen yang mengkode protein
yang berperan pada pengaturan siklus pembelahan sel (kelompok
protooncogene dan kelompok tumor supressor gene).
Kelompok protooncogene, gen Bcl-2 mengkode protein yang berperan
sebagai anti apoptosis, dimana protein bekerja untuk menekan fungsi protein
Bax pada membram mitokondria. Jika terjadi mutasi pada Bcl-2, maka Bcl-2
akan overaktif sehingga protein Bax tidak berfungsi. Adanya aktivasi dari
Bcl-2 maka apoptosis tidak akan terjadi.
Kelompok tumor s uppressor ge ne suatu protein yang berperan sebagai
faktor pengendalian pertumbuhan sel, termasuk kelompok dari protein ini
antara lain protein 53 (p53) yang dikode oleh gen p53 (P53). Wild p53 dapat
bekerja di dalam inti sel, khususnya pada proses pengendalian siklus
pembelahan sel, sebagai faktor traskripsi terhadap pembentukan p21 yang
akan menghambat semua CDK dan mempunyai peran dalam pengaturan
kematian sel (apotosis).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Ekstrak buah delima (PGL) terstandar masuk ke dalam sel yang
mengalami transformasi ke karsinoma sel skuamosa melalui reseptor estrogen
mengaktifkan wild p53, wild p53 memicu faktor transkripsi terhadap p21, p21
yang disentesis akan menekan semua CDK dan
siklus pembelahan sel
berhenti. Saat siklus sel berhenti, wild p53 akan memicu Bax, protein Bax
(pro apoptosis) akan menekan Bcl-2 (antiapoptosis) pada membran
mitokondria, sehingga terjadi perubahan permeabilitas membran dari
mitokondria. Perubahan ini mengakibatkan terjadi pelepasan cytochrome-c ke
sitosol. Di sitosol cytochrome-c akan mengaktivasi Apaf -1 yang selanjutnya
akan mengaktivasi kaskade-kaspase. Kaspase yang aktif akan mengaktifkan
DNA-se, kemudian DNA-se yang aktif menembus membran inti dan merusak
/ frragmentasi DNA yang mengalami mutasi / cacat dan akhirnya sel dengan
DNA yang mengalami mutasi akan mengalami kematian (apoptosis). Ekstrak
buah delima (PGL) terstandar akan masuk ke dalam sel yang mengalami
transformasi ke karsinoma sel skuamosa rongga mulut mencit melalui
reseptor laminin, terjadi ikatan fas-ligand antara sel yang mengalami
transformasi dengan ekstrak buah delima (PGL) terstandar. Adanya ikatan
fas-ligand menimbulkan sinyal transduksi ke dalam sitosol pada sel yang
mengalami transformasi, sehingga di dalam sitosol terjadi aktivasi suatu
protein yang disebut Fas-Associated Protein Death Domain (FADD). FADD
kemudian mengaktivasi kaskade-kaspase, kaskade-kaspase yang aktif,
mengaktifkan DNA-se. DNA-se masuk kedalam inti sel yang mengalami
transformasi dan merusak DNA sehingga sel mengalami apoptosis.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Aktivitas lain dari ekstrak buah delima (PGL) terstandar masuk ke dalam
sel yang mengalami transformasi ke karsinoma sel skuamosa melalui reseptor
estrogen
akan memicu aktivasi phaspholipase C
(PLC) mengubah
phosphotydil i nositol d iphosphat (PI2P) menjadi phasphotydil i nositol
triphosphat (PI3P). Adanya ikatan phasphotydil i nositol triphosphat (PI3P)
dengan reseptor di membram endoplasmic r eticulum menyebabkan pintu
calcium di membram endoplasmic reticulum terbuka, sehingga Ca 2+ dilepas
ke sitosol mengaktifkan phaspholipase A2, phaspholipase A2 memecah
phasphotydil c olin menjadi lisophasphotydil c olin dan asam ar akidonat.
Asam ar akadinot melalui jalur siklooksigenase / COX-2 mengeluarkan
prostaglandin yang akan memicu angiopoitin mengeluarkan VEGF, VEGF
merupakan faktor yang memicu pembentukan angiogenesis dan bertindak
sebagai faktor pertumbuhan autocrine bagi sel kanker. Ektrak buah delima
(PGL) terstandar dapat menghambat VEGF sehingga angiogenesis tidak
terbentuk, tanpa angiogenesis yang merupakan fenomena kompleks dan
mutlak diperlukan untuk pertumbuhan dan survival sel kanker. Sel kanker
tidak akan bisa berkembang dan akan mengalami kematian.
Kajian ini sangat penting mengingat banyak penyakit kronis yang
menimbulkan kerugian bagi manusia, salah satu di antaranya adalah adalah
kanker (Celik et al., 2009).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
3.3 Hipotesis Penelitian
Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah :
3.3.1 Ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat menurunkan ekspresi Bcl-2
pada rongga mulut mencit Strain S wiss W ebster (Balb/c) yang mengalami
transformasi.
3.3.2 Ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat menurunkan ekspresi VEGF
pada rongga mulut mencit Strain S wiss W ebster (Balb/c) yang mengalami
transformasi.
3.3.3 Ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat meningkatkan ekspresi wild
p53 pada rongga mulut mencit Strain Sw iss W ebster
(Balb/c) yang
mengalami transformasi.
3.3.4 Ekstrak buah delima(PGL) terstandar dapat meningkatkan apoptosis pada
rongga mulut mencit Strain Sw iss W ebster (Balb/c) yang mengalami
transformasi .
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1 Jenis dan Rancangan penelitian
Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian true eksperimental
laboratorium. Rancangan penelitian menggunakan rancangan acak lengkap.
Sampel maupun perlakuan diusahakan dalam keadaan terkendali dan terukur
sehingga pengaruh perlakuan lebih dipercaya. Pengelompokan subjek
penelitian dapat dilihat pada gambar 4.1
K0
S
OO
CMC
OK0
CMC/K1
OK1
EA/P1
OP1
PGL/P2
OP2
MD/P3
OP3
RA
Benzopirene
1 Minggu
RA
4 Minggu
4Minggu
Akhir
Minggu ke 9
Gambar 4.1 Rancangan Penelitian
Keterangan :
S
: Subyek penelitian
PGL
: Punica granatum Linn (delima)
E.A
: Ellagic acid
M.D
: Mahkota Dewa
R
: Random
65
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
K0
: Kelompok kontrol. Mencit 6 ekor yang tidak dipapar benzopirene
dan tidak diberi ekstrak buah delima. Dipapar olium olivarum (OO)
0,04 ml pada mukosa bukal di rongga mulut sebelah bukal kanan
3 kali seminggu selama 4 minggu. Kemudian diberi CMC-Na 0,3%
per oral satu kali setiap hari selama 4 minggu. Pada akhir minggu
ke 9 dibiopsi jaringan mukosa rongga mulut mencit kemudian
dikorbankan.
K1
: Kelompok perlakuan. Mencit 6 ekor dipapar benzopirene 0,04 mg
/0,04 ml olium ol ivarum pada mukosa bukal di rongga mulut
sebelah kanan 3 kali seminggu selama 4 minggu. Kemudian diberi
CMC-Na 0,3% per oral satu kali setiap hari selama 4 minggu Pada
akhir minggu ke 9 dibiopsi jaringan mukosa rongga mulut mencit
kemudian dikorbankan.
P1
: Kelompok perlakuan. Mencit 6 ekor dipapar benzopirene 0,04 mg
/0,04 ml olium olivarum pada mukosa bukal rongga mulut sebelah
kanan 3 kali seminggu selama 4 minggu. Kemudian diberi ellagic
acid per oral. Dengan dosis 75 mg/kg/bb/hari dilarutkan dalam
CMC-Na 0,3 % satu kali setiap hari selama 4 minggu. Pada akhir
minggu ke 9 dibiopsi jaringan mukosa rongga mulut mencit
kemudian dikorbankan.
P2
: Kelompok perlakuan. Mencit 6 ekor dipapar benzopirene 0,04 mg
/0,04 ml olium ol ivarum pada mukosa bukal di rongga mulut
sebelah kanan setiap 3 kali seminggu selama 4 minggu. Kemudian
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
diberi ekstrak buah delima (PGL) per oral. Dengan dosis 75 mg/kg/
bb/hari dilarutkan dalam CMC-Na 0,3% satu kali setiap hari selama
4 minggu. Pada akhir minggu ke 9 dibiopsi jaringan mukosa
rongga mulut mencit kemudian dikorbankan.
: Kelompok perlakuan. Mencit 6 ekor paparan benzopirine 0,04 mg
P3
/0,04 ml olium ol ivarum pada mukosa bukal dirongga mulut
sebelah kanan bawah setiap 3 kali seminggu selama 4 minggu.
Kemudian diberi ekstrak buah mahkota dewa per oral dengan dosis,
75 mg/kg/bb/hari dilarutkan dalam CMC-Na 0,3 % satu kali setiap
hari selama 4 minggu. Pada akhir minggu ke 9 dibiopsi jaringan
mukosa rongga mulut mencit kemudian dikorbankan.
O0
: Observasi pada kelompok K0
OK1
: Observasi pada kelompok K1
OP1
: Observasi pada kelompok P1
OP2
: Observasi pada kelompok P2
OP3
: Observasi pada kelompok P3
4.2 Unit Eksperimental, Replikasi dan Randomisasi
4.2.1 Unit Eksperimental
Unit Eksperimental adalah sel epitel skuamosa mencit mukosa bukal
sebelah kanan bawah di rongga mulut mencit (Strain Swiss Webster (Balb/c)
jantan, secara fisik dipilih yang sehat, umur 5 bulan, berat badan berkisar 3050 gram. Sampel diperoleh dari unit hewan percobaan Universitas
Gajahmada, Yogyakarta dengan pertimbangan mencit adalah hewan coba
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
yang cocok untuk model karsinoma sel skuamosa rongga mulut (KSSRM)
(Arumdina, 2008).
4.2.2 Replikasi
Jumlah ulangan atau replikasi ditentukan dengan menggunakan rumus
sebagai berikut :
Keterangan
r
:
: jumlah replikasi
Zα : 1,96 ( Bila α = 0,05 )
Zβ : 0,842 (Bila β = 0,20 )
σ
: Simpangan baku kelompok kontrol (2,582)
d
: Selisih nilai rerata kelompok yang mengalami apoptosis antara
kelompok kontrol dan perlakuan (8,00-1,20) (Arundina, 2008).
f
: Jumlah hewan percobaan yang droup out (failed) sebesar 20 %.
Penghitungan jumlah replikasi (r) :
.
Berdasarkan hasil penghitungan, jumlah replikasi atau ulangan minimal,
bila diperhitungkan dengan faktor koreksi, maka jumlah replikasi untuk
masing-masing kelompok perlakuan adalah 6 ekor mencit. Bila terdapat 3
kelompok perlakuan dan 2 kelompok kontrol, maka dibutuhkan besar sampel
6 x 5 = 30 ekor mencit (Mus musculus) Strain Swiss Webster (Balb/c).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
4.2.3 Randomisasi
Penelitian ini direncanakan menggunakan 30 ekor mencit jantan,
berumur 5 bulan yang telah disapih dari induknya. Mencit diadaptasikan
terlebih dahulu selama 1 minggu sebelum diberi perlakuan. Dalam masa
adaptasi, seluruh mencit mendapatkan pakan dasar dan pemeliharaan standar
hingga umur dan berat badan memenuhi syarat untuk digunakan dalam
penelitian ini. Dari seluruh mencit yang digunakan, 12 ekor digunakan
sebagai kelompok kontrol, dan 18 ekor mencit yang tersisa disiapkan untuk
perlakuan. Selanjutnya 30 ekor mencit tersebut diambil dengan teknik simple
random s ampling dan dibagi menjadi 5 kelompok yaitu kelompok K0, K1,
P1, P2, P3 seperti yang terlihat pada rancangan penelitian di atas.
4.3 Variabel Penelitian dan Definisi Operasional Variabel
4.3.1 Variabel Penelitian
Variabel bebas :
a.
Ekstrak buah delima (PGL) terstandar
Variabel penghubung
a.
Ekspresi wild p53
b.
Ekspresi Bcl-2
c.
Ekspresi VEGF
Variabel tergantung
a. Sel yang mengalami apoptosis
Variabel kendali
a.
Disertasi
Waktu penyuntikan
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
b.
Tatalaksana pemeliharaan
c.
Pakan dan minum hewan coba
d.
Dosis dan cara pemberian ekstrak buah delima
4.3.2 Definisi Variabel Penelitian
a.
Mencit adalah mencit (Mus m usculus) Strain Sw iss W ebster (Balb/c)
jantan, secara fisik sehat, umur 5 bulan, berat badan berkisar 30-50 gram.
Sampel diperoleh dari unit hewan percobaan Universitas Gajah Mada
Yogyakarta.
b.
Hewan model karsinoma sel skuamosa rongga mulut (KSSRM) adalah
mencit (Mus m usculus) Strain Sw iss Webster (Balb/c) yang telah
mengalami transformasi ke (KSSRM) pada sel epitel skuamosa pada
mukosa ronngga mulut, akibat paparan (penyuntikan) benzopirene.
c.
Standarisasi 40% ellagic ac id dengan tujuan 40% ellagic a cid
mempresentasikan kekuatan delima yang bertanggung jawab terhadap
aktivitas farmakologi delima (Saifudin et al., 2011).
d.
Estrak buah delima adalah hasil ekstraksi seluruh bagian buah delima
(punica gr anatum L ) dalam bentuk serbuk dan telah terstandarisasi
mengandung 40% ellagic ac id yang diproduksi oleh Xi”an Biof B ioTechnology Co,Ltd ( Room 1-1111,High-tech Venture Park,No .69 J inye
Road Gaoxin Distric of Xi’ an, People Republic of China) (Certificate of
analysis terlampir ) (Lampiran 1 dan 2).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
e.
Ellagic acid adalah kristal ellagic acid merupakan salah satu komponen
bahan aktif ekstrak buah delima (PGL) yang memiliki aktivitas terapetik
untuk berbagai penyakit.
f.
Ekstrak mahkota dewa (Phaleria m acrocarpa) adalah hasil ekstraksi
seluruh bagian buah mahkota dewa ,dalam bentuk serbuk .
g.
Dosis adalah jumlah ekstrak buah delima, ellagic ac id, mahkota dewa
yang diberikan kepada subjek penelitian, sebesar 75 mg/kg bb/po/hari
(Valadares et al., 2010).
h.
Lama dan waktu pemberian ekstra delima adalah lamanya waktu
pemberian ekstrak buah delima,ellagic ac id,mahkota dewa pada mencit
(Mus m usculus) Strain Sw iss Webster (Balb/c) sebagai hewan model
(KSSRM), yaitu selama 4 minggu,diberikan setiap hari (Valadares et al.,
2010).
i.
Dosis benzopirene adalah jumlah benzopirene dalam pelarut oleum
olivarium yang dipapar/disuntikkan pada rongga mulut mencit, lokasi
mukosa bukal sebelah kanan bawah yaitu 0,04 mg/0,04ml setiap 3 kali
seminggu selama 4 minggu (berdasarkan penelitian pendahuluan).
j.
Ekspresi wild p53 adalah pengukuran ekspresi wild p53 dengan cara
menghitung jumlah sel yang mengalami transformasi yang menghasilkan
wild p53
dengan teknik imunohistokimia menggunakan antibodi
poliklonal anti wild p5 3. Penghitungan dilakukan terhadap sel yang
imunoreaktif tercat coklat pada membran sel atau sitoplasma pada
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
sepuluh lapang pandang yang berbeda dengan menggunakan mikroskop
cahaya pembesaran 400x.
k.
Ekspresi Bcl-2 adalah pengukuran ekspresi Bcl-2 dengan cara
menghitung jumlah sel yang mengalami transformasi yang menghasilkan
Bcl-2, pemeriksaan
dengan teknik imunohistokimia menggunakan
antibodi poliklonal anti Bcl-2. Penghitungan dilakukan terhadap sel yang
imunoreaktif tercat coklat pada membran sel atau sitoplasma pada
sepuluh lapang pandang yang berbeda dengan menggunakan mikroskop
cahaya pembesaran 400x.
l.
Ekspresi VEGF adalah pengukuran ekspresi VEGF dengan cara
menghitung jumlah sel yang mengalami transformasi yang menghasilkan
VEGF dengan teknik imunohistokimia menggunakan antibodi poliklonal
anti VEGF. Penghitungan dilakukan terhadap sel yang imunoreaktif
tercat coklat pada membran sel atau sitoplasma pada sepuluh lapang
pandang
yang berbeda dengan menggunakan mikroskop cahaya
pembesaran 400x.
m. Jumlah apoptosis adalah pengukuran ekspresi apoptosis dengan cara
menghitung jumlah sel yang mengalami transformasi yang menghasilkan
apoptosis pada pemeriksaan dengan teknik tunnel as say. Penghitungan
dilakukan terhadap sel yang imunoreaktif tercat coklat pada membran sel
atau sitoplasma pada sepuluh lapang pandang
yang berbeda dengan
menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400x.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
4.4 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit (Mus
musculus) strain Sw iss Webster (Balb/c) jantan, sehat berumur 5 bulan
dengan berat badan berkisar 30-50 gram, pakan mencit pellet per G
diproduksi oleh PT. Comfeed Indonesia,air minum mencit, ekstrak buah
delima (PGL) terstandar ,ellagic ac id, mahkota dewa, benzopiren, (Sigma),
aqua, CMC-NA 0,3%, oleum olivarum, alkohol 100%, alkohol 90%, alkohol
70 %, hematoksilin eosin,(HE),aseton, xylol, etanol, PBS, tripsin, alkohol.
aquadestilata, streptavidin-biotin, H2O2 0,5%, substrat, phosphotase buffer,
antibodi pol iklonal (sigma) untuk wild p53, Bcl-2, VEGF (Bioworld
Technology, USA, Cat No. BSI530), Envision Detection Kit Sy stem
Peroxidase
(DAKO REAL, K5007), antibody di luent (DAKO, S 0809),
meyer he matoksilin, aseton, streptavidin biotin peroksidase, substrat,
apoptag detection Kit (Milipore corporation, Catalog no S1707), ether.
