BAB III METODE PENELITIAN 3.1. Waktu dan

BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian
Pelaksanaan penelitian ini dimulai pada bulan Juni tahun 2014 hingga bulan
Februari tahun 2015. Penelitian di lakukan di Laboratorium Kimia Dasar dan
Analitik Jurusan Pendidikan Kimia Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Pendidikan Indonesia. Untuk tahapan sekuensing
dilakukan di 1st BASE inc. Singapura.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pipet mikro, tabung
eppendorf, sentrifuge, set alat PCR, autoklaf, set alat elektroforesis, dan lampu
UV.
3.2.2
Bahan
Bahan yang digunakan dalam tahap lisis yaitu buffer lisis (500 mM Tris-
HCl pH 8,5, 10 mM EDTA pH 8, dan 5% Tween – 20), enzim proteinase K
10mg/mL, dan ddH2O. Bahan-bahan yang digunakan dalam proses PCR adalah
primer HV2R 20pmol/µL, primer HV2F 20pmol/µL, buffer PCR 10x (500 mM
KCl, 100 mM Tris-HCl pH 9,0 pada suhu 25°C, 1% triton X-100, 15 mM MgCl2),
enzim Taq DNA Polimerase 5unit/µL, dan campuran dNTP 10 mM. Bahan-bahan
yang digunakan pada elektroforesis gel agarosa yaitu agarosa, buffer TAE 1x
(Tris-asetat 0,05 M dan EDTA 0,001 M pH 8), larutan EtBr 10µg/mL, loading
buffer (sukrosa 50%, EDTA 0,1 M pH 8, bromfenol biru 0,1% pH 8), dan marker
pUC19/HinfI 60 µg/µL.
3.3 Metode Penelitian
Dalam penelitian ini dilakukan 6 tahap utama yang meliputi tahap
pengumpulan sampel, lisis terhadap sampel mtDNA, amplifikasi fragmen mtDNA
pada daerah D-loop mtDNA manusia dengan teknik PCR, pendeteksian produk
Idris Maliki, 2015
IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA
EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
18
PCR dengan elektroforesis gel agarosa, sekuensing urutan nukleotida daerah HV2
manusia dengan metode dideoksi sanger, dan analisis urutan nukleotida hasil
sekuensing dengan menggunakan program SeqMan ver 4.00 DNASTAR. Secara
keseluruhan penelitian dapat digambarkan seperti bagan alir pada Gambar 3.1.
Gambar 3.1. Bagan Alir Penelitian
3.3.1. Pengumpulan Sampel
Sampel yang digunakan adalah akar rambut dari empat generasi dengan
riwayat diabetes melitus tipe 2. Pengambilan sampel akar rambut dengan cara
mencabut rambut sampai akarnya, sehingga didapatkan akar rambut yang
selanjutnya digunakan pada tahap lisis dan ekstraksi mtDNA dari akar rambut
tersebut.
Idris Maliki, 2015
IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA
EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
19
3.3.2. Isolasi mtDNA
Sampel akar rambut diisolasi secara enzimatik. Tahap awal sampel rambut
sebanyak 5-7 helai dipotong ±1 cm dari bagian pangkal akarnya dan dimasukan
ke dalam tabung eppendorf ukuran 1500µL yang telah disterilisasi menggunakan
autoklaf.
Kemudian
ditambahkan
ddH2O
sebanyak
170µL.
Selanjutnya
ditambahkan 20 µL buffer lisis (500 mM Tris-HCl pH 8,5, 10 mM EDTA pH 8,
dan 5% Tween-20), dan 10µL enzim proteinase K 10mg/mL hingga volume lisis
tepat 200 µL. Kemudian tabung eppendorf yang berisis campuran reaksi
dibungkus dengan parafilm dan diinkubasi selama 1 jam pada waterbath pada
suhu ±55C°. Setelah itu dilakukan proses deaktifasi enzim proteinase K pada suhu
±95C° selama 10 menit. Kemudian campuran reaksi disentrifugasi selama 3 menit
dengan kecepatan 14.000 rpm. Setelah proses sentrifugasi supernatan diambil
sebanyak 150 µL untuk selanjutnya digunakan sebagai templat pada proses PCR.
