77 Kualitas, Ekspresi HSP 70 dan Kerusakan DNA

Veterina Medika
Vol.10, No.1, Pebruari 2017
Kualitas, Ekspresi HSP 70 dan Kerusakan DNA Spermatozoa Post Thawing Sapi
Limosin Pasca Pendinginan pada Suhu 5°C
Semen Quality, HSP 70 Expression and DNA Damage of Post Thawing Limousine
Bull Spermatozoa After Cooled At 5 °C
Anny Amaliya1, Suzanita Utama2, Hardijanto2
Mahasiswa S2 Ilmu Biologi Reproduksi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas
Airlangga
2
Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga
1
Kampus C Unair, Mulyorejo Surabaya 60115
Tlp. 031-5992785 fax. 0315993015
e-mail : [email protected]
Abstract
Good quality frozen semen is one of the factors that contribute to successful
artificial insemination. To get high fertility, spermatozoa should be added with extender
and cooled at 5°C for some time after collection. This study was aimed to know sperm
quality variables including motility, viability, abnormality, and plasma membrane
integrity as well as the expression of HSP 70 and the DNA damage of frozen semen after
cooling at 5°C for 4 hours and 22 hours one limousine bull. Semen was collected from
one Limosin bull twice a w week using artificial vagina. Following colection, semen
were evaluated macroscopicly and microscopically including viability, abnormality and
plasma membrane integrity. Semen then cooled at 5°C for 4 and 22 hours. Before freezing,
semen was cooled at 5°C for 4 and 22 hours. Motility, viability, abnormality, plasma
membrane integrity, expression of HSP 70 and DNA damage were evaluated before and
after freezing. In before freezing evaluation showed significant difference (p<0,05) on
motility beetween cooling at 5°C for 4 and 22 hours (55.6 ± 1.8 and 58,8 ± 2.3 %
respectively), but there was no diference on viability, abnormality and plasma membrane
integrity, HSP 70 expression and DNA damage. Meanwhile, in post thawing no diference
was found on motility, viability, abnormality, plasma membrane integrity, expression of
HSP 70 and DNA damage
Keywords: cooling at 5°C, HSP 70 , DNA damage
Pendahuluan
IB merupakan teknik perkawinan
dengan cara memasukkan atau deposisi
semen ke dalam saluran kelamin betina
menggunakan alat buatan manusia. IB
bertujuan untuk meningkatkan mutu
genetik ternak, mengurangi resiko
penyebaran penyakit terutama penyakit
reproduksi, meningkatkan populasi
dan produksi ternak. Keberhasilan
IB dipengaruhi oleh banyak faktor
diantaranya kualitas semen beku
77
Anny Amaliya, Suzanita Utama, Hardijanto. Kualitas, Ekspresi HSP 70 dan Kerusakan DNA....
yang digunakan. Kualitas semen beku
dipengaruhi oleh kualitas semen segar,
pengencer, waktu equilibrasi, teknik
pembekuan dan penanganannya (Hafez,
2008).
Dalam proses pembekuan, 20–80%
spermatozoa dapat mengalami kematian.
Proses cooling, freezing, dan thawing
dapat menimbulkan stress fisik dan kimia
pada membran spermatozoa yang dapat
menurunkan viabilitas dan kemampuan
fertilitasnya (Chatterjee et al., 2001).
Gadea et al., (2000) melaporkan ada
proses penting selama proses pembekuan
yaitu produksi reactive oxygen species
(ROS) yang dapat mengubah fungsi dan
struktur membran spermatozoa. Radikal
bebas atau reactive oxygen species
(ROS) dalam jumlah normal penting
untuk fungsi biologis, namun ROS tidak
memiliki target organ spesifik, sehingga
dapat menyerang asam lemak tak jenuh
ganda dari membran dan organel sel serta
DNA yang dapat menyebabkan rusaknya
struktur dan fungsi sel (Winarsi, 2007).
Pada spermatozoa produksi ROS yang
berlebih akan menyebabkan kerusakan
asam lemak yang merupakan penyusun
membran spermatozoa, inaktivasi enzim
glikolitik, putusnya rantai DNA yang
dapat menyebabkan turunnya motilitas
dan menyebabkan apoptosis spermatozoa
(Halliwell dan Whiteman, 2004).
Untuk
mendapatkan
fertilitas
yang tinggi maka spermatozoa harus
didinginkan untuk beberapa lama sesudah
dicampur dengan bahan pengencer. Suhu
optimum untuk pendinginan semen
adalah 5°C . Saat ini dikenal dua metode
untuk proses pembuatan semen beku
yakni metode satu hari proses dan metode
dua hari proses. Pada metode satu hari
proses semen yang telah ditambahkan
pengencer didinginkan pada suhu 5°C
selama 4 jam, sedangkan pada metode
dua hari semen yang telah ditambahkan
pengencer didinginkan pada suhu 5°C
selama 18 – 22 jam. Terdapat dugaan dari
inseminator bahwa kualitas semen beku
78
yang dihasilkan dari metode satu hari
proses lebih baik dibandingkan dengan
metode dua hari proses.
Berdasarkan hal tersebut, akan
dilakukan penelitian mengenai kualitas,
ekspresi HSP 70 dan kerusakan DNA
spermatozoa sapi limosin post thawing
menggunakan pengencer tris dengan
rentang waktu pendinginan berbeda pada
suhu 5°C.
Materi dan Metode Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium
Produksi Semen Beku Balai Besar
Inseminasi Buatan Singosari. Penelitian
dilaksanakan
Bulan
Oktober
–
Desember 2015. Sampel penelitian ini
menggunakan pejantan sapi Limosin
Caillin dengan umur 8 tahun. Dilakukan
8 kali pengambilan semen segar (n=8).
Pembuatan preparat imunositokimia
dilakukan di laboratorium Biomolekuler
Universitas Brawijaya Malang.
Penampungan, Pengujian dan
Pengolahan Semen
Penampungan semen dilakukan dua
kali dalam satu minggu menggunakan
vagina buatan. Selanjutnya dilakukan
pengujian makroskopis dan mikroskopis
semen segar. Pengujian makroskopis
meliputi volume, warna, konsistensi dan
pH. Pengujian mikroskopis meliputi
gerak massa, gerak individu, konsentrasi,
viabilitas, abnormalitas, dan membran
plasma utuh.
Pengujian Kualitas Semen Segar
Motilitas
Massa
Spermatozoa.
Sebanyak 5 µl semen diteteskan pada
gelas objek yang telah diletakkan di atas
slide warmer bersuhu 37ºC. Kemudian
diamati
menggunakan mikroskop
Olympus BX-53 pembesaran 100 kali.
Penilaian diberikan dengan kisaran 0 +++.
Motilitas Individu Spermatozoa.
Setelah di lakukan pemeriksaan gerak
massa, tutup sampel dengan cover glass
Veterina Medika
Vol.10, No.1, Pebruari 2017
kemudian periksa dengan menggunakan
mikroskop Olympus BX-53pembesaran
200– 400 kalo. Penilaian diberikan
dengan kisaran 0% - 100%.
Viabilitas Spermatozoa. Sebanyak
5 µl semen diteteskan pada gelas
objek tambahkan 25 µl eosin negrosin,
dihomogenkan. Dibuat preparat ulas.
Dikeringkan menggunakan slide warmer.
Preparat diamati dibawah mikroskop
Olympus BX-53 pembesaran 400 kali.
Spermatozoa yang hidup bagian kepalanya
tetap jernih karena tidak menyerap zat
warna. Sedangkan spermatozoa yang
mati bagian kepalanya akan terwarnai.
Pengamatan dilakukan pada 5 lapangan
pandang yang berbeda dengan minimal
spermatozoa yang diamati sebanyak 100
sel. Penghitungan persentase viabilitas
spermatozoa sebagai
berikut :
% Spermatozoa hidup = Jumlah spermatozoa hidup
x 100 %
Jumlah spermatozoa hidup + mati
Abnormalitas
Spermatozoa.
Sebanyak 5 µl semen diteteskan pada
gelas objek tambahkan 25 µl eosin
negrosin, dihomogenkan. Dibuat preparat
ulas. Dikeringkan menggunakan slide
warmer. Preparat diamati dibawah
mikroskop Olympus BX-53 pembesaran
400 kali. Spermatozoa yang abnormal
memiliki bentuk yang abnormal seperti
ekor putus, tidak ada kepala spermatozoa,
ekor menggulung, bentuk kepala yang
tidak sempurna Pengamatan dilakukan
pada 5 lapangan pandang yang berbeda
dengan minimal spermatozoa yang
diamati sebanyak 100 sel. Penghitungan
persentase abnormalitas spermatozoa
sebagai berikut :
% Abnormalitas = Jumlah spermatozoa abnormal
x 100 %
Jumlah spermatozoa normal + abnormal
Membran Plasma Utuh. Pemeriksaan
Membran Plasma Utuh dilakukan
menggunakan uji HOS. Pemeriksaan
dilakukan dengan menambahkan 100 µl
semen ke dalam 1000 µl larutan HOS
yang terdiri dari 0,9 gram D-fuktose,
0.490 gram tri sodium citrate dan 100
ml aquades, kemudian diinkubasi
dalam inkubator suhu 37ºC selama 30
menit. Setelah diinkubasi ambil 1 tetes,
teteskan pada obyek glass kemudian
tutup dengan cover glass , amati di bawah
mikroskop Olympus BX-53 dengan
perbesaran 400x. Membran plasma utuh
ditandai dengan ekor spermatozoa yang
menggembung dan membran yang tidak
utuh ditandai dengan ekor yang lurus.
Pemeriksaan dilakukan pada 5 lapangan
pandang berbeda dengan minimal
spermatozoa yang diamati sebanyak
100 sel. Penghitungan persentase MPU
spermatozoa sebagai berikut :
% MPU = Jumlah spermatozoa yang bereaksi
x 100 %
Jumlah spermatozoa yang bereaksi + tidak bereaksi
Pengujian Kualitas Spermatozoa Before
Freezing
Setelah dilakukan pengujian semen
segar semen yang memenuhi syarat
selanjutnya ditambahkan pengencer A
dan di dinginkan pada suhu 5°C selama
4 dan 22 jam kemudian ditambahkan
dengan pengencer B yang mengandung
glyserol 13%, diequilibrasi dan dilakukan
pengujian before freezing. Pengujian
before freezing meliputi motilitas,
viabilitas, abnormalitas, membran plasma
utuh, Ekspresi HSP 70 dan kerusakan
DNA.
Ekspresi HSP 70. Pemeriksaan
ekspresi HSP 70 dilakukan dengan
pewarnaan imunositokimia dimaksudkan
untuk menghitung jumlah spermatozoa
imunoreaktif posistif terhadap HSP 70.
Data sel imunoreaktif pada pemeriksaan
merupakan data kuantitatif yang diperoleh
dengan cara menghitung jumlah sel
imunoreaktif yang ditemukan pada
setiap 100 sel spermatozoa. Spermatozoa
yang imunoreaktif akan berwarna coklat
kromogen hingga kehitaman, sedangkan
sel immunoreaktif negatif akan berwarna
hijau kebiruan (Fucsh dan Auer, 2010)
Kerusakan DNA. Satu tetes semen
dibuat preparat ulas pada gelas objek,
79
Anny Amaliya, Suzanita Utama, Hardijanto. Kualitas, Ekspresi HSP 70 dan Kerusakan DNA....
dikeringkan diudara dan difiksasi dalam
etanol 96% - aseton (1:1) selama 30 menit
pada suhu 4 oC. Setelah fiksasi, preparat
dikeringkan di udara lalu dihidrolisis
dalam HCl 0,1 N selama 5 menit pada
suhu 4 oC. Preparat dibilas tiga kali
menggunakan aquadest, lalu diwarnai
dengan pewarnaan TB 0,05% dibiarkan
selama 10 menit. Preparat yang telah
diwarnai dicuci kembali dengan aquadest
dan didehidrasi dengan menggunakan
t-butanol dua kali serta dibersihkan
dengan xylol sebanyak dua kali. Preparat
diamati di bawah mikroskop Olympus
BX-53 dengan pembesaran 400x.
Kepala spermatozoa dengan integritas
kromatin yang baik akan berwarna biru
terang, sedangkan spermatozoa dengan
integritas kromatin yang sudah berkurang
akan berwarna biru tua. Pemeriksaan
dilakukan pada 100 spermatozoa untuk
setiap sampel.
Pengujian Kualitas Spermatozoa Post
Thawing.
Pengujian semen beku dilakukan
setelah thawing pada air bersuhu 37ºC
selama 30 detik. Semen kemudian
dimasukkan ke dalam test tube dan
dilakukan pengujian motilitas, viabilitas,
abnormalitas, membran plasma utuh,
ekspresi HSP 70 dan kerusakan DNA.
Prosedur pengujian sama seperti
pengujian pada semen segar dan semen
before freezing.
Analisa Data.
Rancangan
penelitian
yang
digunakan adalah Faktorial. Data yang
diperoleh dianalisa dengan menggunakan
perangkat lunak Statistical Program for
Social Science (SPSS).
80
Hasil dan Pembahasan
Kualitas Semen Segar
Hasil pengujian makroskopis rataan
volume semen sebesar 6,9 ± 0,8 ml (Tabel
1), volume tersebut tergolong normal,
karena menurut Feradis (2010) volume
semen sapi berkisar antara 5 – 8ml. Warna
semen segar pada penelitian ini seperti
air susu (Tabel 1), termasuk normal
sesuai dengan pendapat Aminasari (2009)
bahwa warna semen bervariasi antara
warna air susu, coklat, kuning dan krem.
Rataan tingkat keasaman semen segar
pada penelitian ini 6,4 ± 0,1 (Tabel 1).
Konsistensi spermatozoa yang digunakan
dalam penelitian ini dikatagorikan sedang
(Tabel 1).
Hasil pengujian makroskopis gerakan
massa spermatozoa segar pada penelitian
ini adalah +++ (Tabel 1). Rataan motilitas
semen segar sapi limosin dalam penelitian
ini sekitar 70,6 ± 1,8% (Tabel 1) , nilai
ini masih berada di dalam batas normal.
Susilawati (2011) menyatakan bahwa
motilitas semen segar sapi potong berkisar
antara 70–90%. Viabilitas spermatozoa
segar yang digunakan dalam penelitian
ini sebesar 89 ± 2,8% (Tabel 1). Dalam
penelitian ini diperoleh hasil persentase
abnormalitas morfologi spermatozoa
sapi limosin sekitar 7,2 ± 0,5% (Tabel
1), Susilawati (2011) yang menyatakan
bahwa abnormalitas semen segar sapi di
bawah 20% masih memiliki fertilitas yang
baik. Persentase Membran Plasma Utuh
dalam penelitian ini 77,9 ± 2,6% (Tabel
1). Hasil ini masih dalam batasan normal
seperti yang telah disampaikan oleh
(Rizal dan Herdis, 2005) bahwa semen
yang memenuhi syarat digunakan dalam
program IB harus memiliki persentase
motilitas paling sedikit sebesar 40% dan
nilai persentase MPU semen segar lebih
dari 60%.
Veterina Medika
Vol.10, No.1, Pebruari 2017
Tabel 1 Kualitas Semen Segar Sapi
Limosin
Evaluasi
Rata- rata
Volume (ml)
Warna
pH
Konsistensi
Konsentrasi (106/ml)
Gerak Massa
Gerak Individu (%)
Viabilitas (%)
Abnormalitas (%)
Membran Plasma Utuh (%)
6,9 ± 0,8
Air Susu
6,4 ± 0,1
Sedang
1.175,5 ± 149,4
+++
70,6 ± 1,8
89 ± 2,8
7,2 ± 0,5
77,9 ± 2,6
beradaptasi dengan pengencer akibatnya
spermatozoa tidak terlindungi dari
pengaruh luar termasuk terjadinya
peroksidase lipid oleh ROS yang dapat
menyebabkan
kerusakan
membran
spermatozoa. Keutuhan membran plasma
bagi semen mutlak diperlukan untuk
menjamin kelangsungan hidup dan
keberhasilan untuk membuahi sel telur.
Fungsi membran plasma tidak hanya
sebatas melindungi organel– organel yang
terdapat didalam sel, tetapi lebih dari
itu, membran plasma mampu berfungsi
sebagai filter yang baik bagi pertukaran
zat intra dan ekstraseluler. Apabila
membran plasma rusak, maka proses
metabolisme akan terganggu yang pada
gilirannya akan menimbulkan akibat
yang fatal bagi semen Jika membran
plasma rusak, dapat menyebabkan
integritas membran menurun. Akibatnya
kontrol sistem transport terganggu yang
berakibat pada menurunnya metabolisme,
motilitas dan daya tahan hidup
spermatozoa (Herdis et al., 2008). Ketika
membran sperma mengalami kerusakan,
enzim aspartat aminotransferase (AspAT)
yang merupakan enzim utama dalam
mitokondria yang memproduksi ATP
akan dilepaskan dari sel dan masuk ke
seminal plasma. Kehilangan AspAT
akan mengganggu produksi ATP dan
mengganggu motilitas spermatozoa
(Arifiantini dan Purwantara 2010).
Kualitas Spermatozoa Pasca Pendinginan
Pada Suhu 5ºC
Dari hasil penelitian ini didapatkan
bahwa lama pendinginan pada suhu
5°C menunjukkan hasil yang berbeda
nyata pada motilitas spermatozoa before
freezing (Tabel 2) tetapi tidak berbeda
nyata pada viabilitas, abnormalitas dan
membran plasma utuh before freezing.
Semen yang didinginkan selama 22
jam menunjukkan motilitas before
freezing yang lebih baik 58,8±2,3%
daripada semen yang didinginkan
selama 4 jam 55,6±1,8%. Serta terdapat
pengaruh waktu pendinginan pada suhu
5°C terhadap motilitas spermatozoa
before freezing Semakin lama waktu
pendinginan menghasilkan motilitas
spermatozoa before freezing yang lebih
baik. Kemungkinan hal ini disebabkan
lama pendinginan pada suhu 5°C selama
4 jam spermatozoa belum sepenuhnya
Tabel.2 Rataan dan Simpangan Baku Kualitas Spermatozoa Pasca Pendinginan pada
Suhu 5°C
Perlakuan
Before Freezing
P1
P2
Post Thawing
P1
P2
Motilitas (%)
(x±sd)
Viabilitas (%)
(x±sd)
Abnormalitas (%)
(x±sd)
MPU (% )
(x±sd)
55,6 a±1,8
58,8b±2,3
84,4 ± 2,8
85,5 ± 2,1
7,9 ± 0,6
7,7 ± 0,5
66,3±2,2
68,3±1,5
44,4±1,8
44,4±1,8
80,1 ± 2,5
81,8 ± 2,1
8,6 ± 0,6
8,5 ± 0,2
58,7±1,2
58,9±2,8
Keterangan : P1 adalah pendinginan pada suhu 5°C selama 4 jam
P2 adalah pendinginan pada suhu 5°C selama 22 jam
a,b
Superkrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan
perbedaan nyata (p<0,05)
81
Anny Amaliya, Suzanita Utama, Hardijanto. Kualitas, Ekspresi HSP 70 dan Kerusakan DNA....
Dari Hasil penelitian di dapatkan
bahwa waktu pendinginan pada suhu
5°C tidak berpengaruh pada motilitas,
viabilitas, abnormalitas dan membran
plasma utuh post thawing (Tabel 2). Tidak
adanya perbedaan kualitas spermatozoa
post thawing pasca pendinginan
pada suhu 5ºC selama 4 dan 22 jam
diduga karena Komposisi pengencer
yang digunakan mampu melindungi
spermatozoa dari pengaruh cold shock.
Komposisi pengencer yang digunakan
antara lain laktosa yang merupakan salah
satu senyawa pereduksi dan memiliki
struktur yang stabil. Sebagai senyawa
pereduksi, laktosa memiliki fungsi yang
mirip dengan senyawa antioksidan karena
mampu meredam senyawa-senyawa
pengoksidasi, sehingga juga berperan
dalam
meminimalkan terjadinya
reaksi oksidasi. Senyawa krioprotektan
golongan karbohidrat seperti laktosa
memiliki kemampuan menggantikan
molekul air secara normal dalam
kelompok polar hydrated. Sifat-sifat
laktosa ini akan membantu menstabilkan
membran plasma sel semen selama masa
transisi melewati zona suhu yang kritis,
serta mengubah sifat mekanik pengencer
melalui peningkatan viskositas (Rizal,
2009).
Demikian
pula
penggunaan
rafinosa pada pengencer juga mampu
mempertahankan kualitas spermatozoa
selama pembekuan. Sebagai sumber
aktifitas rafinosa yang terdiri dari
D-galaktosa, D-glukosa dan D-Fruktosa
juga berfungsi menstabilkan kualitas
semen terhadap pengaruh buruk
penyimpanan dan pembekuan dalam
nitrogen cair (Ariantie dkk.,2013).
Kuning telur yang digunakan pada
pengencer berfungsi untuk melindungi
semen selama penyimpanan (Zega dkk.,
2015). Khasiat utama kuning telur atau
ekstrak kacang kedelai adalah kandungan
lesitin (phosphatidyl choline) yang dapat
bersifat membran coating untuk tetap
mempertahankan konfigurasi normal
82
phospholipid bilayer yang merupakan
susunan utama membran sel semen dan
pembekuan dalam nitrogen cair (Ariantie
dkk., 2013).
Ekspresi HSP 70 dan Kerusakan DNA
Spermatozoa Pasca Pendinginan Pada
Suhu 5ºC
Pengamatan ekspresi HSP 70
spermatozoa
dilakukan
dengan
pewarnaan imunositokimia. Spermatozoa
yang imunoreaktif akan berwarna coklat
kromogen hingga kehitaman, sedangkan
yang negatif akan berwarna hijau
kebiruan. (Gambar 1).
B
A
Gambar 1 Pengamatan Ekspresi HSP
70; Ekspresi HSP 70 negatif
(A), Ekspresi HSP 70 positif
(B) dengan mikroskop
Olympus BX-53 perbesaran
400x
Kerusakan DNA spermatozoa dapat
diamati melalui
integritas kromatin
dengan
menggunakan
pewarnaan
Toluidine Blue (TB). Kepala spermatozoa
yang memiliki integritas kromatin baik
akan berwarna biru terang, sedangkan
dengan integritas kromatin yang sudah
berkurang akan berwarna biru tua
Veterina Medika
Vol.10, No.1, Pebruari 2017
(Gambar 2).
B
A
Gambar 2
Pewarnaan semen dengan
TB; spermatozoa dengan
DNA utuh berwarna biru
terang (A) spermatozoa
dengan DNA rusak warna
biru tua (B) menggunakan
mikroskop Olympus BX53 perbesaran 400x.
Dari Hasil penelitian di dapatkan
bahwa tidak terdapat pengaruh lama
pendinginan pada suhu 5°C terhadap
ekspresi HSP 70 dan Kerusakan DNA
Spermatozoa Before Freezing dan Post
Thawing (Tabel 3).
Tabel 3 Rataan dan Simpangan Baku
Ekspresi HSP 70 dan Kerusakan DNA
Spermatozoa Pasca Pendinginan pada
Suhu 5°C
Perlakuan
Before Freezing
P1
P2
Post Thawing
P1
P2
HSP 70 (%) Kerusakan
(x±sd)
DNA(%)
(x±sd)
9,8±0,4
9,7±0,3
10,0±0,4
10,1±0,4
9,9±0,4
10,1±0,4
12,1±0,4
12,5±0,5
Keterangan :
• P1 adalah pendinginan pada suhu 5°C
selama 4 jam
• P2 adalah pendinginan pada suhu 5°C
selama 22 jam
Berbeda dengan hasil penelitian
Sardjito (2014) bahwa pada semen beku
terjadi peningkatan ekspresi HSP 70 yaitu
sebesar 30% jika dibandingkan dengan
semen segar yang hanya terekspresi 10
%. Hasil ini menunjukkan bahwa stres
spermatozoa pada saat pendinginan pada
suhu 5°C dan pembekuan dapat ditekan
sehingga ekspresi HSP 70 rendah, dengan
demikian perubahan pada struktur sel dan
fungsi protein dapat diminimalkan.
Diduga karena. proses pembekuan
pada penelitian ini menggunakan mesin
prefreezing dimana penurunan suhu
diatur sedemikian rupa untuk mencegah
terjadinya cold shock pada semen.
Sardjito (2014) berpendapat bahwa HSP
terekspresi apabila ada rangsangan stres
termasuk stres pembekuan. Ekspresi
HSP 70 yang rendah pada penelitian
ini menunjukkan bahwa stres pada saat
proses pembekuan dapat diminimalkan.
Hasil
Penelitian
menunjukkan
bahwa lama pendinginan pada suhu 5°C
tidak berpengaruh terhadap kerusakan
DNA before freezing dan post thawing.
Priyanto dkk., (2015) berpendapat bahwa
proses pembekuan semen menurunkan
presentase motilitas, viabilitas, MPU, dan
TAU tetapi tidak menurunkan keutuhan
DNA. Kerusakan DNA persentasenya
rendah selama proses pembekuan.
Rendahnya kerusakan DNA ini
kemungkinan disebabkan oleh manajemen
pemeliharaan pejantan yang cukup baik
sebagaimana pendapat menurut Morel
dan Rodriguez-Martinez (2007) beberapa
faktor yang dapat mempengaruhi
kerusakan dan kualitas DNA, adalah
pengaruh lingkungan, pakan, kesehatan,
dan kondisi sapi. Lingkungan dan pakan
sangat berpengaruh terhadap proses
spermatogenesis terutama pada fase
spermiogenesis. Selain itu rendahnya
kerusakan DNA disebabkan oleh
teknik pembekuan dan pengencer yang
digunakan baik (Priyanto dkk., 2015).
Pada penelitian ini terbentuknya
ROS dapat diminimalkan pada saat
proses pembekuan, sehingga
tidak
mampu mengoksidasi lipid maupun
83
Anny Amaliya, Suzanita Utama, Hardijanto. Kualitas, Ekspresi HSP 70 dan Kerusakan DNA....
protein membran yang dapat dibuktikan
dengan masih tingginya membran
plasma utuh semen setelah pembekuan.
Tingginya membran plasma utuh mampu
menjaga akses faktor ekstrinsik terhadap
DNA, sehingga fragmentasi DNA dapat
dihindari. Dengan demikian ROS yang
terbentuk masih dalam jumlah normal
yang digunakan untuk fungsi biologis
sebagaimana pernyataan Winarsi (2007)
bahwa radikal bebas atau reactive oxygen
species (ROS) dalam jumlah normal
penting untuk fungsi biologis.
Sardjito (2014) berpendapat bahwa
pada saat pembekuan terjadi peningkatan
aktivitas caspase 3, 8 dan 9 serta gangguan
potensial membran mitokondria tetapi
tidak berpengaruh signifikan terhadap
fragmentasi DNA. Fragmentasi DNA
lebih banyak disebabkan oleh faktor
thawing dari pada proses pembekuan.
Kesimpulan
Lama pendinginan pada suhu pada
suhu 5°C tidak berpengaruh terhadap
Kualitas, Ekspresi HSP 70 dan Kerusakan
DNA Spermatozoa Post Thawing sapi
limosin.
Daftar Pustaka
Ariantie, O.S, T.L Yusuf, D. Sajuthi dan
R.I Arifiantini. 2013. Pengaruh
Krioprotektan Gliserol dan Dimethilformamida dalam Pembekuan
Semen
Kambing
Peranakan
Etawah Menggunakan Pengencer
Tris Modifikasi. JITV Vol. 18 No.
4: 239-250.
Arifiantini, R.I dan B.Purwantara. 2010.
Motility and viability of Friesian
Holstein semen in three different
extender stored at 5°C. J Indonesian Trop Anim Agric.35:222-226.
Chatterjee, S., E.R. Smith, K. Hanada,
V.L. Stevens dan S. Mayor. 2001.
GPI Anchoring Leads to Sphingolipid-Dependent Retention of
Endocytosed Proteins in the Re-
84
cycling Endosomal Compartment.
EMBO J. 20(7):1583–1592.
Feradis. 2010. Bioteknologi Reproduksi
pada Ternak. Alfabeta. Bandung.
Gadea, J., E. Selles, S. Ruiz, P. Coy, R.
Romar, C. Matas and I. Campos.
2000. Effect of the Presence of
Glutathione in the Thawing Diluent on The Penetrability Capacity
of Porcine Oocytes In Vitro. Di
dalam : Proceedings 14 ICAR :
Stockholm, 2-6 Jul 2000. Abstract
Vol 2, 17:11.
Hafez, E.S.E. 2008. Reproduction in
Farm Animals. 6th Edition. Lea
Febiger. Philadelphia.
Halliwell, B. and M. Whiteman. 2004.
Measuring Reactive Species and
Oksidative Damage In Vivo and in
Cell Culture: How Should You Do
It and What Do the Results Mean:
British Journal of Pharmacology
142(2):231-255.
Herdis, M., Surachman, Yulnawati, M.
Rizal dan H. Maheshwari. 2008.
Viabilitas dan Keutuhan Membran
Plasma Semen Epididimis Kerbau
Belang pada Penambahan Maltosa
dalam Pengencer Andromed®.
J Indon Trop Anim Agric 33(2):
101-106.
Morrell, J.M and H. Rodriguez-Martinez.
2009.Biomimetic techniques for
improving sperm quality in animal breeding: a review. The Open
J Androl 1 : 1-9.
Priyanto,L., R.I Arifiantini dan T.L. Yusuf. 2015. Deteksi Kerusakan
DNA Semen Semen Segar dan
Semen Beku Sapi Menggunakan
Pewarnaan Toluidine Blue.Jurnal
Veteriner Maret 2015 Vol. 16 No.
1 : 48-55.
Rizal, M. 2009. Daya Hidup Semen Epididimis Sapi Bali yang Dipreservasi pada Suhu 3–5oC dalam Pengencer Tris dengan Konsentrasi
Veterina Medika
Vol.10, No.1, Pebruari 2017
Laktosa yang Berbeda. JITV Vol.
14 No. 2: 142-149
Sardjito, T. 2014. Identifikasi Kasus Infertilitas dan Pola Pita Protein Gel
SDS-PAGE Serum Sapi Betina
Crossbreed Baluran dan Perubahan Molekuler DNA pada Semen
Pejantan Baluran Post Thawing.
Disertasi. Universitas Airlangga.
Susilawati, T. 2011. Spermatology. Universitas Brawijaya Press. Malang.
Winarsi.2007. Antioksidan Alami dan
Radikal.Kanisius. Yogyakarta
Zega, I., S. Ilyas dan S. Hutahaean. 2015.
Kualitas Semen Sapi Limousin dalam Pengencer Two-Stetm
Extender Dengan Suplementasi
Kuning Telur Bebek Selama Penyimpanan pada Refrigerator.Jurnal Biosains Vol. 1 No. 3.
85
Anny Amaliya, Suzanita Utama, Hardijanto. Kualitas, Ekspresi HSP 70 dan Kerusakan DNA....
86