4.5 Alat penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah; kandang mencit terbuat
dari plastik ditutup kawat kasa dan dilengkapi tempat makan dan botol
minum, sonde mencit, seperangkat alat bedah, meja operasi, mortir
,timbangan analitik, mikroskop, kaca obyek, kaca penutup, botol kecil tempat
jaringan, kertas lebel, alat tulis, disposible s yringe,, counter, mikropipet,
microwell plat, alat sentrifugasi, mikroplate, alat inkubasi, tissue paper,
inverted mikroskop, sarung tangan.masker, gelas obyjek
Disertasi
biasa dan yang
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
berlapis poly-L-Lysine, cover gl ass, mikropipet, mikrometer, mikroskop
cahaya merk Olympus CX31.
4.6 Lokasi Penelitian
Penelitian dilakukan di beberapa laboratorium yang berbeda. Pembuatan
hewan model, pemeliharaannya (Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran
Universitas Airlangga, pembuatan preparat, pemeriksaan imunohistokimia
dan tunnel assay dilakukan di Unit Mikroskop Elektron dan Laboratorium
Terpadu, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga, Surabaya.
4.7 Pelaksanaan Penelitian
4.7.1 Persiapan Penelitian
a.
Ekstrak buah delima terstandar mengandung 40% ellagic acid
Ekstrak buah delima terstandar yang mengandung 40% ellagic acid
dan ellagic acid 90% diproduksi oleh Xi, an Biof Bio-Technology Co,Ltd
(Room 1-111, High- tech V enture Park, No. 69 Jinye R oad, Gaoxin
Distric of Xian, People Republic of China (Lampiran 1 dan 2 ).
b. Persiapan sedian
Ekstrak buah delima terstandart yang akan diberikan pada hewan
percobaan disuspensikan dengan sodium c arboxy m ethyl c ellulose
(CMC) 0,3 % (Palanisamy et al ., 2007) di dalam mortar agar
homogenitas larutan dapat dijaga. Sediaan juga selalu dibuat baru
sebelum diberikan. Pembuatan sodium CMC 0,3% dilakukan dengan
cara menaburkan sodium CMC sebanyak 0,3% gram dalam aquadest
panas 100 ml dan diaduk dengan bantuan magnet stirrer sampai larut.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Berdasarkan dosis ellagic acid sebesar 75 mg/kgbb/po/hari (Valadares
et al ., 2010), maka dosis ekstrak buah delima terstandar yang
mengandung 40% ellagic acid (EA) adalah :
40 gram EA / 100 gram ektrak buah delima
400 mg EA/1000 mg ektrak buah delima
Bila dosis EA = 75 mg/kgbb/po/hari, maka ekstrak buah delima
yang diperlukan adalah : 75/100 x 1000 mg extrak buah delima = 187,5
mg ekstrak buah delima/kgbb/po/hari.
Dengan cara penghitungan yang sama, maka dosis EA untuk
sediaan yang mengandung 90,51% EA adalah :
90,51 gram EA / 100 gram ekstrak buah delima
905,1 mg EA / 1000 mg ekstrak buah delima
Bila dosis EA = 75 mg/kgbb/po/hari, maka EA yang diperlukan
adalah : 75 / 905,1 mg x 1000 = 82,86 mg ekstrak buah
delima/kgbb/po/hari.
Contoh :
Untuk berat badan mencit = 30 gram, ekstrak buah delima yang
diperlukan :
bb
= 30 gram → (EA = 90%), penghitungannya :
30/1000 x 82,86 = 2,5 mg/po/hari.
bb
= 30 gram → (EA = 40%), penghitungannya :
30/1000 x 187,5 = 5,625 mg/po/hari.
Volume pemberian = berat badan mencit / 1000 x dosis ekstrak.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
→
Misalnya untuk bb mencit 30 gram
(EA = 90%) = 2,5 mg
ekstrak buah delima disuspensikan dalam sodium CMC 1cc / 1 ml.
c.
Pembuatan hewan model
Pada penelitian ini digunakan 30 mencit (Mus m usculus) Strain
Swiss Webster ( Balb/c) jantan, secara fisik dipilih yang sehat, umur 5
bulan, berat badan berkisar 30-50 gram. Mencit diambil secara random.
Setiap 6 ekor Mencit ditempatkan dalam kotak yang berbeda, diberi
tanda dengan cat di ekor dan ditentukan macam perlakuan yang
diterapkan. Sebanyak 24 ekor mencit disiapkan sebagai hewan model
karsinoma sel skuamosa rongga mulut (Arundina, 2008). Setelah mencit
diadaptasikan. mencit dipapar dengan 0,04 mg benzopirene / 0,04 ml
olium olivarum (benzopirene 10 mg dilarutkan dalam olium olivarum 10
ml) pada rongga mulut mukosa bukal sebelah kanan. 0,04 mg
benzopirene/0,04 ml olium olivarum, dosis hasil penelitian pendahuluan.
d. Pengambilan dengan biopsi karsinoma sel skuamosa rongga mulut
Pengambilan sel yang mengalami transformasi ke karsinoma sel
skuamosa rongga mulut
mencit dianestesi dengan ether, kemudian
dikorbankan. Sebagai bahan pemeriksaan ekspresi wild p53, B cl-2,
VEGF dan penghitungan jumlah sel yang mengalami apoptosis.
4.8 Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data
Data yang dimasukkan sebagai hasil penelitian dikumpulkan dalam
bentuk data primer. Untuk menjamin reliabilitas dan validitasnya, penelitian
dilakukan di laboratorium yang standar dan mempunyai :
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
a.
Peralatan lengkap dan pengalaman yang memadai dalam pembuatan
hewan model dan tatalaksana pemeliharaan hewan coba.
b.
Peralatan dan pengalaman memadai dalam pemeriksaan dengan teknik
imunohistokimia dan tunnel assay di Reliabilitas dan validitas penelitian
akan dicapai melalui langkah-langkah berikut :
1. Menjamin reliabilitas pada evaluasi obyek pengamatan yang sama
maka peneliti menggunakan tenaga peneliti atau tenaga laboratorium
yang sama.
2. Menjamin validitas pada penilaian variabel maka penelitian dipilih
alat dan bahan uji yang mempunyai sensitivitas dan spesifitas yang
tinggi, konsisten dan dapat dipertanggungjawabkan.
3. Peneliti konsultasi pada tim promotor dan tenaga ahli atau konsultan
dan mengelola, mengawasi, memantau sendiri berbagai tahap
pelaksanaan penelitian. Hal tersebut meliputi pengadaan hewan coba,
penilaian gejala, pengambilan spesimen, pengadaan bahan, pemakaian
dan pemeliharaan bahan dan alat, pemeriksaan dan pengumpulan data
penelitian.
4. Penelitian
baru
dilakukan
apabila
proposal
penelitian
telah
mendapatkan kelayakan etik dari komisi etik penelitian.
4.9 Cara Pengolahan dan Analisis Data
Pengumpulan data dilakukan dalam lingkungan yang terkontrol dan
terkendali dengan asumsi semua kondisi diusahakan sama dan dapat
dikendalikan. Urutan analisis data :
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
a.
Uji Normalitas : untuk menguji variabel yang diperiksa dalam penelitian
berdistribusi normal.
b.
Uji Homogenitas : Untuk meyakinkan bahwa data antar kelompok
memiliki matriks kovarians yang homogen. Uji statistik yang digunakan
adalah Box’s test .
c.
Uji Multivariat Analisis Varians (MANOVA) : Bila data berdistribusi
normal, dilakukan uji means antar kelompok dengan menggunakan
MANOVA.
d.
Uji Komparasi Ganda atau Least Significans Difference (LSD) :
digunakan untuk membandingkan pengaruh perlakuan antar kelompok
perlakuan
terhadap
masing-masing
variabel
dependent.
Tingkat
kemaknaan uji statistik yang dipergunakan dalam penelitian ini sebesar
0,05.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
4.10 Kerangka Operasional Penelitian
Mencit
(Balb/c)
Adaptasi
(1 minggu)
Paparan Benzopirene
(Mukosa bukal kanan RM mencit)
(4 minggu, 3 x per minggu)
4 minggu setelah paparan
Benzopirene (KSSRM)
K0
K1
Delima
Ellagic Acid
Mahkota Dewa
tiap hari (4 mgg)
tiap hari (4 mgg)
tiap hari (4 mgg)
P2
P1
P3
Dibiopsi
(akhir minggu ke 9)
Dikorbankan
Ekpresi wild p53, Bcl-2,
VEGF, apoptosis
Analisis Data
Gambar 4.2 Kerangka Operasional Penelitian
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
BAB 6
PEMBAHASAN
Pengobatan terhadap karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang selama ini
dilakukan meliputi pembedahan, penyinaran, radioterapi dan penggunaan obatobat kemoterapi. Data terkini menunjukkan bahwa tindakan operasi untuk
mengangkat jaringan kanker belum sepenuhnya menjamin kesembuhan dan ada
kecenderungan terjadinya remultiplikasi jaringan tersebut. Penggunaan radioterapi
menimbulkan resiko terjadinya kerusakan lain disekitar jaringan yang terkena
kanker. Pemberian kemoterapi antikanker memiliki efek farmakologi kurang
selektif, efek samping yang merugikan telah dilaporkan adanya resistensi
beberapa jenis kanker (Rizali dan Auerkari, 2003; Sismindari, 2005). Kondisi
tersebut sampai saat ini belum bisa diatasi secara memuaskan,
sehingga
penanganan terhadap kanker perlu dilakukan penelitian terhadap obat berbahan
dasar herbal yang dapat mencegah dan membunuh sel kanker tanpa merugikan
sel yang normal di sekitar sel kanker.
Penanganan kanker tanpa merugikan sel yang normal dalam membunuh sel
kanker, perlu dilakukan penelitian terhadap obat herbal yaitu buah delima (PGL)
hal ini karena senyawa dari ekstrak buah delima menghambat pertumbuhan sel
kanker dan membunuhnya serta memutus pasokan zat makanan dan oksigen ke
jaringan sel kanker. Selain itu penanganan dengan obat herbal dalam menangani
sel kanker merupakan cara pengobatan dengan biaya murah . Ekstrak buah delima
(PGL) terhadap penyakit kanker banyak diteliti secara invitro dan sedikit
107
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
penelitian secara invivo akan tetapi
untuk kejadian karsinoma sel skuamosa
rongga mulut belum pernah diteliti dan mekanisme kerja ekstrak buah delima
(PGL) terstandar terhadap sel kanker dan karsinoma sel skuamosa rongga mulut
juga belum dapat dijelaskan secara tuntas.
Penelitian mengenai obat tradisional, khususnya
bahannya yang berupa
tanaman obat, terus berlangsung hingga saat ini bahkan semakin meningkat.
Belum banyak hasil penelitian tanaman obat yang digunakan sebagai obat dalam
pelayanan kesehatan. Obat yang dapat digunakan di masyarakat harus memenuhi
persyaratan aman, bermanfaat dan sudah terstandarisasi. Untuk memenuhi
persyaratan tersebut tanaman obat harus melalui uji pra klinik dan klinik. Uji pra
klinik meliputi uji khasiat berdasarkan penelitian eksperimental yang dikerjakan
secara invivo maupun invitro.
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratoris untuk menjelaskan
mekanisme kerja ekstrak buah delima (PGL) terstandar terhadap hambatan /
degradasi tranformasi sel ke karsinoma sel skuamosa melalui perubahan ekspresi
wild p53, Bcl-2, VEGF dan
apoptosis pada sel mukosa rongga mulut bukal
mencit akibat paparan benzopirene.
Benzopirene digunakan pada penelitian ini sebagai bahan kimia untuk
membuat model hewan coba sel yang mengalami transformasi ke arah keganasan
(transform c ell), benzopirene merupakan bahan karsinogen yang lengkap, baik
sebagai inisiator maupun promotor kanker (Wang, 2003). Benzopirene (B(a)P)
dipaparkan ke hewan coba dapat membentuk B(a)P-7,8-diol-9,10-oxide yang
merupakan mutagenik karsinogen yang kuat dan reaktif (Kelley et al.,1997). Diol
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
oxide ini bersifat sangat reaktif dan akan membentuk ikatan kovalen dengan basa
guanin DNA (Wiese et al., 2001). Transformasi sel pada hewan percobaan dapat
diperoleh dengan melakukan paparan benzopirene 0,04 mg dilarutkan dalam
olium olivarum 0,04 ml pada mukosa bukal rongga mulut mencit sebelah kanan.
6.1 Aktivitas Ekstrak Buah Delima (PGL) Terstandar terhadap Ekspresi
Bcl-2 pada Sel Mukosa Rongga Mencit akibat paparan Benzopirene.
Berdasarkan Tabel 5.3, hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak
buah delima (PGL) terstandar menurunkan ekspresi Bcl-2 pada sel mukosa
rongga mulut mencit akibat paparan benzopirene. Penurunan pada kelompok
P2 (benzopirene + PGL) (0,016 ± 0,040) tidak ada perbedaan secara
signifikan dengan kelompok P3 (Benzopirene + MD) (0,000 ± 0,000), P1
(Benzopirene + EA) (0,083 ± 0,075) dan kelompok K0 (tanpa benzopirene)
(0,000 ± 0,000) tetapi berbeda secara signifikan dengan kelompok K1
(benzopirene + CMC) (0,366 ± 0,103).
Gen Bcl-2 mengkode protein yang berperan sebagai antia poptosis dan
merupakan kelompok protooncogene. Bcl-2 bekerja untuk menekan fungsi
Bax (pro apoptosis), menghambat kemampuan c-myc untuk menginduksi
apoptosis. Peningkatan Bcl-2 mempunyai peranan yang sangat penting pada
hambatan apoptosis
sel kanker/transformasi sel (Lumangga et al .,2008).
Salah satu kemungkinan mekanisme sel kanker/transformasi sel untuk
meningkatkan ekspresi Bcl-2 adalah Bcl-2 membentuk pori pada membran
yang ditancapnya dan berinteraksi dengan berbagai jenis protein intraseluler
lain yang secara langsung atau tidak langsung terlibat dalam dalam proses
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
apoptosis. Interaksi ini menunjukkan salah satu peran Bcl-2 adalah
memberikan tempat bagi protein lain, sehingga
bersangkutan
aktivitas seluler protein
berhenti (misalnya Bax, aktivitasnya akan berhenti). Bcl-2
mengontrol checkpoint dari jalur aktivasi caspase, sehingga kemungkinan
Bcl-2 mengendalikan jalur apoptosis bergantung caspase maupun tidak
bergantung caspase (jalur intrinsik dan jalur ekstrinsik) (Kresno,2011).
Hasil penelitian ini menunjukkan penurunan ekspresi Bcl-2 oleh ekstrak
buah delima terstandar lebih kuat bila dibandingkan dengan ellagic acid , hal
ini membuktikan bahwa ekstrak buah delima adalah penghambat Bcl-2 yang
efektif Estrak buah delima (PGL) / whole ekstrak lebih kuat efeknya daripada
bentuk bahan aktif tunggal, ini menunjukkan adanya efek sinergistik atau
tambahan dari bahan aktif lainnya di dalam buah delima (PGL) (Seeram et
al., 2005).
Apabila jumlah protein Bcl-2 sedikit, maka protein pro apoptosis (Bax)
mempunyai kesempatan lebih besar untuk berikatan dengan protein BH3 dan
ikatan ini merupakan inisiasi awal dari proses apoptosis (Shore et al., 2008),
kemungkinan
ekstrak buah delima
terstandar juga mempunyai aktivitas
menginduksi BH3 untuk melepas ikatan antara Bax dengan Bcl-2 sehingga
terjadi penurunan pada ekspresi Bcl -2.
Protein BH3-only adalah protein yang mempunyai fungsi untuk
menerima rangsangan yang berasal dari luar sel seperti obat. Rangsangan
tersebut menyebabkan protein BH3-only aktif dan bekerja secara langsung
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
membebaskan ikatan antara protein Bax dengan Bcl-2 dan menurunkan
ekspresi Bcl-2 (Marzo et al.,2008).
Penurunan ekspresi Bcl-2, akan meningkatkan aktivitas Bax (pro
apoptosis) Bax berperan membuka Pt-pore, sehingga cytochrome-c keluar
dari mitokondria. Cytochrome-c kemudian mengaktifkan Apaf-1, selanjutnya
Apaf-1 mengaktivasi kaskade-kaspase sehingga sel mengalami kematian
(apoptosis) (Kresno, 2011).
Biovaibilitas ekstrak buah delima lebih baik bila dibandingkan dengan
pemberian senyawa tunggal secara individual. Hal ini menggambarkan
pengaruh multifaktor dan efek sinergis berbagai senyawa yang terkandung
dalam buah delima (Seeram et al.,2005). Keberadaan polyphenol dalam buah
delima dapat meningkatkan kelarutan dan absorbsi ellagic acid dalam saluran
pencernaan. Selain itu polyphenol yang terdapat dalam ekstrak buah delima
juga memiliki kemampuan untuk menghambat metabolisme ellagic acid oleh
mikroflora intestinal, melalui aktivitas antibakterial yang dimiliki ekstrak
buah delima, sehingga ekstrak buah delima mempunyai kemampuan
penurunan ekspresi Bcl-2 lebih kuat dibanding ellagic ac id (Seeram et al .,
2006).
Ellagic acid, senyawa dimer yang merupakan derivat gallic acid, berada
dalam buah delima dalam bentuk bebas sebagai ellagic acid-glycosides atau
terikat dalam bentuk ellagitannins (Seeram et al., 2004). Pemberian per oral
pada tikus, 15% ellagic acid diekskresikan melalui urin dan feses. Rendahnya
aktivitas
Disertasi
dan konsentrasi ellagic ac id dalam plasma disebabkan karena
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
kelarutannya yang rendah dalam air. Selain itu diduga disebabkan karena
ellagic acid mudah mengalami transformasi dan degradasi sebelum
diabsorbsi. Metabolisme ellagic a cid yang tidak larut dalam intestinal
disebabkan oleh aktivitas mikroflora yang berada dalam intestinal (Seeram et
al., 2004).
Hasil penelitian pada kelompok K0 (normal tanpa paparan benzopirene
dan tanpa perlakuan) menunjukkan ekspresi Bcl-2 (0,000) tidak terekspresi,
hal ini disebabkan secara fisiologis sistem pertumbuhan sel dalam individu
diatur oleh sistem keseimbangan antara apoptosis dan proliferasi. Terjadi
keseimbangan antara Bcl-2 dan Bax (Sudiana, 2008).
Kelompok P3 (benzopirene + mahkota dewa (MD), sebagai kelompok
pembanding dan merupakan obat herbal yang sudah ada di pasaran,
menunjukkan hasil (0,000) tidak terekspresi Bcl-2, kandungan dari mahkota
dewa (phaleria m acrocarpa) antara lain ; alkaloid, terpenoid, saponin dan
polyphenol komponen terbesar pada mahkota dewa. Pada beberapa penelitian
menunjukkan ekstrak mahkota dewa dapat menstimulasi IFN-gamma yang
penting dalam memicu aktivitas CTL dan sel NK, mempunyai fungsi
sitostatika
untuk
membunuh
sel
kanker
dan
berfungsi
sebagai
imunostimulator. Polyphenol dapat berfungsi sebagai fas-ligand yang akan
memicu apoptosis sel melalui fas-receptor, polyphenol menginduksi
terjadinya apoptosis melalui jalur TNF-α, polyphenol dapat memblok reseptor
growth f actor dan menghambat MAPK pada jalur sinyal Reseptor T irosin
Kinase (RTK S ). Peningkatan dosis ekstrak mahkota dewa diikuti kenaikan
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
indeks apoptosis. Fakta- fakta ini yang menunjukkan hasil penurunan
ekspresi Bcl-2 mahkota dewa lebih bagus dari ekstrak buah delima (PGL)
maupun ellagic ac id. Dari beberapa penelitian toksisitas dari mahkota dewa
tinggi dan harus hati-hati dengan dosis (Suryanto, 2007).
Ekstrak mahkota dewa dalam membunuh kanker bekerja melalui
kandungan bahan aktifnya flavonoid, alkaloid, saponin. Flavonoid diketahui
memicu apoptosis sehingga Bcl-2 menurun, alkaloid memicu apoptosis
dengan meninngkatkan permeabilitas membran mitokondria sehingga terjadi
pelepasan cytochrome-c. Saponin juga dapat memicu apoptosis tapi belum
diketahui titik tangkapnya. Ekstrak mahkota dewa bersifat sitotosik pada cell
line Ca colon melalui pengaktifan caspase-3, peningkatan ekspresi caspase-3
sesuai dengan peningkatan dosis (Widyasari et al., 2008).
Mahkota dewa merupakan tanaman obat yang beracun, kulit dan daging
buahnya dalam keadaan segar memiliki rasa pahit, demikian juga bijinya
diduga memiliki senyawa yang kerjanya mirip dengan oxytosin dan
sintosinon kedua senyawa ini diketahui dapat mengganggu perkembangan
embrio, karena dapat merangsang kontraksi otot sehingga sangat berbahaya
bagi orang hamil. Mahkota dewa diduga juga mengandung senyawa yang
bersifat toksik dan teratogenik yang dapat berbahaya bila dikonsumsi dalam
jangka waktu yang panjang (Suatma et al., 2008)
Pemberian dosis tinggi ekstrak buah delima utuh, ellagitannin atau
punicalagin secara berulang, sebagaimana dosis umum yang dilakukan dalam
sistem pengobatan tradisional tidak bersifat toksik (Cerda et al., 2003 ; Vidal
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
et al., 2003). Penelitian menggunakan ekstrak buah delima (PGL) terstandar
yang diberikan pada tikus yang mengalami fibrosis hati diberikan secara
kronis setiap hari selama 28 hari menunjukkan tidak terjadi efek samping
pada ginjal, morfofungsi ginjal tidak berubah (Yuniarti, 2012).
Hasil uji korelasi menunjukkan bahwa pemberian ekstrak buah delima
(PGL) terstandar
mempunyai korelasi
positif yang bermakna terhadap
penurunan ekspresi Bcl-2 dengan penurunan ekspresi VEGF, hal ini
menunjukkan adanya komunikasi antara Bcl-2 yang mempunyai fungsi untuk
menghambat proses apoptosis dengan VEGF yang merupakan inducer
pembentukan angiogenesis. Angiogenesis adalah pertumbuhan pembuluh
darah baru dari pembuluh darah yang sudah ada dan merupakan fenomena
yang kompleks yang mutlak di perlukan untuk pertumbuhan dan survival dari
sel kanker, kanker yang berkembang akan meningkatkan ekspresi VEGF
untuk membentuk angiogenesis, ada hubungan dua arah antara Bcl-2 dan
VEGF.
Mekanisme Bcl-2 meningkatkan angiogenesis melalui peningkatan siklus
proliferasi sel. Proliferasi sel yang berlebihan akan memicu peningkatan
proses desakan antar sel. Proses desakan antar sel yang meningkat akan
memicu pengeluaran phospholipase A2, phospholipase A2 akan memicu
phosphotydil colin menjadi lisophosphotydil colin dan asam arachidonat.
Asam arachidonat melalui jalur siklooksigenase-2 (COX-2) mengeluarkan
prostaglandin yang akan menyebabkan sekresi angiopoitin, angiopoitin akan
mengaktivasi VEGF, VEGF akan menstimulasi pembentukan angiogenesis
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
(Cho, 2007). Dengan pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar Bcl-2
dapat dihambat sehingga VEGF juga dapat dihambat .
Hasil uji korelasi juga menunjukkan pemberian ekstrak buah delima
(PGL) mempunyai korelasi negatif yang bermakna antara penurunan ekspresi
Bcl-2 dengan kenaikan ekspresi wild p53, hasil ini dapat dijelaskan, wild p53
merupakan faktor transkripsi terhadap pembentukan P21, peningkatan P21
akan menekan CDK. Wild p53 juga akan memicu aktivitas Bax (pro
apoptosis), protein Bax akan menekan Bcl-2 (anti apoptosis).
6.2 Aktivitas Ekstrak Buah Delima (PGL) Terstandar terhadap Ekspresi
VEGF Pada Sel Mukosa Rongga Mulut
Mencit Akibat Paparan
Benzopirene .
Berdasarkan Tabel 5.4, hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak
buah delima (PGL) kelompok P2 (benzopirene + PGL) (0,183 ± 0,098) dapat
menurunkan ekspresi VEGF pada sel mukosa rongga mulut mencit akibat
paparan benzopirene, penurunuan ekspresi VEGF pada kelompok P2 tidak
berbeda secara signifikan dengan kelompok K0/K- (tanpa benzopirene +
CMC) (0,133 ± 0,103), P3 (benzopirene + MD) (0,150 ± 0,104), P1
(benzopirene + EA) (0,267 ± 0,103) tetapi berbeda secara signifikan dengan
kelompok K1 / K + (benzopirene + CMC) (0,350 ± 0,104).
VEGF merupakan inducer angi ogenesis yang di jumpai pada berbagai
jenis kanker, VEGF menunjukkan spesifitas sel sasaran yaitu spesifik bagi sel
endotel. VEGF selain meningkatkan proliferasi dan migrasi sel endotel juga
berperan meningkatkan permeabilitas pembuluh darah, menyebabkan faktor
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
koagulasi keluar dari pembuluh darah dan melapisi jaringan perivaskuler,
khususnya
fibrinogen
sehingga
mengakibatkan
terbentuknya
fibrin
perikanker yang memudahkan migrasi sel endotel dan fibroblast yang
mensekresi proteoglikan yang membentuk stroma matang bagi kanker.
Angiogenesis atau neovaskularisasi merupakan proses penting untuk
pertumbuhan survival kanker (Hasina et al., 2001; Kresno, 2011). Proliferasi
dan migrasi sel endotel diaktifkan oleh beberapa faktor angiogenesis seperti
Tirosin K inase reseptor antara lain vascular endothelial gr owth f actor
(VEGF) (FGF), angigenin, angiopoitin. VEGF dijadikan sebagai indikator
prediksi perkembangan sel kanker (Reuben et al., 2011).
VEGF merupakan stimuli utama untuk pertumbuhan kanker dan
neovaskularisasi. Perkembangan proses angiogenesis kanker dengan memicu
faktor pertumbuhan kemudian merangsang migrasi endotel dan proliferasi sel.
Pembuluh darah pada kanker memperlihatkan morfologi yang abnormal,
sementara pembuluh darah yang normal diorganisir oleh arteriola, kapiler,
dan venul yang mudah dibedakan (Dvorak, 2005). Penelitian dengan tehnik
imunohistokimia menunjukkan VEGF terlokalisir pada sel kanker dan endotel
(Roskoski,2007).
Proliferasi sel yang berlebihan pada sel kanker akan memicu pengeluaran
asam arachidonat melalui jalur siklooksigenase (COX-2), akan mengeluarkan
prostaglandin yang akan memicu angiopoitin mengeluarkan VEGF dan
memicu pembentukan angiogenesis (Cho, 2007). Angiogenesis adalah
pertumbuhan pembuluh darah baru dari pembuluh darah yang sudah ada, ini
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
merupakan fenomena kompleks yang mutlak diperlukan untuk pertumbuhan
dan survival sel kanker. Tanpa pembuluh darah baru yang menyediakan
nutrisi untuk kanker, kanker tidak akan tumbuh dan berkembang lebih besar
dari diameter 2-3 mm (Kresno, 2011).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak buah delima (PGL)
terstandar memiliki kemampuan menurunkan ekspresi VEGF, dengan
dihambatnya VEGF pembentukan
angiogenesis akan terhambat sehingga
pasokan nutrisi ke sel kanker akan terputus, sel kanker tidak akan
berkembang dan mati.
Delima dapat menghambat angiogenesis melalui regulasi terhadap
vascular e ndothelial gr owth f actor (VEGF). Hal ini disebabkan karena
produksi faktor angiogenik tersebut diregulasi oleh NF-kB (Seeram et al .,
2006).
Delima juga menghambat aktivitas siklooksigenase (COX-2), yaitu suatu
enzim yang terinduksi oleh agen mitogenik, inflamasi, sehingga akan
menurunkan sekresi prostaglandin, prostaglandin tidak memicu angiopoitin
untuk mensekresi VEGF, skresi VEGF dihambat sehingga angiogenesis tidak
terbentuk (Seeram et al.,2006).
Caffeic ac id yang merupakan salah satu kandungan bahan aktif buah
delima (PGL) dapat menghambat aktivasi STAT3 (Signal t ransducer and
aktivator of t ranscription 3 ). STAT 3 merupakan aktivator transripsi gen
VEGF pada berbagai kanker manusia. Aktivitas STAT3 berperan besar dalam
overproduksi VEGF (Jung et al.,2007).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Pada penelitian ini, aktivitas yang dimiliki ekstrak buah delima (PGL)
terstandar terhadap penurunan ekspresi VEGF lebih kuat dibanding ellagic
acid. Hal ini disebabkan karena ekstrak buah delima (PGL) terstandar
merupakan campuran berbagai senyawa yang kompleks, beberapa penelitian
membuktikan bahwa senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak buah
delima (PGL) terstandar memiliki kemampuan saling meningkatkan efek
biologis masing-masing, contohnya ellagic ac id dan quarcetin (keduanya
juga terdapat dalam buah delima) yang diberikan secara bersama-sama
menunjukkan hambatan yang lebih kuat terhadap pertumbuhan sel kanker
daripada bila diberikan secara individual (Seeram et al.,2005).
Keberadaan polyphenol dalam buah delima dapat meningkatkan
kelarutan dan absorbsi ellagic ac id dalam saluran pencernaan, selain itu
polyphenol yang terdapat dalam ekstrak buah delima juga memiliki
kemampuan untuk menghambat metabolisme ellagic acid oleh mikroflora
intestinal menjadi urothilin A dan B melalui aktivitas antibakteri yang
dimiliki ekstrak buah delima (Seeram et al., 2006).
Hasil penelitian pada kelompok P3 (benzopirene + mahkota dewa) obat
herbal yang sudah ada di pasaran menunjukkan penurunan ekspresi VEGF
yang lebih kuat dibanding ekstrak buah delima (PGL) dan ellagic acid, hal ini
mungkin disebabkan karena kandungan dari mahkota dewa (phaleria
macrocarpa) antara lain; alkaloid, terpenoid, saponin dan polyphenol,
flavonoid, Flavonoid, alkaloid, saponin dapat memicu apoptosis Peningkatan
dosis ekstrak mahkota dewa diikuti kenaikan indeks apoptosis (Widyasari et
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
al.,2008). Fakta-fakta ini yang menunjukkan hasil penurunan ekspresi VEGF
mahkota dewa lebih bagus dari ekstrak buah delima (PGL) maupun ellagic
acid.
Mahkota dewa merupakan tanaman obat yang beracun, kulit dan daging
buahnya dalam keadaan segar memiliki rasa pahit, demikian juga bijinya
diduga memiliki senyawa yang kerjanya mirip dengan oxytosin dan
sintosinon kedua senyawa ini diketahui dapat mengganggu perkembangan
embrio, karena dapat merangsang kontraksi otot sehingga sangat berbahaya
bagi orang hamil. Mahkota dewa diduga juga mengandung senyawa yang
bersifat toksik dan teratogenik yang dapat berbahaya bila dikonsumsi dalam
jangka waktu yang panjang (Suatma et al., 2008).
Pemberian dosis tinggi ekstrak buah delima utuh, ellagitannin atau
punicalagin secara berulang, sebagaimana dosis umum yang dilakukan dalam
sistem pengobatan tradisional tidak bersifat toksik (Cerda et al., 2003 ; Vidal
et al., 2003).
Hasil penelitian pada kelompok K0 (tanpa benzopirene dan tanpa
perlakuan)
VEGF terekspresi, hal ini karena beberapa sel normal,
diantaranya fibroblast, endotel dan keratinosit memproduksi VEGF dalam
jumlah kecil, peningkatan kadar VEGF terjadi bila diperlukan angiogenesis
(Kresno, 2011).
Terdapat korelasi positif antara penurunan ekspresi Bcl-2 dan penurunan
ekspresi VEGF. Peningkatan ekspresi Bcl-2 akan meningkatkan proliferasi
sel yang berlebihan pada sel kanker dan akan memicu sekresi VEGF, VEGF
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
akan memicu pembentukan angiogenesis. Angiogenesis akan memberi suplai
makanan, oksigen pada sel-sel kanker sehingga ekspresi Bcl-2 akan
meningkat, proliferasi sel akan meningkat, metastasis sel kanker akan
meningkat. Pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat
menghambat / menurunkan ekspresi Bcl-2 dan ekspresi VEGF, sel kanker
akan di degradasi melalui apoptosis dan memutus suplai makanan.
6.3 Efek Ekstrak Buah Delima (PGL) Terstandar terhadap Ekspresi wild
p53 pada Sel Mukosa Rongga Mulut Mencit Hewan Coba Akibat
Paparan Benzopirene
Berdasarkan Tabel 5.5, hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak buah
delima (PGL) terstandar dapat meningkatkan ekspresi wild p53 pada mukosa
rongga mulut mencit akibat paparan benzopirene, kelompok P2 (benzopirene
+ PGL) (0,350 ± 0,164) tidak berbeda secara signifikan dengan kelompok P3
(benzopirene + MD) (0,383 ± 0,194), P1 (benzopirene + EA) (0,333 ± 0,216),
K0 (tanpa benzopirene) (0,450 ± 0,333). Kelompok P2, P3, P1, K0 berbeda
secara signifikan dengan kelompok
K1 (benzopirene + CMC) (0,133 ±
0,081).
Wild p53 merupakan protein kelompok tumor supressor gene yaitu suatu
protein yang berperan sebagai faktor pengendalian pertumbuhan sel, bekerja
di dalam inti sel, khususnya pada proses pengendalian siklus pembelahan sel.
Wild p53 merupakan faktor transkripsi terhadap pembentukan p21,
peningkatan p21 yang disentesis akan menekan semua CDK, terjadinya siklus
pembelahan sel sangat tergantung pada CDK. CDK ditekan dan tidak
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
berfungsi sehingga siklus pembelahan sel akan berhenti. Wild p53 akan
memicu aktivitas Bax (pro apoptosis), aktivitas Bax akan menekan Bcl-2 (anti
apoptosis), sehingga terjadi pelepasan cytochrome-c dan akan mengaktifkan
Apaf-1 selanjutnya mengaktivasi kaskade-kaspase. Kaspase yang aktif
megaktifkan DNA-se, menembus membran inti sehingga merusak DNA yang
mutasi sehingga DNA sel yang mutasi rusak (fragmentasi) dan akhirnya sel
mengalami kematian (apoptosis).
Gen p53 diketahui bermutasi pada sekitar 70% kejadian kanker (William,
2000). Pada karsinoma sel skuamosa rongga mulut, pemeriksaan DNA
menunjukkan mutasi wild p53, di jumpai hingga 90% kasus
(Syafriadi,
2008). Mutasi wild p53 sebagai pointmutation, menghasilkan protein dengan
struktur berubah yang mengisolasi protein wild p53, sehingga menginaktivasi
aktivitas fungsi wild p53 (William, 2000).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak buah delima (PGL)
terstandar memiliki kemampuan untuk meningkatkan ekspresi wild p53,
peningkatan wild p53 akan memicu faktor transkripsi pembentukan p21,
peningkatan p21 akan menekan semua CDK, sehingga siklus sel berhenti.
Siklus sel berhenti wild p53 akan memicu Bax, aktivitas Bax akan menekan
Bcl-2 sehingga apoptosis dapat terjadi.
Ellagic acid dapat meningkatkan ekspresi reseptor kematian (apoptosis),
antara lain peningkatan reseptor TRAIL R2/ DR2. Ekspresi DR5 diatur oleh
wild p53 sehingga bisa dihubungkan dengan wild p53, peningkatan wild p53
akan meningkatka reseptor DR5. DR5 mengikat stimulasi kematian dan
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
menyebabkan aktivasi pro-caspase 8. Cross talk antara jalur khusus apoptosis
jalur ekstrinsik (melalui reseptor jalur kematian) dan intrinsik (melalui jalur
mitokondria) (Mohammad, 2002)
Ektrak buah delima (PGL) terstandar lebih kuat efeknya terhadap
peningkatan ekspresi wild p53 dibandingkan ellagic ac id, hal ini
membuktikan ekstrak buah delima (PGL) lebih efektif untuk meningkatkan
wild p53.
Ekstrak buah delima (PGL) yang mengandung beberapa bahan aktif,
kerjanya lebih unggul dan bekerja secara sinergis dari satu bahan aktif buah
delima. Empat kandungan bahan aktif dari buah delima (PGL), yaitu ellagic
acid, caffeic a cid, luteolin, punicid ac id secara individual menunjukkan
aktivitas antikanker pada sel kanker prostat. Namun bila dikombinasikan,
keempatnya menunjukkan aktivitas yang berlipat ganda (Seeram et al., 2006).
Peningkatan ekspresi wild p53 pada ellagic acid lebih rendah karena ellagic
acid mudah mengalami transformasi dan degradasi sebelum diabsorbsi,
kelarutannya rendah dalam air, metabolisme ellagic ac id tidak larut dalam
intestinal (Seeram et al.,2004).
Kelompok P3 (benzopirene + mahkota dewa (MD), sebagai kelompok
pembanding dan merupakan obat herbal yang sudah ada di pasaran,
menunjukkan hasil menunjukkan hasil ekspresi wild p53 lebih kuat
dibandingkan dengan ellagic acid dan ekstrak buah delima (PGL). Hal ini
mungkin karena kandungan dari mahkota dewa (phaleria macrocarpa) antara
lain ; alkaloid, terpenoid, saponin dan polyphenol komponen terbesar pada
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
mahkota dewa. Pada beberapa penelitian menunjukkan ekstrak mahkota dewa
dapat menstimulasi IFN-gamma yang penting dalam memicu aktivitas CTL
dan sel NK, mempunyai fungsi sitostatika untuk membunuh sel kanker dan
berfungsi sebagai imunostimulator. Polyphenol dapat berfungsi sebagai fasligand yang akan memicu apoptosis sel melalui fas-receptor, polyphenol
menginduksi terjadinya apoptosis melalui jalur TNF-α, polyphenol dapat
memblok reseptor growth f actor dan menghambat MAPK pada jalur sinyal
Reseptor T irosin K inase (RTK S ). Peningkatan dosis ekstrak mahkota dewa
diikuti kenaikan indeks apoptosis. Fakta- fakta ini yang menunjukkan hasil
peningkatan ekspresi wild p53, mahkota dewa lebih bagus dari ekstrak buah
delima (PGL) maupun ellagic acid (Suryanto, 2007).
Mahkota dewa merupakan tanaman obat yang beracun, kulit dan daging
buahnya dalam keadaan segar memiliki rasa pahit, demikian juga bijinya
diduga memiliki senyawa yang kerjanya mirip dengan oxytosin dan
sintosinon kedua senyawa ini diketahui dapat mengganggu perkembangan
embrio, karena dapat merangsang kontraksi otot sehingga sangat berbahaya
bagi orang hamil. Mahkota dewa diduga juga mengandung senyawa yang
bersifat toksik dan teratogenik yang dapat berbahaya bila dikonsumsi dalam
jangka waktu yang panjang (Suatma et al., 2008)
Pemberian dosis tinggi ekstrak buah delima utuh, ellagitannin atau
punicalagin secara berulang, sebagaimana dosis umum yang dilakukan dalam
sistem pengobatan tradisional tidak bersifat toksik (Cerda et al., 2003 ; Vidal
et al., 2003).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Hasil uji korelasi pemberian ekstrak buah delima (PGL) menunjukkan
hasil korelasi yang positif dan bermakna antara wild p53 dengan apoptosis.
Kenaikan ekspresi wild p53 diikuti kenaikan jumlah sel yang mengalami
apotosis. Wild p53 akan memicu aktivitas Bax (pro apoptosis ) dan akan
menekan Bcl-2 (anti apoptosis), sehingga kenaikan ekspresi wild p53 diikuti
kenaikan ekspresi apoptosis.
6.4 Aktivitas Ekstrak Buah Delima (PGL) Terstandar Terhadap Perubahan
Jumlah Sel Yang Mengalami Apoptosis Pada Sel Mukosa Rongga Mulut
Akibat Paparan Benzopirene
Berdasarkan Tabel 5.6, Hasil penelitian menunjukkan pemberian ekstrak
buah delima (PGL)
terstandar terhadap peningkatan apoptosis pada sel
mukosa rongga mulut mencit akibat paparan benzopirene. Hasil penelitian ini
menunjukkan bahwa ekstrak buah delima (PGL) menaikkan apoptosis pada
kelompok P2 (benzopirene + PGL) (0,366 ± 0,196) tidak berbeda secara
signifikan dengan kelompok P3 (benzopirene + MD) (0,317 ± 0,172), P1
(benzopirene + EA) (0,233 ± 0,081), kelompok P2 menunjukkan hasil
menaikkan apoptosis paling tinggi dibandingkan kelompok lain. Kelompok
P2, P3, P1 berbeda secara signifikan dengan kelompok K0 (tanpa
benzopirene + CMC) (0,083 ± 0,132 ) dan kelompok K1 (benzopirene +
CMC) ( 0,050 ± 0,054).
Kanker ditandai dengan proliferasi sel yang yang tidak terkendali, terjadi
ketidakseimbangan antara proliferasi dengan apoptosis. Sel menjadi
immortal, invasi dan metastasis ke organ-organ lain. Apoptosis adalah suatu
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
proses kematian sel terprogram yang terjadi secara teratur untuk
menghilangkan berbagai sel yang tidak diperlukan tanpa respons inflamasi
(Geweis, 2003). Apoptosis terjadi secara normal selama masa perkembangan
dan penuaan. Mekanisme tersebut merupakan mekanisme homeostasis untuk
menjaga dan memelihara populasi sel di dalam jaringan. Apoptosis juga
berfungsi sebagai mekanisme pertahanan seperti pada reaksi imun atau ketika
sel rusak karena suatu penyakit atau gen toksik. Karakteristik apoptosis
adalah terjadi fragmentasi DNA, kondensasi kromatin, pengerutan sitoplasma
dan sel akan mati tanpa lisis sehingga tidak merusak sel atau jaringan
sekitarnya (Geweis, 2003; Elmore, 2007).
Apoptosis merupakan proses kematian sel dalam rangka mempertahankan
integritas tubuh secara keseluruhan. Program ini memiliki peran yang penting
untuk menjaga homeostatis perkembangbiakan sel. Salah satu peran penting
apoptosis adalah untuk membatasi proliferasi sel yang berlebihan pada sel
kanker (Salido et al ., 2009). Target-target multifungsional dan aktivasi
beberapa jalur khusus apoptosis penting dalam terapi kanker untuk mencegah
perkembangan resistensi obat dalam terapi kanker (Mohammad, 2002).
Setiap sel akan merespon semua stres atau stimulus yang diterimanya
melalui berbagai macam cara baik melalui aktivasi sinyal kehidupan sampai
inisiasi kematian sel. Tujuan dari proses tersebut adalah menjaga
homeostasis, sehingga sel yang tidak diperlukan akan dieliminasi. Mekanisme
tersebut tergantung pada berbagai macam faktor dan kemampuan sel untuk
mengatasi stres atau stimulus (Samali et al ., 2010), stimulus yang diberikan
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
pada penelitian ini adalah pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar ,
menunjukkan dapat meningkatkan apoptosis.
Apoptosis
merupakan
suatu
mekanisme
yang
efisien
untuk
mengeliminasi sel yang tidak diperlukan dan mungkin berbahaya sehingga
dapat menyelamatkan organisme. Pada proses apoptosis dapat terjadi
kegagalan, yang akan menyebabkan terjadinya kanker, karena sel yang
mengalami mutasi terus menerus akan replikasi secara tidak terkendali. Wild
p53 merupaka tumor supresor gen yang akan teraktivasi jika sel memiliki gen
yang cacat (gene defect). Fungsi dari wild p53 ini mencegah replikasi sel pada
sel yang rusak atau mutasi secara genetik melalui penghentian siklus sel pada
fase G1 atau interfase, sehingga sel mempunyai waktu untuk repair. Selain
itu gen ini juga berfungsi untuk mencetuskan apoptosis . (Lumangga, 2008;
Kresno, 2011).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak buah delima (PGL)
terstandar memiliki kemampuan meningkatkan apoptosis yang paling tinggi
dibanding kelompok lainnya. Estrak buah delima (PGL) terstandar akan
meningkatkan wild p53 akan memicu aktivitas Bax (pro apoptosis) dan
menekan Bcl-2 (anti apoptosis), sehingga terjadi pelepasan cytochrome-c dan
akan mengaktifkan Apaf-1 selanjutnya mengaktivasi kaskade-kaspase.
Kaspase yang aktif mengaktifkan DNA-se. DNA-se menembus membran inti
dan merusak DNA yang mutasi sehingga DNA-sel yang mutasi di
fragmentasi dan akhirnya sel dengan DNA yang mutasi mengalami kematian
(apoptosis).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Pengontrolan dan pengaturan proses apoptosis melalui jalur intrinsik
(jalur mitokondria) dilakukan melalui Bcl-2, yang dikenal dengan inhibitor
apoptosis. Mekanisme Bcl-2 menghambat apoptosis dengan membentuk pori
pada membran yang ditancapnya dan berinteraksi dengan berbagai jenis
protein intraselular lain yang secara langsung maupun tidak langsung terlibat
dalam proses apoptosis. Bcl-2 memberi tempat berlabuh bagi protein lain
sehingga protein bersangkutan terhenti aktivitasnya,misal Bax maka aktivitas
Bax akan berhenti (Kresno, 2011). Dengan adanya penurunan ekspresi Bcl-2
pada penelitian ini, apoptosis untuk sel yang mengalami transformasi ke
karsinoma dapat terjadi.
Ellagic ac id dapat menghambat ekspresi protein
IAP dan ekspresi
protein XIAP pada penelitian secara invitro, sebagian besar kanker
menunjukkan over ekspresi protein IAP dan XIAP. Protein IAP untuk
melindungi sel kanker dari stimuli kematian sehingga beberapa terapi
antikanker menargetkan menghambat ekspresi IAP untuk membunuh sel
kanker. XIAP supresor apoptosis paling kuat, XIAP mengikat dan
menghambat caspase-3, caspase -7 dan caspase-9, dengan efek ellagic a cid
yang dapat menghambat XIAP, apoptosis bisa terjadi (Mohammad, 2002).
Kelompok K0 (tanpa benzopirene dan tanpa perlakuan) apoptosis rendah,
pada kelompok K0 merupakan kelompok normal, secara fisiologis, sistem
pertumbuhan sel dalam individu diatur oleh suatu keseimbangan, yaitu
keseimbangan antara apoptosis dan proliferasi (Sudiana, 2008).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Hasil uji korelasi pemberian ekstrak buah delima (PGL)
terstandar
terdapat korelasi positif antara wild p53 dengan apoptosis. Kenaikan ekspresi
wild p53 akan diikuti kenaikan ekspresi apoptosis. Hal ini membuktikan
bahwa mekanisme kerja peningkatan apoptosis oleh ekstrak buah delima
(PGL) melalui jalur intrinsik dengan aktivitas wild p53.
6.5 Temuan Baru
6.5.1 Kerangka Temuan Baru
Delima (PGL)
R. Estrogen
VEGF ↓
Wild p53 ↑
Angiogenesis ↓
Bax ↑
Bcl-2
Apoptosis
Gambar 6.1 Kerangka Temuan Baru
6.5.2 Keterangan Kerangka Temuan Baru
Transformasi sel akibat paparan benzopirene menghasilkan metabolit
reaktif yang akan berikatan secara kovalen dengan DNA sehingga terjadi
mutasi pada gen p53 sehingga wild p53 tidak berfungsi. Ekstrak buah delima
(PGL) terstandar memicu aktivitas wild p53, merupakan faktor transkripsi
terhadap pembentukan p21. Peningkatan p21 akan menekan semua CDK
pada siklus sel, maka siklus sel akan berhenti. Saat siklus sel berhenti, wild
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
p53 akan memacu antivitas Bax sehingga terjadi perubahan permeabilitas
membran dari mitokokondria. Perubahan ini mengakibatkan terjadi pelepasan
cytokrom-c ke sitosol, cytokrom-c akan megaktivasi Apaf-1, yang akan
mengaktifkan kaskade-kaspase. Kaskade-kaspase akan mengaktifkan DNAse, akan menembus membran inti dan merusak DNA yang cacat/mutasi.
Sehingga DNA sel yang cacat / mutasi akan fragmentasi (rusak) dan akhirnya
mengalami kematian (apoptosis).
Ekstrak buah delima (PGL) terstandar masuk ke dalam sel melalui
reseptor estrogen, ikatan antara delima dengan trasformasi sel melalui ikatan
fas-ligand. Ikatan fas-ligand akan memicu aktivasi phospholipase C (PLC)
mengubah phosphotydil i nositol diphosphat (PI2) menjadi phosphotydil
inositol t riphosphat (PI3P) dengan reseptor di membran endoplasmic
reticulum menyebabkan pintu calcium di membran endoplasmic r eticulum
terbuka, sehingga Ca+ dilepas ke sitosol mengatifkan phospholipase A2,
phospholipase A2 memecah phosphotydil c olin menjadi lisophosphotydil
colin dan asam ar akidonat. Asam ar akidonat melalui jalur sikooksigenase
2/COX-2 mengeluarkan prostaglandin,prostaglandin memicu angiopoitin
untuk mengeluarkan VEGF, VEGF merupakan inducer yang akan memicu
pembentukan angiogenesis dan angiogenesis bertindak sebagai faktor
pertumbuhan autocrine bagi sel kanker. Ekstrak buah delima (PGL)
terstandar
menghambat produksi VEGF mengakibatkan pembentukan
angiogenesis menurun/tidak terbentuk, suplai makanan, oksigen terputus ke
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
sel yang mengalami transformasi ke karsinoma sel skuamosa sehingga sel
yang mengalami transformasi akan mengalami kematian.
Menemukan jalur apoptosis dari mekanisme kerja ekstrak buah delima
(PGL) melaui peningkatan ekspresi wild p53, menurunkan ekspresi Bcl-2
dan dapat menurunkan ekspresi VEGF sehingga angiogenesis menurun.
Angiogenesis mutlak diperlukan untuk pertumbuhan dan survival sel kanker.
Hasil penelitian ini juga membuktikan bahwa induksi pada mekanisme
apoptosis merupakan faktor esensial untuk mengatasi sel kanker dan memutus
suplai nutrisi dari sel kanker sehingga sel kanker bisa mati.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
BAB 7
PENUTUP
7.1 Kesimpulan
Mekanisme kerja ekstrak buah delima (PGL) terhadap apoptosis melalui
jalur intrinsik dan ada korelasi positif dua arah antara ekspresi Bcl-2 dengan
ekspresi VEGF.
1.
Ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat menurunkan ekspresi Bcl-2
yang mempunyai korelasi positif dan bermakna dengan penurunan ekspresi
VEGF, penurunan ekspresi Bcl-2 mempunyai korelasi negatif dan bermakna
dengan peningkatan ekspresi wild p53.
2.
Ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat meningkatkan ekspresi wild
p53 dan mempunyai korelasi positif dengan peningkatan ekspresi
apoptosis.
6.2 Saran
1.
Perlu melakukan penelitian lanjutan untuk menentukan kandungan
senyawa lain dalam ekstrak buah delima (PGL) terstandar yang memiliki
kemampuan meningkatkan potensi dan aktivitas ellagic ac id sebagai
antikanker.
2.
Melakukan penelitian lebih lanjut tentang pemanfaatan ekstrak buah
delima (PGL) terstandar, baik dalam optimalisasi bentuk sediaan maupun
pemanfaatannya dalam uji preklinik maupun klinik bagi penderita
kanker.
131
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
3.
Melakukan penelitian lebih lanjut tentang pemanfaatan ekstrak buah
delima (PGL) terstandar ke fitofarmaka.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
DAFTAR PUSTAKA
Albrecht M, Jiang W, Kumi, Diaka J, 2004. Pomegranate extracs potently
suppress proliferation, xenograft growth and invasion of human
prostate cancer cells. J Med Food 7 : 247-283.
Arundina I, 2008. Efek fraksi n-heksana etil asetat artemesia vulgaris L terhadap
ekspresi protein ras, p53, PCNA, C-MYC dan apoptosis pada sel
mukosa rongga mulut yang mengalami transformasi akibat induksi
benzopirene. Disertasi. Program Pasca Sarjana Universitas Airlangga
Surabaya. Hal: 11-19.
Azadzoi KM and Siroky M, 2010. Oxidative stress and molecular reaction in
arteriogenic erectile dysfunction. Chonnam Medical Journal 45 (1)
:1-8.
Baert
AL, 2008. Apoptosis in encyclopedia of diagnostic imaging Vol 2,
Spreinger –Verlag Berlin Heindelberg .New York 94-98.
Baratawidjaya KN dan Rengganis I, 2010. Texbook imunologi dasar. Fakultas
Kedokteran Universitas Indonesia, Edisi ke -9. Hal 124-126, 460463.
Bell C and Hawthorne S, 2008. Ellagic acid, pomegranate and prostate cancer
Mini review, 2008. J Pharm Pharmacol 60 (2) : 66-71.
Budhy TI, 2004. Karsinogenesis karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang
terinfeksi epstein-barr virus (EBV) berdasar ekspresi p53, c-myc dan
Bcl-2. Disertasi . Program Pasca Sarjana Universitas Airlangga
Surabaya. Hal ; 33- 43
Budhy TI, 2008. Protein spesifik karsinoma sel skuamosa rongga mulut sebagai
marker deteksi dini. Majala Kedokteran Gigi, vol 23,No 3,
September 2008.
Burlado B, Verota L, Lura C, Bottini E, 2010. Monographes of herbal principle.
Massa CRS Pres pp 5-15.
Celik I, Atilla Temur and Ismail Isik, 2009. Hepatoprotective role andantioxidant
capacity of pomegranate (punica granatum) flower infusion againts
trichloroacetic acid-exposed in rats. J Food and Chemical 47 (1):
145- 149.
Cerda B, Ceron II, Tomas-Barberan FA, Espin JC, 2003. Repeated oral
administration of high doses of the pomegranate, ellatannin,
punicalagin to rats for 37 day is not toxid. J Agric Food Chen, 51:
3493-34501.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Cerda B, Soto C, Albaladejo MD, Martinez P, Sanchez-GasconF, TomasBalberan F, Espin JC, 2006. Pomegranate juice supplementation in
chronic obstructive pulmonary disease : a 5-week randomized,
double-blind, placebo-controlled trial. J Clin Nutr; 60(2):33-40.