3.3.3. Amplifikasi Fragmen mtDNA Manusia secara In Vitro dengan Teknik
PCR
Proses amplifikasi fragmen daerah HV2 mtDNA manusia dilakukan
dengan menggunakan primer HV2R dan HV2F. Campuran reaksi PCR dimasukan
kedalam tabung eppendorf 200µL, terdiri dari 5 µL templat mtDNA hasil lisis; 0,5
µL primer HV2F (20 pmol/µL); 0,5 µL primer HV2R (20 pmol/µL); 2,5 µL
Buffer PCR 10x (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH 9,0 pada suhu 25°C, 1%
triton X-100, 15 mM MgCl2); 0,2 µL enzim taq DNA polimerase (5 unit/µL); 0,5
µL campuran dNTP 10 mM; dan 15,8 µL ddH20 sehingga volumenya mencapai
25 µL. Urutan nukleotida, ukuran, posisi dan suhu penempelan primer HV2F dan
HV2R ditunjukan pada Tabel 3.1.
Tabel 3.1. Urutan Nukleotida Primer HV2F dan HV2R
Primer
Urutan 5’ ke 3’
Posisi
Ukuran
Suhu
Penempelan
HV2F
GGT CTA TCA CCC
TAT TAA CCA C
L 8-29
22
Nukleotida
52,2°C
Idris Maliki, 2015
IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA
EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
20
CTG TTA AAA GTG
CAT ACC GCC
HV2R
H 429 - 409
21
Nukleotida
54,4°C
Proses PCR dilakukan dengan mesin GeneAmp® PCR System 2700
sebanyak 35 siklus. Tahap pertama dari proses PCR adalah tahap denaturasi awal
yang dilakukan pada suhu 90°C selama 5 menit, kemudian dilanjutkan dengan
siklus PCR yang terdiri dari 3 tahap yaitu tahap denaturasi yang dilakukan pada
suhu 94°C selama 1 menit, tahap annealing yang dilakukan pada suhu 50°C
selama 1 menit, dan tahap polimerisasi yang dilakukan pada suhu 72°C selama 4
menit. mtDNA hasil PCR kemudian disimpan pada suhu -20°C.
3.3.4. Analisis Hasil PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa
Hasil amplifikasi mtDNA dari proses PCR yang telah dilakukan
sebelumnya kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v)
menggunakan set alat elektroforesis sederhana. Komposisi gel agarosa dibuat
dengan melarutkan 0,4 gram agarosa dalam 15 mL buffer TAE 1x. Larutan
tersebut kemudian dipanaskan hingga semua agarosa larut sempurna, lalu
didinginkan hingga suhu larutan mencapai ±60°C. Pada masing-masing sumur gel
dimasukan 5 µL loading buffer (sukrosa 50%; EDTA 0,1 M pH 8; bromfenol biru
0,1 pH 8).
Proses elektroforesis dilakukan dalam buffer TAE 1 sebagai media
penghantar arus pada tegangan 100 volt selama 45 menit. Marker yang digunakan
adalah pUC19/HinfI. Setelah proses elektroforesis selesai, hasil elektroforesis
divisualisasikan dengan sinar UV dan difoto dengan kamera digital. Penentuan
konsentrasi mtDNA dapat dilakukan dengan cara membandingkan intensitas pita
sampel terhadap pita-pita dari marker yang telah diketahui konsentrasinya.
3.3.5. Penentuan Urutan Nukleotida Daerah HV2 mtDNA Manusia dengan
Sekuensing Metode Dideoksi Sanger
Sekuensing DNA adalah tahapan terakhir dalam penentuan urutan
nukleotida fragmen hasil amplifikasi dengan teknik PCR. Sekuensing dilakukan
oleh 1st BASE inc. Singapore berdasarkan prinsip sekuensing metode Dideoksi
Idris Maliki, 2015
IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA
EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
21
Sanger menggunakan Automatic DNA Sequencer dengan primer HV2F (5’GGTCTATCACCCTATTAACCAC-3’).
3.3.6. Analisis Urutan Nukleotida Daerah HV2 mtDNA Manusia
Urutan nukleotida pada daerah HV2 mtNDA manusia hasil sekuensing
dianalisis dengan menggunakan SeqMan™ versi 4.00 DNASTAR. Proses
analisisnya dilakukan dengan cara memasukan urutan nukleotida sampel dan
urutan DNA standar. Dalam elektroforegram, setiap jenis basa nukleotida
menunjukan warna dan tinggi puncak yang berbeda. Basa adenin (A) berwarna
hijau, basa guanin (G) berwarna hitam, basa sitosin (C) berwarna biru, dan basa
timin (T) berwarna merah. Urutan DNA standar yang digunakan adalah urutan
dari revised Cambridge Reference Sequence (rCRS) yang telah direvisi (Andrew
et al., 1999) program akan secara otomatis menandai basa pada posisi tertentu
yang memiliki basa berbeda dengan basa pada standar rCRS. Setelah
dibandingkan dengan urutan standar, urutan nukleotida sampel kemudian
dibandingkan dengan data sekunder.
Idris Maliki, 2015
IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA
EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu