BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini

BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental, terhadap mencit sebagai
hewan coba. Dipilihnya jenis penelitian ini karena dapat menghasilkan data
dengan validitas yang tinggi dan perlakuan dapat diatur oleh peneliti
(Sastroasmoro dan Ismael, 2011).
B. Hewan Uji
Hewan uji berupa 30 ekor Tikus putih jantan (Rattus norvegicus), dengan
berat badan ± 150-230 gram, dan berumur 4-6 minggu. Tikus putihdiperoleh dari
Unit Pengembangan Hewan Percobaan Universitas Setya Budi, Surakarta. Bahan
makanan mencit digunakan pakan mencit BR I.
C. Rancangan Penelitian
Penentuan besar sampel dengan menggunakan rumus Federer (Supranto,
2007) yaitu :
(t - 1) (n
1) > 15 jumlah kelompok perlakuan,
n>4 dan (n) adalah jumlah
Dimana
(t)– adalah
sampel per kelompok perlakuan. Dengan rumus tersebut diperoleh minimal
sampel tiap kelompok adalah lim ekor tikus. Dalam penelitian ini kami
menggunakan enam ekor untuk setiap kelompoknya.
Setelah diadaptasikan selama dua minggu tikus dikelompokkan menjadi
lima kelompok, masing-masing enam ekor. Kelompok (i) kontrol, (ii) Ulkus DM,
(iii) Ulkus DM+propolis topikal 2,5%, (iv) Ulkus DM+propolis topikal 5%, (v)
Ulkus DM+propolis topikal 10%.
Setelahtikus dikorbankan jaringan kaki dikoleksi, untuk kemudian
dilakukan pembuatan preparat histologis untuk dideteksi secara imunohistokimia.
1
2
Pengukuran awal tidak dilakukan karena dianggap sama untuk semua kelompok yang
berasal dari satu populasi, sehingga dapat dikembangkan rancangan eksperimental tanpa
adanya pengukuran awal (pretest) tetapi hanya pengukuran akhir (post test)/post-test only
control group design (Sastroasmoro dan Ismael, 2011).
D.
Bagan Rancangan Penelitian
36 ekor tikus
putih jantan
I
O1
II
O2
III
O3
IV
O4
V
O5
0
30 hari
Gambar 3.Bagan Rancangan Penelitian
Keterangan:
O1
O2
O3
O4
O5
: Observasi kelompok kontrol negatip setelah 30 hari
: Observasi kelompok kontrol positip(DM) setelah 30 hari
: Observasi kelompok terapiI (DM+propolis topikal 2,5%) setelah 30 hari
: Observasi kelompok terapiII (DM+propolis topikal 5%) setelah 30 hari
: Observasi kelompok terapiIII (DM+propolis topikal 10%) setelah 30
hari
E. Kerangka operasional penelitian
Rattus norvegicus jantan
Kelompok normal6
ekor
STZ dosis 65 mg/kgBB
kadar glukosa darah ≥200 mg/dL
3
lukapada dorsalis pedis electric shaver
Vaselin
albumTopikal
Propolis
Topikal 2,5%
Propolis
Topikal 5%
Propolis
Topikal 10%
(6 ekor)
(6 ekor)
(6 ekor)
(6 ekor)
Ukuran luka,ekspresi TGF-β dan MMP9
Analisis Statistik
Gambar 4.Kerangka operasional penelitian
F. Variabel Penelitian
Klasifikasi variabel diukur menurut tujuan penelitian dan digolongkan dalam
beberapa variabel sebagai berikut:
1.
Variabel bebas:
Rangsangan tikus Rattus norvegicus jantandengan cara memberikan injeksi STZ 65
mg/kgBB untuk induksi DM, kemudian dibuat luka pada kakinya. Variabel tersebut meliputi:
a. Propolis topikal salep 2,5%.
b. Propolis topikal salep 5%.
c. Propolis topikal salep 10%.
2.
Variabel tergantung:
Variabel tergantung adalah variabel yang akan diteliti, yaitu perubahan
a. Ukuran luka.
b. Ekspresi TGF-β.
c. Ekspresi MMP-9.
4
3.
Variabel kendali:
1. Hewan coba: jenis tikus, umur dan jenis kelamin, homogen.
2. Pemeliharaan dan bahan makanan, minuman, sanitasi kandang, kelembaban
dikondisikan sama.