Cho WC, 2007. Nasopharyngeal Carcinoma Molecular Biomarker Discovery and
Progres. Molecular Cancer 6:1 -8
Cotran RS, Kumar V, Collin T.1999. Neoplasia in pathologic basic of disease.
Sixth Edition, Philadelphia : W.B Saunders Company, pp : 260-325.
Cotran RS. Kumar V, Collins T, 2005 Pathologic basic of disease 7th ed.
Philadelphia. WB Saunders Company : 260-325.
Edderkaoui M, Odinokova I, Ohno I, Gukovsky I, Go V L W, Pandol S J,
Gukovkaya A S, 2008. Ellagic acid induces apoptosis through
inhibitian of nuclear factor kB pancreatic cancer cells. Journal of
Gastroenterologi ISSN 1007-9327 21: 14 (230 :3672-3680.
Dvorak HF, 2005. Angiogenesis update. J Thromb Haemost 3 : 1835 -1840.
Elmore S, 2007. Apoptosis a rewiew of programmed cell death. Toxicol Pathol
35-495-516.
Epstein J and Waal IV, 2008. Oral cancer. Texbook of oral medicine, Burket
Eleventh Edition. BC Decker Inc Hamilton Press :153-167.
Faust RA,1994.Toxicity Summary For Benzo (a) pyrene. Prepared for oak ridge
reservation environmental restoration program. martin marieta
energy Sistems, Inc, For The US. Department Of Energy Under
Contrac N0 DE-AC05-840R21400 : 1-6.
Geweis A, 2003. Introduction to apoptosis. Aporeview 1-26.
Gil C, Wei J, Yang J, 2008. Pomegranate juice is potentially better than aple
Juice in improving antioxidant function in elderly subject. Nutr Res
: 28: 72-77.
Guo N, Faller DV, Vaziri C. 2002. Carcinogen Induced S-phase arrest is Chk 1
mediated and caffeine sensitive. Cell Growth Differentiation : 13:7786
Griffiths, EJF, Miller DT. Suzuki, Lewontin W, Gilbert M. 1993. An introduction
to genetic analysis, 5 Ed. W. H. Preeman and Company. New York.p
; 841.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Hasina
R,
Mark W, Lingen, 2001. Angiogenesis in oral cancer.D
Center.Department of Pathology, Loyola University Medical J of
Dental Education, Vol 65. Hal:11.
Heyne, K.1987.Tanaman berguna indonesia, jilid II, Cetakan Pertama,
diterjemahkan oleh Badan Litbang Departemen Kehutanan, Yayasan
Sarana Wana Jaya, Jakarta :1029.
Hong MY, Seeram NP, Heber D, 2008.Pomegranate polyphenols down-regulate
exspression of androgen-synthesizing genes in human prostate
cancer cells overexpressing the androgen receptor. Journal of
Nutritional Biochemistry. David Geffen School Medicine University
of California, Los Angeles : 20-30.
Hoang N, Tran A, Bae YS, Song BH, 2010. Pomegrnate (punica granatum )seed
linolenic acid isomers concentration dependent modulation of
estrogen receptor activity. J Biological Eduction, Kyungpook
National University Teagu, Republic of Korea. Vol 35 ; 1-16.
Hui L, Abbas T, Pielak RM, Joseph T, Borgonetti J, Fosta DA, 2000.
Phospolipase D elevates the level of MDM2 and supresses DNA
damage induced increases in p53 molecular and celuler biology.
24(13) : 5677-5686.
Jung JE, Kim HS, Lee CS, Park DH, Myung Y, Lee MJ, Lee JW, Park JW, Kim
MS, Ye SK, Chung MH, 2007. Caffeic acid and its synthetic derivad
cape supressor tumor angiogenesis by blocking STAT3-mediated
VEGF expression in human
carcinoma. Department of
Pharmaology College of Medicine, Soul National University, Soul
110-799. Korea. Carcinogenesis Vol 28 n0 8 :1780-1787.
Jurenka J, 2008. Therapeutic applications of pomegranate (Punica granatum L) :
A Review Alternative Medicine Review, 13 (21) : 128-144.
Kelley DJ, Mestre JR, Subbaramaiah K, Sacks PG, Schantz SP, Tanabe T, Inoue
H. Ramonetti JT, Dannenberg AJ, 1997. Benzo (a) pyrene up
regulates cyclooxygenase-2 gene expression in oral epithelial eells.
Carcinogenesis 18 ( 4) : 795- 799.
Khan N, Afaq F, Kweon MH, Kim KM, Mukhtar H, 2007. Oral consumpsion of
pomegranate fruit extract inhibits growth and progression of primary
lung tumors in mice. Departement of Dermatology, University of
Wisconsin-Madison, Medical Sciences Center. 67 (7): 3475- 3482.
King RJB. 2000. Cancer Biology. Prentice Hall Pearson Education ,pp 50-158.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Kintoko, Hawariah A, Pihie L, 2008. Efek proliferasi ekstrak kloroform dari
phaleria macrocarpa pada titisan sel kanker manusia. Fakultas
Farmasi Universitas Ahmad Dahlan. Universitas Kebangsaan
Malaysia, pp 1- 6.
Kim H K, Yang T H, Cho H Y, 2009. Antifibrotic effect of green tea on invitro
and invivo models of liver fibrosis. J Gastroenterol 15 (41) : 52005205.
Kresno SB, 2011. Texbook Ilmu dasar onkologi. Edisi kedua. Badan Penerbit
Fakultas Kedokteran Universitas Indonesi. Hal 66-129.
Kholifa M,2010,Pengaruh konsentrasi ekstrak etanol buah delima (Punica
granatum Linn) terhadap peningkatan apoptosis sel kanker lidah
manusia Sp-C1 invitro. Fakultas Kedokteran Universitas
Muhammadiyah Surakarta.Biomedika,Vol 2 No 2, hal :72-80.
Lansky EP and Newman RA, 2007. Punica granatum (pomegranate) and its
potential for preventif and treatment of inflammation and cancer. J
Ethnopharmaceol 109: 177-206.
Lumangga F, 2008. Apoptosis. J departemen Patologi Anatomi Fakultas
Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan. Hal 1-7.
Malik A, Afaq F, Sarfaras S, Vaqar M, Andhani, Deeba N S, Mukhtar H 2005.
Pomegranate fruit juice for chemoprevention and chemotherapy of
prostate cancer. Dermatology, 1300 University Avenue, MSC B25,
Madison. Proc Natl Acad Sci 102 : 35-42.
Martin KR, Trempus C. Saulnier M, Kari FW, Barret JC, French JE. 2001.
Dietary N-acetyl L-cystein modulates benzopyrene induced skin
tumor in cancer-prone p53 haplo insufficient Tg.c (vH-Ras) mice
carcinogenesis, 22 (9) ; 1373-1378.
Maoli T, Wei-Chen G, Cheng su C, Gung Lin J, Chung Yeh C, Chu Cheng K,
Gung Chung J, 2005. Ellagic acid induced p53 /p21 ekspression, G1
arreest and apoptosis in human bladder cancer T24 cells. School of
Chinese Medicine. Department of Microbiology, China Medical
University. Anti cancer research 25 :971-980.
Marzo L and Naval J, 2008. Bcl-2 family members as molecular targets in cancer
therapy. J Biochen Pharm 76: 939-46.
McCutcheon A, Udani J, Brown DJ, 2008. Scientific and clinical monograp for
pom wonderful pomegrante Juice.American Botanical Council .pp 115.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Mehrota R and Syadav. 2006. Oral squamous cell carcinoma, etiology,
phatogenesis and prognostic of genomic alteration. Indian Journal of
cancer Departement of phatology. Motilai Nehru Medical colleg.
University of Alhabad. Pp : 162.
Mendelsohn J, Holley PM, Israel MA, Gray JW, Thompson CB, 2008. The
moleculer basis cancer. 3ed Elsevier Saunders, Philadelphia.
Apoptosis, Autophagy and Necrosis. Pp : 205-220.
Meier, P, Finch, A and Evan G, 2000. Apoptosis in development. Nature
407(6805) : 796-801.
Mestas J, Hughes C, 2004. Of mice and not men; differences between mouse and
human immunology.J Immunol.172 : 2731:2738.
Mohammad HF, 2002. Ellagic Acid-Mediated CK2 Inhibition, A Natural
multifunction strategy to trigger cervical cancer cell death Invitrio
and Invivo. Disertation On Department Of Chemistry, Cleve Land
State University. pp 1-24.
National Plant Data Center, 2000. USDA, Baton Rouge, LA. pp70874-4490,
USA.
Nurhayati S dan Lusiyanti Y, 2006. Apoptosis dan respon biologik sel sebagai
faktor prognosa radioterapi kanker. Pusat Teknologi Keselamatan
dan Metrologi Radiasi. Batan. Vol 7 : 57-66.
Palanysamy D, Syamala, Kannan E and Bhojraj S, 2007. Protective and
therapeutic effect of the indian medical plant pterocaurpus santa
linus on D-galactosamine-induce liver damage. Traditional Med. 2
(20) : 51-57.
Pantuck AJ, Leppert JT, Zomorodian N, 2006. Phase II study of pomegranate
juice for men with rising prostate- spesific antigen following surgery
or radiation for prostate cancer. Clin Cancer Res 12, : 87-94.
Papoutsi Z, Kassi E, Tsiapara A, Fokiakis N, George P, Chrousos, Moutsatsou P,
2005. Evalution of Estrogen / Antiestrogenic Activity of Ellagic
Acid Via The Estrogen Reseptor Subtypes Erα Erβ.Departement of
Pharmacy. University of Athena.J.Agric Food Chem. 53:7715-7720.
Pelengaris S, Khan M, 2006. DNA replikasi and cell cycle In The Molecular
Biology of Cancer.Toronto : Blackwell Publishing .pp 88-119.
Pindborg JJ, 2000. Texbool kanker dan pra kanker rongga mulut. EGC. Jakarta.
Hal :1- 38.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Pressentin MM, Kosinska W, GuttenplanJB.2003.Mutagenesis induced by oral
carcinogen in lac mouse tongue and other oral tissue. carcinogenesis.
20 (11): 2167-2170.
Pulmeriastuti H, 2006. Ekspresi fas, granzyme dan caspase 3 pada apoptosis sel
bursa fabrictus ayam pada infeksi virus gumboro. Disertasi. Program
Pasca Sarjana Universitas Airlangga Surabaya. Hal 8-39.
Rantam, A. F., 2003, Pewarnaan imuhistokimia dari limfosit. Metode Imunologi
Surabaya : Airlangga University Press, hal 129-144.
Reuben SC, Gopalan A, Danielle M, Bishayee A, 2011. Modulation of
angiogenesis by dietary phytoconstituents in the prevention and
intervention of breast cancer. J Pharmaceuticl Sciences, College of
Pharmacy Northeast Ohio Medical University Rootstown, OH,
USA.56 ;14-29
Rizali, E dan Auerkari EI.2003.Teknik pewarnaan silver (AgNOR) sebagai salah
satu cara menentukan aktivitas proliferasi sel tumor dan apoptosis,
Jurnal Kedokteran Gigi Indonesia 10 (3), Hal:41-45.
Robert A, Vicall FB, Claporols C, Meunier B. 2006. The animalarial drug
artemisinim alkylates heme in infected mice. PNAS. 102 (38):
13676-13680.
Roger JBK and Robin MW, 2006. Mutation DNA repair and genetic instability in
cancer biology III Edition. Gosport: Ashford Colour Press : 112. in
Infected Mice. PNAS. 102 (108) :13676-13680.
Roskoski R, 2007. Vascular endotel growth factor (VEGF) signaling in tumor
progression .Critical Reviews in Oncology Hematology 62: 179-213.
Safriadi M, 2008. Patologi mulut tumor neoplastik dan non neoplastik rongga
mulut.Textbook of Patologi Mulut.C.V Andi : 73-83.
Sai prakash CV nd Indra prakash, 2011. Bioactive chemical constituents from
pomegranate (punica granatum) juice, seed nd peel-A review.
International Jof Research in Chemistry and Environment Vol 1(1-8)
ISSN22 : 48-9649.
Saifudin A, Rahayu V, Teruna H Y.2011. Texbook standardisasi bahan Obat
alam.Edisi pertama.Graha Ilmu. Hal ;1- 26.
Salido GM, Rosado JA.2009.Apoptosis; involvement of oxidative stress and
intracellular Ca2+ homeostasis.Dept of Physiology.University of
Extremadure. Spain.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Samali A, Fulda S, Adrienne MG, Osamu H, Srinivasula SM, 2010.Cell stress and
cell death.Int J Cell Biol :11-15.
Sartippour MR, Seeram NP, Rao JY, Moro A, Harris DM, Henning SM, Firouzi
A, Rettig MB, Aronson WJ, Pantuck AJ, Heber D, 2008.
ellagitannin-rich pomegranate extract inhibit angiogenesis in prostate
cancer invitro and invivo. Int J. Oncol 32 (2) : 43-50.
Sattar A, Hewer A. Philips DH. Camphell FC. 1999. Metabolic proficiency and
benzo (a) pyrene DNA adduct formation in APC mouse adenomas
and uninvolveld mucosa. Carcinogenesis. 20 (6) : 1097-1101.
Seeram NP, Lee R and Heber D, 2004. Bioavailability of ellagic acid in human
plasma after consumptionof ellagitannins from pomegranate (Punica
Granatum L) juice Clinica Chimica Acta 348 (2004) 63-68.
Seeram NP, Adam LS, Henning SM, Niu Y, Zhang Y, Nair MG, Heber D. 2005.
Invitro antiproliferative, apoptosis and antioxidant activitics of
punicalagin, ellagic acid and a total pomegranate tannin extract are
enhanced in combination with other polyphenol as found in
pomegranate juice. J of Nutr Biochem 16 : 360-367.
Seeram NP, Schulman RN, Heber D, 2006. Pomegranate ancient roots to modern
Medicine 1st Ed. Taylor and Francis Group, New York .pp 2-99.
Seelinger G, Merfort I, Wolfle U, Cristoph M, Schempp, 2008. Anti-carcinogenic
effects of the flavanoid luteolin.J Medical and Pharmaceutical
Services, Berlin, Germany. University Medical Center Freiburg. 13 :
2628-2651.
Schubert YS, Lansky EP, Neeman I, 199. Antioxydant and eicosanoid enzyme
inhibition properties of pomegranate seed oil and fermented juice
flavonoids. J Ethnopharmacol 66 :11-17.
Shore GC, Ngayem M, 2008. Bcl-2 Proteins and Apoptosis. Choose Your Partner.
Cell 135 : 1004-7.
Solomon MC, Carnelio S, Gudattu V.2010. Molecular analysis of oral squamous
cell carcinoma : a tissue microarray study. Department of Oral
Pathlogy, Manipal College of Dental Science, Manipal University
Manipal, Karnataka -576 104. India. Vol : 47 : 166-172.
Spector DJ, Robert DG, Lesli AI, 1998. Cell laboratory manual, subcellular
localization of gene and their product, Vol 3, Publisher, Cold Spring
Harbor Laborator1y Press. New York, USA : 151-161.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Sismindari, 2005. Target biologi sebagai tantangan pada penemuan dan
pengembangan obat antikanker, Fakultas Farmasi. Universitas Gajah
Mada. Hal : 1-5.
Suatma, Haryono A, Widyastuti N, 2008. Efek toksik buah mahkota dewa
(Phaleria macrocarpa) Pada mencit (Mus Musculus) Swiss Webster
.Jurnal Biotika Vol .5 No.1 Juni 2008 hal. 42-48.
Suryanto T, 2007. Pengaruh pemberian ekstrak phaleria macrocarpa terhadap
indeks apoptosis sel adenokarsinoma mamma dan perkembangan
massa tumor payudara mencit CH3. Disertasi. Pascasarjana
Universitas Diponegoro Semarang. Hal 8-12.
Subiyantoro P, 2010. Deteksi Metilasi p 14 Karsinoma sel skuamosa rongga
mulut. Disertasi. Program Pasca Sarjana Universitas Airlangga.
Surabaya. Hal 7- 10.
Sudiana, IK., 2005. Teknologi ilmu jaringan dan imunohistokimia Surabaya :
Agung seto.
Sudiana IK, 2008. Patobiologi molekuler kanker.Textbook Penerbit Salemba
Medika : 27-90.
Sunitha Carpelio and Gabriel Rodrigues, 2004. Oral cancer a glance. The Journal
of Dental Sience. Volume 1 Number 2.
Solomon MC, Carnelio S, Gudattu V, 2010. Molecular analysis of oral squamous
cell carcinoma : a tissue microarray study. Oral Pathology J,
Manipal. College of Dental Science, Manipal University, Vol 47 ;
166-172.
Thongrakard V and Tencomnao T, 2010. Modulatory effects of thai mecicinal
plant Extract on proinflammatory cytokines-induced apoptosis in
human keratocyte HaCaT cells. Center for excellence in omics-nano
medical technology development project, departement of clinical
chemistry, faculty of allied health sciences Chulalongkom
University, Bangkok. Thailand : 103 -130.
Umeda D, Yano S, Yamada K and Tachibane, 2007. The Polyphenol
Epigallocatechin-3-Gallate Signaling Pathway Through 67-kDa
Laminin Receptor.
Valadares MC, Pereire ERT, Benfica PL, Paula JR, 2010. Assessment of
mutagenic and antimutagenic effects of Punica Granatum. In Mice
Brazillian Journal of Pharmaceutical Sciences vol 46 : 120 -125.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Vidmar J, Gigard S, Kindzierski W, Schulz J, 2004. Review of approaches for
setting an objective for mixtures in ambient air using polycyclic
aromatic hidrocarbon (PAHs). Air Polic Section Alberta
Environment 11th Floor, Baker Centre 10025-106th Street Edmonton,
Alberta T5J1G4 :1-40.
Vidal A, Fallarero A, Pena BR, Medina ME, Gra B, Rivera F, Gutierrez Y,
Vuorela PM, 2003. Studies on the toxicity of punica granatum L
(Punicacea) whole fruitt extracts J Etnopharmacol, 89: 295-300.
Wahyuni F, 2010. Karsinoma sel skuamosa yang didahului inflamasi kronis nonspesifik. Departemen Penyakit Mulut,Universitas Sumatera. Hal:3-9.
William, 2000. Molecular Pathogenesis of oral squmous carcinoma. J Clin Oral
Pathology Birmingham Dental Hopital and School 53 ;165-172.
Wiese FW, Thompson PA, Kadlubar FF, 2001. Carcinogen substrat specificity of
human Cox 1 and Cox 2. Carcinogenesis 22 (1 ) ; 5-10.
Walum, E, K. Stenberg and D. Jansen. 2000. Understanding cell toxicology
principles and practice. Ellis Horwood Limited. England : 129-136.
Wang Y. 2003. Public health goal for benzopirene in drinking Water
Wasito R. 2001. Penggunaan imunohistokimia untuk diagnosis penyakit. Kursus
Singkat Imunohistokimia di PAU. Universitas Gajah Mada.
Yogyakarta. Hal 5-10.
Widyasari A, Retnoningsih D, Lassie N, 2008. Ekstrak etanol biji mahkota dewa
(Phaleria Macrocarpa (Scheff)Boerl) meningkatkan ekspresi
caspase-3 aktif pada cell line CA Colon WIDR. Fakultas Kedokteran
Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. PKMI-2-7-1.
Yakovlev AG and Faden AI, 2004. Mechanism of neural cell death : implication
for development of neuroprotective treatment strategies. The
American Society for Exsperimental Neuro Therapeutic, 1 : 5-16.
Yuaniarti WM,2012.Efek antifibrotik ekstrak buah delima (Punica granatum L )
pada fibrosis hati.Disetasi.Program Pascasarjana Fakultas
Kedokteran Universitas Airlangga,hal 100-109.
Zhang S, Won YK.Ong CN, Shen HM. 2009. Anti cancer potential of
sesquiterpene lactoner bioctive and molecular mechanism. Curr
Med. Chem Anti Cancer Agent. 5 (3) : 239-249.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Lampiran 1
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Lampiran 2
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Lampiran 3
NPar Tests
One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test
Kelompok
Kontrol Negatif
N
a,,b
Normal Parameters
Most Extreme Differences
Kontrol Positif
6
6
6
Mean
34.9333
36.2617
38.1533
Std. Deviation
2.33295
2.27895
2.31747
Absolute
.201
.277
.191
Positive
.201
.173
.165
Negative
-.191
-.277
-.191
.494
.679
.468
Asymp. Sig. (2-tailed)
.968
.746
.981
6
6
6
Mean
36.7033
34.7367
34.6817
Std. Deviation
N
Most Extreme Differences
3.17227
3.68468
4.29698
Absolute
.192
.184
.196
Positive
.192
.177
.195
Negative
-.154
-.184
-.196
Kolmogorov-Smirnov Z
.469
.450
.481
Asymp. Sig. (2-tailed)
.980
.987
.975
N
Normal Parametersa,,b
Most Extreme Differences
6
6
6
Mean
34.8000
33.3650
34.2383
Std. Deviation
3.15468
3.39049
3.16824
.361
.352
.350
Absolute
Positive
.219
.231
.222
Negative
-.361
-.352
-.350
Kolmogorov-Smirnov Z
.883
.862
.857
Asymp. Sig. (2-tailed)
.416
.448
.454
6
6
6
Mean
35.7833
34.8050
35.4683
Std. Deviation
Benzopyrene + PGL N
Normal Parametersa,,b
4.73811
4.90675
4.86519
Absolute
.277
.243
.225
Positive
.207
.182
.197
Negative
-.277
-.243
-.225
Kolmogorov-Smirnov Z
.679
.594
.550
Asymp. Sig. (2-tailed)
.745
.872
.923
6
6
6
Mean
39.5500
38.8717
40.8300
Std. Deviation
1.77172
1.87223
3.11360
.162
.187
.192
Most Extreme Differences
Benzopyrene + MD
Berat Badan
stlh perlakuan
(gram)
Kolmogorov-Smirnov Z
Normal Parametersa,,b
Benzopyrene + EA
Berat Badan
stlh paparan
(gram)
Berat Badan
Awal (gram)
N
a,,b
Normal Parameters
Most Extreme Differences
Absolute
Positive
.157
.187
.192
Negative
-.162
-.162
-.153
Kolmogorov-Smirnov Z
.396
.459
.469
Asymp. Sig. (2-tailed)
.998
.985
.980
a. Test distribution is Normal.
b. Calculated from data.
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Oneway
Descriptives
Berat Badan Awal (gram)
95% Confidence Interval
for Mean
Kontrol Negatif
Kontrol Positif
Benzopyrene + EA
Benzopyrene + PGL
Benzopyrene + MD
Total
Std.
Deviation
N
Mean
6
6
6
6
6
30
34.9333
36.7033
34.8000
35.7833
39.5500
36.3540
Lower
Bound
Std. Error
2.33295
3.17227
3.15468
4.73811
1.77172
3.45316
.95242
1.29507
1.28789
1.93432
.72330
.63046
Upper Bound Minimum Maximum
32.4850
33.3742
31.4894
30.8110
37.6907
35.0646
37.3816
40.0324
38.1106
40.7557
41.4093
37.6434
32.50
33.20
30.50
30.60
37.80
30.50
37.80
40.90
37.30
41.00
42.50
42.50
Test of Homogeneity of Variances
Berat Badan Awal (gram)
Levene Statistic
df1
df2
5.222
4
Sig.
25
.003
ANOVA
Berat Badan Awal (gram)
Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
Within Groups
90.572
255.233
4
25
Total
345.805
29
F
22.643
10.209
2.218
Sig.
.096
Robust Tests of Equality of Means
Berat Badan Awal (gram)
a
Statistic
Brown-Forsythe
df1
2.218
df2
4
Sig.
17.517
.109
a. Asymptotically F distributed.
Oneway
Descriptives
Berat Badan stlh paparan (gram)
95% Confidence Interval
for Mean
N
Kontrol Negatif
Kontrol Positif
Benzopyrene + EA
Benzopyrene + PGL
Benzopyrene + MD
Total
Disertasi
Mean
6
6
6
6
6
30
36.2617
34.7367
33.3650
34.8050
38.8717
35.6080
Std.
Deviation
Std.
Error
2.27895 .93038
3.68468 1.50426
3.39049 1.38416
4.90675 2.00317
1.87223 .76434
3.68744 .67323
Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum
33.8701
30.8698
29.8069
29.6557
36.9069
34.2311
38.6533
38.6035
36.9231
39.9543
40.8365
36.9849
33.15
30.00
29.05
29.08
36.79
29.05
38.50
38.90
36.67
41.00
41.75
41.75
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Test of Homogeneity of Variances
Berat Badan stlh paparan (gram)
Levene Statistic
df1
df2
4.014
4
Sig.
25
.012
ANOVA
Berat Badan stlh paparan (gram)
Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
Within Groups
105.083
289.236
4
25
Total
394.320
29
F
26.271
11.569
2.271
Sig.
.090
Robust Tests of Equality of Means
Berat Badan stlh paparan (gram)
a
Statistic
Brown-Forsythe
df1
2.271
df2
4
Sig.
17.887
.102
a. Asymptotically F distributed.
Oneway
Descriptives
Berat Badan stlh perlakuan (gram)
95% Confidence Interval
for Mean
N
Kontrol Negatif
Kontrol Positif
Benzopyrene + EA
Benzopyrene + PGL
Benzopyrene + MD
Total
Std.
Deviation
Mean
6
6
6
6
6
30
38.1533
34.6817
34.2383
35.4683
40.8300
36.6743
Std.
Error
2.31747
4.29698
3.16824
4.86519
3.11360
4.23891
Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum
.94610
1.75423
1.29343
1.98620
1.27112
.77392
35.7213
30.1723
30.9135
30.3626
37.5625
35.0915
40.5854
39.1911
37.5632
40.5740
44.0975
38.2572
35.03
29.09
30.01
30.00
37.45
29.09
41.15
39.00
37.00
41.32
45.48
45.48
Test of Homogeneity of Variances
Berat Badan stlh perlakuan (gram)
Levene Statistic
1.971
df1
df2
4
Sig.
25
.130
ANOVA
Berat Badan stlh perlakuan (gram)
Sum of Squares
df
Mean Square
Between Groups
Within Groups
184.898
336.185
4
25
Total
521.083
29
Disertasi
46.224
13.447
F
3.437
Sig.
.023
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Post Hoc Tests
Multiple Comparisons
Berat Badan stlh perlakuan (gram)
LSD
Mean
Difference
(I-J)
Std. Error
95% Confidence Interval
(I) Kelompok
(J) Kelompok
Kontrol Negatif
Kontrol Positif
3.47167
2.11718
.114
-.8888
7.8321
Benzopyrene + EA
3.91500
2.11718
.076
-.4454
8.2754
Benzopyrene + PGL
2.68500
2.11718
.216
-1.6754
7.0454
Benzopyrene + MD
-2.67667
2.11718
.218
-7.0371
1.6838
Kontrol Negatif
-3.47167
2.11718
.114
-7.8321
.8888
Kontrol Positif
Benzopyrene + EA
Lower Bound
Upper Bound
.44333
2.11718
.836
-3.9171
4.8038
-.78667
2.11718
.713
-5.1471
3.5738
Benzopyrene + MD
*
-6.14833
2.11718
.008
-10.5088
-1.7879
Kontrol Negatif
-3.91500
2.11718
.076
-8.2754
.4454
Kontrol Positif
-.44333
2.11718
.836
-4.8038
3.9171
Benzopyrene + PGL
-1.23000
2.11718
.566
-5.5904
3.1304
Benzopyrene + MD
-6.59167
*
2.11718
.005
-10.9521
-2.2312
-2.68500
2.11718
.216
-7.0454
1.6754
.78667
2.11718
.713
-3.5738
5.1471
Benzopyrene + EA
1.23000
2.11718
.566
-3.1304
5.5904
Benzopyrene + MD
-5.36167
*
2.11718
.018
-9.7221
-1.0012
2.67667
2.11718
.218
-1.6838
7.0371
*
2.11718
.008
1.7879
10.5088
*
2.11718
.005
2.2312
10.9521
*
2.11718
.018
1.0012
9.7221
Benzopyrene + PGL
Benzopyrene + EA
Sig.
Benzopyrene + PGL Kontrol Negatif
Kontrol Positif
Benzopyrene + MD Kontrol Negatif
Kontrol Positif
6.14833
Benzopyrene + EA
6.59167
Benzopyrene + PGL
5.36167
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
NPar Tests
One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test
Kelompok
Kontrol Negatif
BCl2
N
VEGF
6
a,,b
Normal Parameters
Mean
.1333
.4500
.0833
.10328
.33317
.13292
Absolute
.293
.393
.401
Positive
.293
.393
.401
Negative
-.207
-.227
-.265
.718
.963
.983
.681
.312
.289
6
6
6
Asymp. Sig. (2-tailed)
N
6
a,,b
Normal Parameters
Mean
.3667
.3500
.1333
.0500
.10328
.10488
.08165
.05477
Absolute
.293
.183
.293
.319
Positive
.207
.183
.207
.319
Negative
Std. Deviation
Most Extreme Differences
Disertasi
6
.0000
Kolmogorov-Smirnov Z
Kontrol Positif
Apoptosis
6
.00000c
Std. Deviation
Most Extreme Differences
P53
6
-.293
-.183
-.293
-.319
Kolmogorov-Smirnov Z
.718
.449
.717
.782
Asymp. Sig. (2-tailed)
.681
.988
.682
.573
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Benzopyrene + EA
N
Normal Parametersa,,b
Mean
Std. Deviation
6
6
.3333
.2333
.07528
.10328
.21602
.08165
.254
.293
.121
.293
Positive
.246
.207
.109
.207
Negative
-.254
-.293
-.121
-.293
Kolmogorov-Smirnov Z
.623
.718
.297
.717
Asymp. Sig. (2-tailed)
.833
.681
1.000
.682
6
6
6
6
N
a,,b
Normal Parameters
Mean
Std. Deviation
Most Extreme Differences
Absolute
.0167
.1833
.3500
.3667
.04082
.09832
.16432
.19664
.492
.401
.286
.299
Positive
.492
.266
.286
.299
Negative
-.342
-.401
-.181
-.198
1.205
.981
.701
.733
.110
.291
.709
.655
Kolmogorov-Smirnov Z
Asymp. Sig. (2-tailed)
Benzopyrene + MD
6
.2667
Absolute
Most Extreme Differences
Benzopyrene + PGL
6
.0833
N
6
6
6
6
.0000
.1500
.3833
.3167
.00000c
.10488
.19408
.17224
Absolute
.183
.226
.251
Positive
.183
.161
.251
Negative
-.183
-.226
-.190
Kolmogorov-Smirnov Z
.449
.554
.615
Asymp. Sig. (2-tailed)
.988
.919
.844
Normal Parametersa,,b
Mean
Std. Deviation
Most Extreme Differences
a. Test distribution is Normal.
b. Calculated from data.
c. The distribution has no variance for this variable. One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test cannot be performed.
General Linear Model
Between-Subjects Factors
Value Label
Kelompok
N
0
Kontrol Negatif
6
1
Kontrol Positif
6
2
Benzopyrene + EA
6
3
Benzopyrene + PGL
6
4
Benzopyrene + MD
6
Descriptive Statistics
Kelompok
BCl2
VEGF
Disertasi
Mean
Std. Deviation
N
Kontrol Negatif
.0000
.00000
6
Kontrol Positif
.3667
.10328
6
Benzopyrene + EA
.0833
.07528
6
Benzopyrene + PGL
.0167
.04082
6
Benzopyrene + MD
.0000
.00000
6
Total
.0933
.15298
30
Kontrol Negatif
.1333
.10328
6
Kontrol Positif
.3500
.10488
6
Benzopyrene + EA
.2667
.10328
6
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
P53
Apoptosis
Benzopyrene + PGL
.1833
.09832
6
Benzopyrene + MD
.1500
.10488
6
Total
.2167
.12617
30
Kontrol Negatif
.4500
.33317
6
Kontrol Positif
.1333
.08165
6
Benzopyrene + EA
.3333
.21602
6
Benzopyrene + PGL
.3500
.16432
6
Benzopyrene + MD
.3833
.19408
6
Total
.3300
.22614
30
Kontrol Negatif
.0833
.13292
6
Kontrol Positif
.0500
.05477
6
Benzopyrene + EA
.2333
.08165
6
Benzopyrene + PGL
.3667
.19664
6
Benzopyrene + MD
.3167
.17224
6
Total
.2100
.18071
30
a
Box's Test of Equality of Covariance Matrices
Box's M
F
df1
df2
Sig.
47.417
1.406
20
807.650
.111
Tests the null hypothesis that the observed covariance matrices of the
dependent variables are equal across groups.
a. Design: Intercept + klp
c
Multivariate Tests
Effect
Value
Intercept
Pillai's Trace
Wilks' Lambda
Wilks' Lambda
Sig.
22.000
.000
a
4.000
22.000
.000
a
4.000
22.000
.000
a
4.000
22.000
.000
1.446
3.539
16.000
100.000
.000
.050
7.030
16.000
67.849
.000
12.210
16.000
82.000
.000
b
4.000
25.000
.000
12.056
Pillai's Trace
Error df
4.000
12.056
Roy's Largest Root
Hypothesis df
a
.077
Hotelling's Trace
Klp
F
.923
Hotelling's Trace
9.530
Roy's Largest Root
8.512
66.307
66.307
66.307
66.307
53.201
a. Exact statistic
b. The statistic is an upper bound on F that yields a lower bound on the significance level.
c. Design: Intercept + klp
a
Levene's Test of Equality of Error Variances
F
BCl2
VEGF
P53
Apoptosis
5.788
.144
1.072
4.140
df1
df2
4
4
4
4
Sig.
25
25
25
25
.002
.964
.391
.010
Tests the null hypothesis that the error variance of the
dependent variable is equal across groups.
a. Design: Intercept + klp
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Tests of Between-Subjects Effects
Dependent
Variable
Source
Corrected Model
Type III Sum of
Squares
klp
Error
Corrected Total
F
Sig.