3. Injeksi: teknik injeksi pada tikus.
4. Pengambilan kulit.
5. Penghitungan ekspresi TGF-β dan MMP-9: teknik imunohistokimia.
G. Batasan Operasional
1. Hewan percobaan
Tikus putih jantan (Rattus norvegicus), dengan berat badan ± 150-230 gram, dan
berumur 4-6 minggu.
2. Tikus sehat
Tikus dengan kondisi mata bersinar, bulu tidak kusam, aktif, nafsu makan baik
(Kusumawati, 2004).
3. Hewan coba model kaki diabetes
Tikus putih diadaptasikan selama satu minggu, sebelum dilakukan perlakuan.
Untuk membuat model DM, tikus diinjeksi STZ dosis 65 mg/kgBB dalam 0.02 M
citrate saline buffer (Kim et al., 2006) (100 mM asam sitrat dan 100 mM Na sitrat
pada pH 4.5) (Gurney and Howarth, 2009) secara i.p. Hanya tikus dengan kadar
glukosa darah sewaktu (GDS) ≥200 mg/dL yang digunakan dalam penelitian ini.
Hewan
coba
dianestesi
menggunakan
campuran
ketamine/xylazine
(50 mg/kgBB ketamine dengan 50 mg/kgBB xylazine) secara i.p. Untuk kemudian
pada dorsal pedis dibuat luka ukuran 0,5x0,5 cm menggunakan electric shaver. Luka
ditutup dengan Tegaderm (3M Corporation, St. Paul, MN).Pada akhir perlakuan
semua hewan coba dikorbankan menggunakan eter, untuk kemudian dikebumikan.
4. Propolis Lebah
Proses pembuatan ekstrak propolis lebah dilakukan dengan teknik maserasi.
Propolis kering dibersihkan dan diblender hingga halus selanjutnya ditimbang
5
sebanyak 500 gram, kemudian dimasukkan ke dalam gelas beaker. Proses maserasi
dilakukan dengan menambahkan 3,75 liter etanol 95% sebagai pelarut (Trusheva dkk.,
2007). Campuran bahan disimpan selama tujuh hari pada ruangan yang tidak terkena
sinar matahari dengan dikocok kuat atau pengadukan dengan spatula pengaduk
sebanyak dua kali tiap hari (Susilo, 2007).
Tahap selanjutnya dilakukan penyaringan dengan corong buchner dan kertas
saring untuk memisahkan filtrat dari ampas ke dalam labu erlenmeyer sehingga
diperoleh fitrat. Hasil filtrasi (penyaringan) yang didapat dievaporasi dengan rotary
evaporator pada suhu 45 oC dengan tekanan vakum (<1 atm) sehingga diperoleh
ekstrak propolis yang konsentrasinya kental (± 100 g). Selanjutnya ekstrak propolis
diuapkan selama 24 jam di dalam gelas beaker sehingga kandungan etanolnya
menguap (Mawardi dkk., 2002; Sabir, 2005). Selain itu untuk mengetahui kandungan
etanol dalam ekstrak propolis benar-benar hilang, maka dilakukan metode uji bobot
tetap terhadap propolis.
5. Pengukuran kadar Glukosa Darah
Kadar glukosa darah ditentukan menggunakan Blood Glucose Test Meter (Gluco
Dr ), dengan range : 20 – 600 mg/dL, dari darah ekor tikus.
Tabel 2. Parameter dan definisi alat ukur penelitian
Parameter
Definisi
Ukuran
Luka diukur pada hari 0 dan 30
luka
pasca pembuatan luka. Persentase
luka dihitung menggunakan rasio
Alat ukur
mistar
Satuan
Skal
Data
a
mm2
Dilakukan
dengan
standar
Data
Rasio
6
area luka sebelum sampai sesudah
Panjang X
Lebar.
Akhir
penelitian
dilakukan
pengukuran
ulang. Luas
luka akhir
dibanding
kan dengan
pembuatan luka, berdasarkan
metode yang dilakukan Trousdale
et al.,2009.
luas luka
awal x
100%
sehingga
didapatkan
nilai akhir
dalam %
Ekspresi
Ekspresi TGF-β1 penilaian
visual
TGF-β
positifitas pemeriksaan IHC
dengan
menggunakan antibodi
mikroskop
monoklonal terhadap TGF-β1.
cahaya
Cara ukur dinilai secara
pembesar
kuantitatif, visual dengan
an 400x
mikroskop cahaya pembesaran
400x terhadap 1000 sel makrofag
sebagai sel yang mengekspresikan
TGF-β1. Kemudian dihitung
jumlah sel-sel tersebut yang
imunoreaktif tercat coklat perak,
pada membran sel. Jumlah semua
sel immunoreaktif yang
ditemukan kemudian dijumlahkan
dan selanjutnya dimasukkan
sebagai data (bilangan dalam
tabel untuk tiap hewan coba)
(Tomino, 2000; Susilo, 2006).
Per 100
sel
makrofag
Rasio
7
Ekspresi
Ekspresi MMP-9 penilaian
visual
Per 100
MMP-9
positifitas pemeriksaan
dengan
sel PMN
imunohistokimia dengan
mikroskop
menggunakan antibodi
cahaya
monoklonal terhadap MMP-
pembesar
9. Cara ukur dinilai secara
an 400x
Rasio
kuantitatif, visual dengan
mikroskop cahaya
pembesaran 400x
terhadap 1000 sel, yang
terdiri PMN sebagai yang
mengekspresikan MMP-9.
Kemudian dihitung jumlah
sel-sel tersebut yang
imunoreaktif tercat coklat
perak, pada membran sel.
Jumlah semua sel
immunoreaktif yang
ditemukan kemudian
dijumlahkan dan
dimasukkan sebagai data
(bilangan dalam tabel
untuk tiap hewan coba)
(Tomino, 2000; Susilo,
2006).
H. Prosedur Pelaksanaan Penelitian
Setelah mencit dikorbankan kulit dikoleksi untuk kemudian dibuat blok parafin.
Selanjutnya dilakukan pemotongan jaringan untuk pembuatan preparat histologis. Preparat
digunakan untuk pengukuran ekspresi TGF-β dan MMP-9 menggunakan imunohistokimia
(IHC) sesuai dengan protokol yang sudah dianjurkan dari pabriknya (Pharmingen, San Diego,
California, USA).
I.
Tempat penelitian
Penelitian ini dikerjakan di :
8
1. Kandang Hewan Percobaan Laboratorium Histologis Fakultas Kedokteran Universitas
Sebelas Maret sebagai tempat pemeliharaan hewan.
2. Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran untuk pemeriksaan IHC.
J. Waktu
Waktu yang diperlukan dalam penelitian ini selama 5 bulan dengan jadwal penelitian
sebagai berikut.
Tabel3. Jadwal penelitian
Jenis Kegiatan
1
2
Bulan ke3
4
5
1. Persiapan : memesan bahan-bahan,
mengumpulkan kepustakaan, diskusi,
membuat log book
2. Pelaksanaan Penelitian: Induksi hewan
coba
model
kaki
diabetik,
hitung
ekspresi TGF-β dan MMP-9, dan
analisis data
3. Penyusunan Laporan Tesis
K. Biaya
Biaya penelitian ini diperkirakan ± Rp 35.000.000,L. Analisis Data
Data disajikan dalam bentuk mean ± SD kemudian dianalisis menggunakan SPSS 22 for
windows dengan nilai p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik. Apabila hasil uji
normalitas data variabel untuk masing-masing kelompok sampel berdistribusi normal, maka
uji variasi atau perbedaan beberapa mean dapat menggunakan alat uji statistik Analysis of
9
Variance (ANOVA) atau disebut juga Uji F. Dan apabila terdapat variasi rata-rata untuk ke
enam kelompok sampel itu, analisis akan diteruskan dengan mencari perbedaan 2 mean
masing-masing kelompok menggunakan uji lanjutan ANOVA yaitu Post Hoc Test. Namun
apabila hasil uji normalitas data variabel menunjukkan bahwa distribusi data untuk masingmasing kelompok sampel adalah berdistribusi tidak normal maka uji variasi atau beda
beberapa mean dapat menggunakan uji statistik non parametrik Kruskal Wallis. Penelusuran
lebih lanjut untuk menguji beda mean masing-masing sampel kelompok dapat menggunakan
analisis statistik non parametrik Mann-Whitney.