4
.147
40.880
.000
4
.049
4.638
.006
c
4
.084
1.845
.152
d
4
.117
6.124
.001
BCl2
.261
1
.261
72.593
.000
VEGF
1.408
1
1.408
132.862
.000
P53
3.267
1
3.267
71.332
.000
Apoptosis
.589
VEGF
.197
P53
.338
.469
1.323
1
1.323
69.146
.000
BCl2
.589
4
.147
40.880
.000
VEGF
.197
4
.049
4.638
.006
P53
.338
4
.085
1.845
.152
Apoptosis
.469
4
.117
6.124
.001
BCl2
.090
25
.004
VEGF
.265
25
.011
1.145
25
.046
Apoptosis
.478
25
.019
BCl2
.940
30
VEGF
1.870
30
P53
4.750
30
Apoptosis
2.270
30
BCl2
.679
29
VEGF
.462
29
1.483
29
.947
29
P53
Total
Mean Square
b
BCl2
Apoptosis
Intercept
df
a
P53
Apoptosis
a. R Squared = ,867 (Adjusted R Squared = ,846)
b. R Squared = ,426 (Adjusted R Squared = ,334)
c. R Squared = ,228 (Adjusted R Squared = ,104)
d. R Squared = ,495 (Adjusted R Squared = ,414)
Estimated Marginal Means
Kelompok
Estimates
95% Confidence Interval
Dependent
Variable
Kelompok
Mean
BCl2
Kontrol Negatif
1.978E-17
.024
-.050
.050
Kontrol Positif
.367
.024
.316
.417
Benzopyrene + EA
.083
.024
.033
.134
Benzopyrene + PGL
Disertasi
Lower Bound
Upper Bound
.017
.024
-.034
.067
1.361E-16
.024
-.050
.050
Kontrol Negatif
.133
.042
.047
.220
Kontrol Positif
.350
.042
.263
.437
Benzopyrene + EA
.267
.042
.180
.353
Benzopyrene + MD
VEGF
Std. Error
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
P53
Apoptosis
Benzopyrene + PGL
.183
.042
.097
.270
Benzopyrene + MD
.150
.042
.063
.237
Kontrol Negatif
.450
.087
.270
.630
Kontrol Positif
.133
.087
-.047
.313
Benzopyrene + EA
.333
.087
.153
.513
Benzopyrene + PGL
.350
.087
.170
.530
Benzopyrene + MD
.383
.087
.203
.563
Kontrol Negatif
.083
.056
-.033
.200
Kontrol Positif
.050
.056
-.066
.166
Benzopyrene + EA
.233
.056
.117
.350
Benzopyrene + PGL
.367
.056
.250
.483
Benzopyrene + MD
.317
.056
.200
.433
Pairwise Comparisons
95% Confidence Interval
a
for Difference
a
Dependent
Variable
(I) Kelompok
(J) Kelompok
Mean
Difference (I-J)
BCl2
Kontrol Negatif
Kontrol Positif
-.367
.000
-.438
-.295
Benzopyrene + EA
-.083
.035
.024
-.155
-.012
Benzopyrene + PGL
-.017
.035
.635
-.088
.055
-1.163E-16
.035
1.000
-.071
.071
*
.035
.000
.295
.438
*
.035
.000
.212
.355
*
.035
.000
.279
.421
*
.035
.000
.295
.438
*
.035
.024
.012
.155
*
-.283
.035
.000
-.355
-.212
Benzopyrene + PGL
.067
.035
.066
-.005
.138
Benzopyrene + MD
.083
*
.035
.024
.012
.155
.017
.035
.635
-.055
.088
*
-.350
.035
.000
-.421
-.279
Benzopyrene + EA
-.067
.035
.066
-.138
.005
Benzopyrene + MD
.017
.035
.635
-.055
.088
1.163E-16
.035
1.000
-.071
.071
*
.035
.000
-.438
-.295
Kontrol Negatif
.367
Benzopyrene + EA
.283
Benzopyrene + Kontrol Negatif
EA
Kontrol Positif
Benzopyrene + Kontrol Negatif
PGL
Kontrol Positif
Benzopyrene + Kontrol Negatif
MD
Kontrol Positif
Kontrol Positif
.350
.367
.083
-.367
Benzopyrene + EA
-.083
*
.035
.024
-.155
-.012
Benzopyrene + PGL
-.017
.035
.635
-.088
.055
*
Kontrol Positif
-.217
.059
.001
-.339
-.094
Benzopyrene + EA
-.133
*
.059
.034
-.256
-.011
Benzopyrene + PGL
-.050
.059
.408
-.172
.072
Benzopyrene + MD
-.017
.059
.781
-.139
.106
*
.217
.059
.001
.094
.339
Benzopyrene + EA
.083
.059
.173
-.039
.206
Benzopyrene + PGL
.167
*
.059
.010
.044
.289
*
.059
.002
.078
.322
.133
*
.059
.034
.011
.256
-.083
.059
.173
-.206
.039
Kontrol Negatif
Benzopyrene + MD
Benzopyrene + Kontrol Negatif
EA
Kontrol Positif
Disertasi
Upper
Bound
.035
Benzopyrene + MD
Kontrol Negatif
Lower
Bound
*
Benzopyrene + PGL
VEGF
a
Sig.
*
Benzopyrene + MD
Kontrol Positif
Std.
Error
.200
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Benzopyrene + PGL
.083
.059
.173
-.039
.206
Benzopyrene + MD
.117
.059
.061
-.006
.239
.050
.059
.408
-.072
.172
*
-.167
.059
.010
-.289
-.044
Benzopyrene + EA
-.083
.059
.173
-.206
.039
Benzopyrene + MD
.033
.059
.580
-.089
.156
Benzopyrene + Kontrol Negatif
PGL
Kontrol Positif
Benzopyrene + Kontrol Negatif
MD
Kontrol Positif
P53
Kontrol Negatif
.017
.059
.781
-.106
.139
-.200
*
.059
.002
-.322
-.078
Benzopyrene + EA
-.117
.059
.061
-.239
.006
Benzopyrene + PGL
-.033
.059
.580
-.156
.089
Kontrol Positif
.317
*
.124
.017
.062
.571
Benzopyrene + EA
.117
.124
.354
-.138
.371
Benzopyrene + PGL
.100
.124
.426
-.154
.354
Benzopyrene + MD
Kontrol Positif
.067
.124
.594
-.188
.321
Kontrol Negatif
-.317
*
.124
.017
-.571
-.062
Benzopyrene + EA
-.200
.124
.118
-.454
.054
Benzopyrene + PGL
-.217
.124
.092
-.471
.038
Benzopyrene + MD
-.250
.124
.054
-.504
.004
-.117
.124
.354
-.371
.138
.200
.124
.118
-.054
.454
Benzopyrene + PGL
-.017
.124
.894
-.271
.238
Benzopyrene + MD
-.050
.124
.689
-.304
.204
-.100
.124
.426
-.354
.154
Benzopyrene + Kontrol Negatif
EA
Kontrol Positif
Benzopyrene + Kontrol Negatif
PGL
Kontrol Positif
.217
.124
.092
-.038
.471
Benzopyrene + EA
.017
.124
.894
-.238
.271
Benzopyrene + MD
-.033
.124
.790
-.288
.221
-.067
.124
.594
-.321
.188
.250
.124
.054
-.004
.504
Benzopyrene + EA
.050
.124
.689
-.204
.304
Benzopyrene + PGL
.033
.124
.790
-.221
.288
Benzopyrene + Kontrol Negatif
MD
Kontrol Positif
Apoptosis
Kontrol Negatif
Kontrol Positif
.033
.080
.680
-.131
.198
-.150
.080
.072
-.314
.014
*
.080
.002
-.448
-.119
Benzopyrene + MD
*
-.233
.080
.007
-.398
-.069
Kontrol Negatif
-.033
.080
.680
-.198
.131
*
.080
.030
-.348
-.019
*
.080
.001
-.481
-.152
*
-.267
.080
.003
-.431
-.102
Benzopyrene + EA
Benzopyrene + PGL
Kontrol Positif
Benzopyrene + EA
-.183
Benzopyrene + PGL
-.317
Benzopyrene + MD
Benzopyrene + Kontrol Negatif
EA
Kontrol Positif
.150
.080
.072
-.014
.314
.183
*
.080
.030
.019
.348
Benzopyrene + PGL
-.133
.080
.107
-.298
.031
Benzopyrene + MD
-.083
.080
.307
-.248
.081
*
.080
.002
.119
.448
.317
*
.080
.001
.152
.481
.133
.080
.107
-.031
.298
.050
.080
.537
-.114
.214
*
.080
.007
.069
.398
*
.080
.003
.102
.431
Benzopyrene + Kontrol Negatif
PGL
Kontrol Positif
Benzopyrene + EA
Benzopyrene + MD
Benzopyrene + Kontrol Negatif
MD
Kontrol Positif
Disertasi
-.283
.283
.233
.267
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Benzopyrene + EA
Benzopyrene + PGL
.083
.080
.307
-.081
.248
-.050
.080
.537
-.214
.114
Based on estimated marginal means
*. The mean difference is significant at the ,05 level.
a. Adjustment for multiple comparisons: Least Significant Difference (equivalent to no adjustments).
Multivariate Tests
Value
Pillai's trace
Wilks' lambda
Hotelling's trace
Roy's largest root
F
1.446
.050
9.530
8.512
Hypothesis df
3.539
7.030
12.210
a
53.201
Error df
16.000
16.000
16.000
4.000
Sig.
100.000
67.849
82.000
25.000
.000
.000
.000
.000
Each F tests the multivariate effect of Kelompok. These tests are based on the linearly
independent pairwise comparisons among the estimated marginal means.
a. The statistic is an upper bound on F that yields a lower bound on the significance level.
Univariate Tests
Dependent Variable
BCl2
VEGF
P53
df
Mean Square
Contrast
.589
4
.147
Error
.090
25
.004
Contrast
.197
4
.049
Error
.265
25
.011
Contrast
.338
4
.085
1.145
25
.046
Error
Apoptosis
Sum of Squares
Contrast
.469
4
.117
Error
.478
25
.019
F
Sig.
40.880
.000
4.638
.006
1.845
.152
6.124
.001
The F tests the effect of Kelompok. This test is based on the linearly independent pairwise
comparisons among the estimated marginal means.
Post Hoc Tests
Kelompok
Multiple Comparisons
LSD
95% Confidence Interval
Dependent
Variable
BCl2
(I) Kelompok
Kontrol Negatif
Kontrol Positif
Benzopyrene +
EA
(J) Kelompok
Disertasi
Sig.
Lower Bound Upper Bound
*
.03464
.000
-.4380
-.2953
Benzopyrene + EA
*
-.0833
.03464
.024
-.1547
-.0120
Benzopyrene + PGL
-.0167
.03464
.635
-.0880
.0547
Benzopyrene + MD
.0000
.03464
1.000
-.0713
.0713
Kontrol Negatif
.3667*
.03464
.000
.2953
.4380
Benzopyrene + EA
*
.2833
.03464
.000
.2120
.3547
Benzopyrene + PGL
.3500*
.03464
.000
.2787
.4213
Benzopyrene + MD
*
.3667
.03464
.000
.2953
.4380
Kontrol Negatif
.0833*
.03464
.024
.0120
.1547
*
-.2833
.03464
.000
-.3547
-.2120
.0667
.03464
.066
-.0047
.1380
Benzopyrene + MD
*
.0833
.03464
.024
.0120
.1547
Kontrol Negatif
.0167
.03464
.635
-.0547
.0880
Kontrol Positif
Kontrol Positif
Benzopyrene + PGL
Benzopyrene +
Mean
Difference (I-J) Std. Error
-.3667
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
PGL
Benzopyrene +
MD
VEGF
Kontrol Negatif
Kontrol Positif
Benzopyrene +
EA
Benzopyrene +
PGL
Benzopyrene +
MD
P53
Kontrol Negatif
Kontrol Positif
-.3500*
.03464
.000
-.4213
-.2787
Benzopyrene + EA
-.0667
.03464
.066
-.1380
.0047
Benzopyrene + MD
.0167
.03464
.635
-.0547
.0880
Kontrol Negatif
.0000
.03464
1.000
-.0713
.0713
Kontrol Positif
-.3667*
.03464
.000
-.4380
-.2953
Benzopyrene + EA
-.0833*
.03464
.024
-.1547
-.0120
Benzopyrene + PGL
-.0167
.03464
.635
-.0880
.0547
Kontrol Positif
-.2167*
.05944
.001
-.3391
-.0942
Benzopyrene + EA
-.1333*
.05944
.034
-.2558
-.0109
Benzopyrene + PGL
-.0500
.05944
.408
-.1724
.0724
Benzopyrene + MD
-.0167
.05944
.781
-.1391
.1058
Kontrol Negatif
.2167*
.05944
.001
.0942
.3391
Benzopyrene + EA
.0833
.05944
.173
-.0391
.2058
Benzopyrene + PGL
*
.1667
.05944
.010
.0442
.2891
Benzopyrene + MD
.2000*
.05944
.002
.0776
.3224
Kontrol Negatif
.1333*
.05944
.034
.0109
.2558
Kontrol Positif
-.0833
.05944
.173
-.2058
.0391
Benzopyrene + PGL
.0833
.05944
.173
-.0391
.2058
Benzopyrene + MD
.1167
.05944
.061
-.0058
.2391
Kontrol Negatif
.0500
.05944
.408
-.0724
.1724
Kontrol Positif
*
-.1667
.05944
.010
-.2891
-.0442
Benzopyrene + EA
-.0833
.05944
.173
-.2058
.0391
Benzopyrene + MD
.0333
.05944
.580
-.0891
.1558
Kontrol Negatif
.0167
.05944
.781
-.1058
.1391
Kontrol Positif
-.2000*
.05944
.002
-.3224
-.0776
Benzopyrene + EA
-.1167
.05944
.061
-.2391
.0058
Benzopyrene + PGL
-.0333
.05944
.580
-.1558
.0891
Kontrol Positif
.3167*
.12356
.017
.0622
.5711
Benzopyrene + EA
.1167
.12356
.354
-.1378
.3711
Benzopyrene + PGL
.1000
.12356
.426
-.1545
.3545
Benzopyrene + MD
Kontrol Positif
Benzopyrene +
EA
Benzopyrene +
PGL
Benzopyrene +
MD
Apoptosis
Kontrol Negatif
Kontrol Positif
Disertasi
.0667
.12356
.594
-.1878
.3211
Kontrol Negatif
-.3167*
.12356
.017
-.5711
-.0622
Benzopyrene + EA
-.2000
.12356
.118
-.4545
.0545
Benzopyrene + PGL
-.2167
.12356
.092
-.4711
.0378
Benzopyrene + MD
-.2500
.12356
.054
-.5045
.0045
Kontrol Negatif
-.1167
.12356
.354
-.3711
.1378
Kontrol Positif
.2000
.12356
.118
-.0545
.4545
Benzopyrene + PGL
-.0167
.12356
.894
-.2711
.2378
Benzopyrene + MD
-.0500
.12356
.689
-.3045
.2045
Kontrol Negatif
-.1000
.12356
.426
-.3545
.1545
Kontrol Positif
.2167
.12356
.092
-.0378
.4711
Benzopyrene + EA
.0167
.12356
.894
-.2378
.2711
Benzopyrene + MD
-.0333
.12356
.790
-.2878
.2211
Kontrol Negatif
-.0667
.12356
.594
-.3211
.1878
Kontrol Positif
.2500
.12356
.054
-.0045
.5045
Benzopyrene + EA
.0500
.12356
.689
-.2045
.3045
Benzopyrene + PGL
.0333
.12356
.790
-.2211
.2878
Kontrol Positif
.0333
.07986
.680
-.1311
.1978
Benzopyrene + EA
-.1500
.07986
.072
-.3145
.0145
Benzopyrene + PGL
-.2833*
.07986
.002
-.4478
-.1189
Benzopyrene + MD
-.2333*
.07986
.007
-.3978
-.0689
Kontrol Negatif
-.0333
.07986
.680
-.1978
.1311
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Benzopyrene + EA
-.1833*
.07986
.030
-.3478
-.0189
Benzopyrene + PGL
-.3167*
.07986
.001
-.4811
-.1522
*
-.2667
.07986
.003
-.4311
-.1022
Kontrol Negatif
.1500
.07986
.072
-.0145
.3145
Kontrol Positif
.1833*
.07986
.030
.0189
.3478
Benzopyrene + PGL
-.1333
.07986
.107
-.2978
.0311
Benzopyrene + MD
-.0833
.07986
.307
-.2478
.0811
Kontrol Negatif
.2833*
.07986
.002
.1189
.4478
Kontrol Positif
.3167*
.07986
.001
.1522
.4811
Benzopyrene + EA
.1333
.07986
.107
-.0311
.2978
Benzopyrene + MD
.0500
.07986
.537
-.1145
.2145
Kontrol Negatif
.2333*
.07986
.007
.0689
.3978
Kontrol Positif
*
.2667
.07986
.003
.1022
.4311
Benzopyrene + EA
.0833
.07986
.307
-.0811
.2478
-.0500
.07986
.537
-.2145
.1145
Benzopyrene + MD
Benzopyrene +
EA
Benzopyrene +
PGL
Benzopyrene +
MD
Benzopyrene + PGL
Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = ,019.
*. The mean difference is significant at the ,05 level.
T-Test
Group Statistics
Kelompok
BCl2
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Kontrol Negatif
6
.0000
.00000
.00000
Kontrol Positif
6
.3667
.10328
.04216
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
BCl2 Equal variances
assumed
Sig.
10.652
t
Sig. (2tailed)
df
Mean
Difference
Std. Error
Difference
Lower
Upper
.009 -8.696
10
.000
-.36667
.04216
-.46061
-.27272
-8.696
5.000
.000
-.36667
.04216
-.47505
-.25828
Equal variances
not assumed
T-Test
Group Statistics
Kelompok
BCl2
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Kontrol Negatif
6
.0000
.00000
.00000
Benzopyrene + EA
6
.0833
.07528
.03073
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
Disertasi
Sig.
t
df
Sig. (2tailed)
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
BCl2 Equal variances
assumed
9.434
.012 -2.712
10
.022
-.08333
.03073
-.15181
-.01486
-2.712
5.000
.042
-.08333
.03073
-.16233
-.00433
Equal variances
not assumed
T-Test
Group Statistics
Kelompok
BCl2
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Kontrol Negatif
6
.0000
.00000
.00000
Benzopyrene + PGL
6
.0167
.04082
.01667
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
BCl2 Equal variances
assumed
Sig.
6.250
t
Sig. (2tailed)
df
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
.031 -1.000
10
.341
-.01667
.01667
-.05380
.02047
-1.000
5.000
.363
-.01667
.01667
-.05951
.02618
Equal variances
not assumed
T-Test
Warnings
The Independent Samples table is not produced.
Group Statistics
Kelompok
BCl2
N
Mean
Kontrol Negatif
6
Benzopyrene + MD
Std. Deviation
.0000
6
Std. Error Mean
a
.00000
a
.00000
.00000
.0000
.00000
a. t cannot be computed because the standard deviations of both groups are 0.
T-Test
Group Statistics
Kelompok
BCl2
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Kontrol Positif
6
.3667
.10328
.04216
Benzopyrene + EA
6
.0833
.07528
.03073
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
BCl2 Equal variances
assumed
Equal variances
not assumed
Disertasi
Sig.
.552
.475
t
Sig. (2tailed)
df
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
5.430
10
.000
.28333
.05217
.16708
.39959
5.430
9.143
.000
.28333
.05217
.16559
.40108
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
T-Test
Group Statistics
Kelompok
BCl2
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Kontrol Positif
6
.3667
.10328
.04216
Benzopyrene + PGL
6
.0167
.04082
.01667
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
BCl2 Equal variances
assumed
Sig.
3.616
t
.086
Equal variances
not assumed
Sig. (2tailed)
df
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
7.720
10
.000
.35000
.04534
.24898
.45102
7.720
6.525
.000
.35000
.04534
.24119
.45881
T-Test
Group Statistics
Kelompok
BCl2
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Kontrol Positif
6
.3667
.10328
.04216
Benzopyrene + MD
6
.0000
.00000
.00000
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
BCl2 Equal variances
assumed
Sig.
10.652
t
.009
Equal variances
not assumed
Sig. (2tailed)
df
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
8.696
10
.000
.36667
.04216
.27272
.46061
8.696
5.000
.000
.36667
.04216
.25828
.47505
T-Test
Group Statistics
Kelompok
BCl2
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Benzopyrene + EA
6
.0833
.07528
.03073
Benzopyrene + PGL
6
.0167
.04082
.01667
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
Disertasi
Sig.
t
df
Sig. (2tailed)
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
BCl2 Equal variances
assumed
1.712
.220
Equal variances
not assumed
1.907
10
.086
.06667
.03496
-.01123
.14456
1.907
7.707
.094
.06667
.03496
-.01449
.14782
T-Test
Group Statistics
Kelompok
BCl2
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Benzopyrene + EA
6
.0833
.07528
.03073
Benzopyrene + MD
6
.0000
.00000
.00000
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
BCl2 Equal variances
assumed
Sig.
9.434
t
.012
Equal variances
not assumed
Sig. (2tailed)
df
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
2.712
10
.022
.08333
.03073
.01486
.15181
2.712
5.000
.042
.08333
.03073
.00433
.16233
T-Test
Group Statistics
Kelompok
BCl2
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Benzopyrene + PGL
6
.0167
.04082
.01667
Benzopyrene + MD
6
.0000
.00000
.00000
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
BCl2 Equal variances
assumed
Sig.
6.250
t
.031
Equal variances
not assumed
Sig. (2tailed)
df
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
1.000
10
.341
.01667
.01667
-.02047
.05380
1.000
5.000
.363
.01667
.01667
-.02618
.05951
T-Test
Group Statistics
Kelompok
Apoptosis
Disertasi
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Kontrol Negatif
6
.0833
.13292
.05426
Kontrol Positif
6
.0500
.05477
.02236
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
Apoptosis Equal variances
assumed
Sig.
7.857
t
.019
Equal variances
not assumed
Sig. (2tailed)
df
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
.568
10
.583
.03333
.05869
-.09743
.16410
.568
6.651
.589
.03333
.05869
-.10694
.17360
T-Test
Group Statistics
Kelompok
Apoptosis
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Kontrol Negatif
6
.0833
.13292
.05426
Benzopyrene + EA
6
.2333
.08165
.03333
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
Apoptosis Equal variances
assumed
Sig.
2.832
t
Sig. (2tailed)
df
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
.123 -2.355
10
.040
-.15000
.06368
-.29190
-.00810
-2.355
8.303
.045
-.15000
.06368
-.29593
-.00407
Equal variances
not assumed
T-Test
Group Statistics
Kelompok
Apoptosis
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Kontrol Negatif
6
.0833
.13292
.05426
Benzopyrene + PGL
6
.3667
.19664
.08028
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
Apoptosis Equal variances
assumed
Equal variances
not assumed
Disertasi
Sig.
.950
t
Sig. (2tailed)
df
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
.353 -2.924
10
.015
-.28333
.09690
-.49923
-.06743
-2.924
8.780
.017
-.28333
.09690
-.50337
-.06330
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
T-Test
Group Statistics
Kelompok
Apoptosis
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Kontrol Negatif
6
.0833
.13292
.05426
Benzopyrene + MD
6
.3167
.17224
.07032
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
Apoptosis Equal variances
assumed
Sig.
1.644
t
Sig. (2tailed)
df
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
.229 -2.627
10
.025
-.23333
.08882
-.43124
-.03543
-2.627
9.396
.027
-.23333
.08882
-.43297
-.03369
Equal variances
not assumed
T-Test
Group Statistics
Kelompok
Apoptosis
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Kontrol Positif
6
.0500
.05477
.02236
Benzopyrene + EA
6
.2333
.08165
.03333
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
Apoptosis Equal variances
assumed
Sig.
1.250
t
Sig. (2tailed)
df
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
.290 -4.568
10
.001
-.18333
.04014
-.27277
-.09390
-4.568
8.742
.001
-.18333
.04014
-.27454
-.09212
Equal variances
not assumed
T-Test
Group Statistics
Kelompok
Apoptosis
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Kontrol Positif
6
.0500
.05477
.02236
Benzopyrene + PGL
6
.3667
.19664
.08028
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
Disertasi
Sig.
t
df
Sig. (2tailed)
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Apoptosis Equal variances
assumed
6.942
.025 -3.800
10
.003
-.31667
.08333
-.50234
-.13099
-3.800
5.771
.010
-.31667
.08333
-.52255
-.11078
Equal variances
not assumed
T-Test
Group Statistics
Kelompok
Apoptosis
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Kontrol Positif
6
.0500
.05477
.02236
Benzopyrene + MD
6
.3167
.17224
.07032
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
Apoptosis Equal variances
assumed
Sig.
22.500
t
Sig. (2tailed)
df
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
.001 -3.614
10
.005
-.26667
.07379
-.43107
-.10226
-3.614
6.001
.011
-.26667
.07379
-.44721
-.08612
Equal variances
not assumed
T-Test
Group Statistics
Kelompok
Apoptosis
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Benzopyrene + EA
6
.2333
.08165
.03333
Benzopyrene + PGL
6
.3667
.19664
.08028
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
Apoptosis Equal variances
assumed
Sig.
4.324
t
Sig. (2tailed)
df
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
.064 -1.534
10
.156
-.13333
.08692
-.32701
.06034
-1.534
6.674
.171
-.13333
.08692
-.34092
.07426
Equal variances
not assumed
T-Test
Group Statistics
Kelompok
Apoptosis
Disertasi
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Benzopyrene + EA
6
.2333
.08165
.03333
Benzopyrene + MD
6
.3167
.17224
.07032
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
Apoptosis Equal variances
assumed
Sig.
10.417
t
Sig. (2tailed)
df
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
.009 -1.071
10
.309
-.08333
.07782
-.25672
.09005
-1.071
7.139
.319
-.08333
.07782
-.26662
.09995
Equal variances
not assumed
T-Test
Group Statistics
Kelompok
Apoptosis
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Benzopyrene + PGL
6
.3667
.19664
.08028
Benzopyrene + MD
6
.3167
.17224
.07032
Independent Samples Test
Levene's Test for
Equality of Variances
t-test for Equality of Means
95% Confidence
Interval of the
Difference
F
Apoptosis Equal variances
assumed
Sig.
.015
t
.905
Equal variances
not assumed
Sig. (2tailed)
df
Mean
Std. Error
Difference Difference
Lower
Upper
.469
10
.649
.05000
.10672
-.18778
.28778
.469
9.829
.650
.05000
.10672
-.18834
.28834
Correlations
Correlations
BCl2
BCl2
Pearson Correlation
VEGF
VEGF
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
-.383
-.359
.001
.037
.051
30
30
30
30
**
1
-.284
-.280
.128
.134
1
P53
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
Apoptosis
Pearson Correlation
Sig. (2-tailed)
N
.560
.560
.001
N
Apoptosis
*
Sig. (2-tailed)
N
P53
**
30
30
30
30
*
-.383
-.284
1
.372
.037
.128
*
.043
30
30
30
30
-.359
-.280
.372
*
1
.051
.134
.043
30
30
30
30
**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).
*. Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed).
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Curve Fit
Model Description
Dependent Variable
Equation
Model Name
MOD_2
1
1
Independent Variable
Apoptosis
Linear
BCl2
Constant
Included
Variable Whose Values Label Unspecified
Observations in Plots
Case Processing Summary
N
Total Cases
a
Excluded Cases
Forecasted Cases
Newly Created Cases
30
0
0
0
a. Cases with a missing value in any variable are
excluded from the analysis.
Variable Processing Summary
Variables
Dependent
Independent
Apoptosis
BCl2
Number of Positive Values
Number of Missing Values
23
11
Number of Zeros
7
19
Number of Negative Values
User-Missing
0
0
0
0
System-Missing
0
0
Model Summary and Parameter Estimates
Dependent Variable:Apoptosis
Model Summary
Equation
R Square
Linear
.129
F
df1
4.149
Parameter Estimates
df2
1
Sig.
28
Constant
.051
.250
b1
-.424
The independent variable is BCl2.
Regression
b
Variables Entered/Removed
Variables
Entered
Model
1
Variables
Removed
a
P53
Method
. Enter
a. All requested variables entered.
b. Dependent Variable: Apoptosis
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Model Summary
Model
R
a
1
Adjusted R
Square
R Square
.372
.138
Std. Error of the
Estimate
.108
.17070
a. Predictors: (Constant), P53
b
ANOVA
Model
1
Sum of Squares
df
Mean Square
Regression
.131
1
.131
Residual
.816
28
.029
Total
.947
29
F
Sig.
4.501
a
.043
a. Predictors: (Constant), P53
b. Dependent Variable: Apoptosis
a
Coefficients
Standardized
Coefficients
Unstandardized Coefficients
Model
1
B
Std. Error
Beta
(Constant)
.112
.056
P53
.297
.140
t
.372
Sig.
2.006
.055
2.121
.043
a. Dependent Variable: Apoptosis
Regression
b
Variables Entered/Removed
Model
1
2
Variables
Entered
Variables
Removed
a
P53, Apoptosis
Method
. Enter
Backward (criterion:
Probability of F-to-remove >=
,100).
. Apoptosis
a. All requested variables entered.
b. Dependent Variable: BCl2
Model Summary
Model
R
a
1
2
Adjusted R
Square
R Square
.448
b
.383
.201
.147
Std. Error of the
Estimate
.142
.116
.14171
.14383
a. Predictors: (Constant), P53, Apoptosis
b. Predictors: (Constant), P53
c
ANOVA
Model
1
2
Disertasi
Sum of Squares
df
Mean Square
Regression
.136
2
.068
Residual
.542
27
.020
Total
.679
29
Regression
.099
1
.099
Residual
.579
28
.021
F
Sig.
a
3.398
.048
4.806
.037
b
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Total
.679
29
a. Predictors: (Constant), P53, Apoptosis
b. Predictors: (Constant), P53
c. Dependent Variable: BCl2
a
Coefficients
Standardized
Coefficients
Unstandardized Coefficients
Model
1
2
B
Std. Error
Beta
(Constant)
.203
.050
Apoptosis
-.213
.157
P53
-.196
.125
.179
.047
-.259
.118
(Constant)
P53
t
Sig.
4.092
.000
-.252
-1.358
.186
-.289
-1.560
.130
3.804
.001
-2.192
.037
-.383
a. Dependent Variable: BCl2
b
Excluded Variables
Collinearity
Statistics
Model
2
Beta In
t
a
Apoptosis
-.252
Partial
Correlation
Sig.
-1.358
.186
-.253
Tolerance
.862
a. Predictors in the Model: (Constant), P53
b. Dependent Variable: BCl2
Regression
b
Variables Entered/Removed
Model
1
Variables
Entered
Variables
Removed
P53, Apoptosis,
a
BCl2
Method
. Enter
2
. P53
3
. Apoptosis
Backward (criterion: Probability
of F-to-remove >= ,100).
Backward (criterion: Probability
of F-to-remove >= ,100).
a. All requested variables entered.
b. Dependent Variable: VEGF
Model Summary
Model
1
2
3
R
Adjusted R
Square
R Square
a
.569
b
.566
c
.560
.323
.320
.313
.245
.270
.289
Std. Error of the
Estimate
.10960
.10779
.10640
a. Predictors: (Constant), P53, Apoptosis, BCl2
b. Predictors: (Constant), Apoptosis, BCl2
c. Predictors: (Constant), BCl2
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
d
ANOVA
Model
1
2
3
Sum of Squares
df
Mean Square
Regression
.149
3
.050
Residual
.312
26
.012
Total
.462
29
Regression
.148
2
.074
Residual
.314
27
.012
Total
.462
29
Regression
.145
1
.145
Residual
.317
28
.011
Total
.462
29
F
Sig.
a
4.143
.016
6.366
.005
12.778
.001
b
c
a. Predictors: (Constant), P53, Apoptosis, BCl2
b. Predictors: (Constant), Apoptosis, BCl2
c. Predictors: (Constant), BCl2
d. Dependent Variable: VEGF
a
Coefficients
Standardized
Coefficients
Unstandardized Coefficients
Model
1
2
B
Std. Error
.200
.049
BCl2
.420
.149
Apoptosis
-.052
P53
t
Sig.
4.094
.000
.510
2.825
.009
.125
-.074
-.411
.685
-.034
.101
-.061
.189
.038
(Constant)
BCl2
3
Beta
(Constant)
-.339
.738
5.034
.000
.435
.140
.527
3.102
.004
Apoptosis
-.063
.119
-.090
-.532
.599
(Constant)
.174
.023
7.592
.000
BCl2
.462
.129
3.575
.001
.560
a. Dependent Variable: VEGF
c
Excluded Variables
Collinearity
Statistics
Model
2
3
Beta In
P53
P53
Apoptosis
t
Sig.
Partial
Correlation
Tolerance
a
-.339
.738
-.066
.790
b
-.475
.638
-.091
.853
b
-.532
.599
-.102
.871
-.061
-.082
-.090
a. Predictors in the Model: (Constant), Apoptosis, BCl2
b. Predictors in the Model: (Constant), BCl2
c. Dependent Variable: VEGF
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Lampiran 4
Prosedur Pemeriksaan Imunohistokimia
Pada akhir minggu ke 9 mencit dikorbankan dengan cara dislocasio cervikal, kemudian
dikubur. Spesimen dari biopsi difiksasi dengan baik menggunakan buffer formalin
selanjutnya dilakukan dehidrasi dan blok parafin menggunakan metoda baku. Selanjutnya
disiapkan kaca obyek yang telah dilapisi poli L-lisin, pemotongaman blok paraffin
menggunakan mikrotom dengan ketebalan 5μ, potongan jaringan ditebarkan/diapungkan pada
permukaan bak pemanas berisi air hangat, selanjutnya jaringan yang telah menempel pada
slide dilakukan deparafinisasi dan sedian siap untuk dilakukan pewarnaan imunohistokimia.
Prosesing jaringan melalui beberapa tahap yaitu; dehydrasi, clearing, impregnasi, embedding.
Teknik pewarnaan imunohistokimia yang digunakan adalah teknik biotin streptavidin dengan
langkah-langkah sebagai berikut :
Prosedur pemeriksaan Bcl-2, VEGF, p53 dengan imunohistokimia
Persiapan reagen :
Tahap fiksasi
H2O2 : 3%
Trypsin 0, 025% dalam PBS
Larutan kerja DAB :
R/.Aquadestilata : 1ml
Tetes buffer subsrat : 1 tetes
Cara pewarnaan :
Deparaffinisasi, caranya adalah dengan memasukkan sayatan jaringan berturut- turut ke
dalam :
1. Xylol, selama 2 menit, sebanyak 2 kali
2. Kemudian dimasukkan kedalam etanol absolut : 1 menit, sebanyak 2 kali
3. Selanjutnya dimasukkan ke dalam etanol 95 % 1 menit ,sebanyak 2 kali
4. Setelah dimasukkan ke dalametanol 95% , kemudian dimasukkan ke dalam etanol 80 %
selama 1 menit.
5. Dimasukkan lagi ke dalam etanol 70 % selama 1 menit
Tahap pencucian
1. Dicuci pada air mengalir selama 10 -15 menit
2. Setelah itu dimasukkan ke dalam larutan H202 3 % : selama 30 menit
3. Dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali (a : 2 menit )
4. Setelah itu dimasukkan ke dalam etanol 70% selama 1 menit.
5. Dicuci pada air mengalir , selama 10-15 menit
6. Dimasukkan ke dalm larutan H2O2 3% : 30 menit
7. Dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali (a : 2 menit)
8. Dimasukkan ke dalam larutan Tripsin 0, 025% selama 6 menit pada 37o C
9. Dicuci dengan PBS sebanyak3 kali (a : 2 menit)
10. Dimasukkan ke dalam anti p53, Bcl-2, VEGF (mouse anti rat 1: 50) : 30 menit
11. Dicuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Tahap pelebelan
1. Dimasukkan kedalam sekunder antibody (rabbit anti mouse biotinilated antibody Label)
: 30 menit
2. Dicuci dengan PBS 3 kali (a : 2 menit)
3. Dimasukkan ke dalam streptavidin HRP label :selama30 menit
4. Dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali (a : 2 menit)
5. Dimasukkan ke dalam substrat kromogen :selama5 menit
6. Dicuci dengan PBS 3 kali (a :2 menit), kemudian dibilas dengan aquadestilata
7. Dimasukkan ke dalam Mayer Hematoxylin : 6 menit
8. Dicuci dengan air mengalir
9. Proses mounting
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Lampiran 5
TEHNIK PEMERIKSAAN TUNNEL ASSAY
Prosedure pemeriksaan sel apoptosis dengan apoptag (Tunnel Assay).
Persiapan reagen :
H2O2 : 3%
Proteinase K 60 ug /ml
Larutan kerja DAB :
R/Aquadestilata : 1 ml
Tetes buffer substrat : 1 tetes
Cara pewarnaan :
Deparaffinisasi, caranya adalah dengan memasukkan sayatan jaringan berturut-turut :
1. Sayatan dimasukkan ke dalam xylol selama 2 menit, sebanyak 2 kali
2. Kemudian dimasukkan kedalam etanol absolut sebanyak 1 menit, selama 2 kali.
3. Dimasukkan ke dalam etanol selama 95% selama 1 menit, sebanyak 2 kali
4. Setelah itu dimasukkan kedalam etanol 80% selama 1 menit
5. Dimasukkan lagi ke dalam etanol 70% selama 1 menit
6. Dicuci pada air mengalir selama 10-15 menit
7. Dibilas dengan PBS sebanyak 3 kali (a : 2 menit)
8. Dimasukkan ke dalam proteinase K selama 15 menit
9. Dicuci dengan d H2O 2 sebanyak kali (2 menit)
10. Dimasukkan ke dalam 3% H2O2 selama 15menit
11. Dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali (a : 2 menit)
12. Dimasukkan ke dalam equilibrium buffer : 10 menit pada suhu kamar
13. Dimasukkan pada working strength TDT enzyme yang dilengkapi digoxygenin 37°C : 1
jam
14. Dimasukkan pada stop buffer selama15 menit
15. Dicuci dengan PBS sebanyak3 kali (a: 2 menit)
16. Dimasukkan pada anti digoxigenin peroxidase conjugate : 30 menit
17. Dicuci dengan PBS sebanyak3 kali (a : 2 menit)
18. Dimasukkan pada peroxidase substrat selama :10 menit
19. Dicuci dengan d H 2 O sebanyak 3 kali (a : 1 menit)
20. Dimasukkan pada Mayer Haematoxylin selama : 6 menit
24. Dicuci dengan d H 2 O
25. Proses mounting
Disertasi
MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA ...
SRI HERNAWATI