bahan dan metode

11
BAHAN DAN METODE
Penelitian ini terdiri atas 2 tahapan utama, yaitu produksi protein
rekombinan hormon pertumbuhan (rGH) dari ikan kerapu kertang, ikan gurame,
dan ikan mas, dan uji bioaktivitas protein rGH pada ikan nila.
Produksi Protein Rekombinan Hormon Pertumbuhan (rGH)
Kloning Fragmen DNA Penyandi Protein GH Mature (mGH)
Isolasi Plasmid cDNA GH. Isolasi plasmid dilakukan menggunakan kit
FlexiPrep dari Amersham Pharmacia Biotech dengan prosedur sesuai dengan
manual. cDNA GH masing-masing ikan; kerapu kertang (Mulyadi et al. 2008),
gurame (Nugroho et al. 2007) dan mas (berdasarkan database Bank Gen no. akses
M27000) dalam bentuk plasmid pada vektor kloning pGEM-T Easy telah
tertransformasi dalam bakteri konstruksi E.coli DH5α. Bakteri konstruksi
diinkubasi pada suhu 37°C dalam media 2xYT (+Ampisilin) cair 8 ml di tabung L
sampai warnanya pekat (± 20 jam). Bakteri dari setiap tabung kultur dituang ke
dalam tabung mikro 1,5 ml, selanjutnya bakteri diendapkan dengan cara spin
down 30 detik 12000 rpm pada suhu 4°C kemudian supernatannya dibuang.
Selanjutnya ke dalam tabung mikro berisi pelet bakteri ditambahkan larutan
1 sebanyak 200 µl, divortex hingga pelet bakteri lepas dari dasar tabung.
Kemudian ditambahkan larutan 2 sebanyak 200 µl, tabung mikro dibolak-balik
sekitar 10 kali sebelum ditambahkan dengan larutan 3 sebanyak 200 µl. Tabung
dibolak-balik hingga terbentuk gumpalan-gumpalan putih, dilanjutkan dengan
sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 5 menit.
Supernatan dipindahkan ke tabung mikro yang baru, disentrifugasi sekali lagi
dengan kecepatan dan lama waktu yang sama dengan sebelumnya. Supernatan
dipindahkan ke tabung mikro berisi isopropanol 420 µl. Dihomogenasi dengan
vortex selama sekitar 1 menit dan dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu ruang
selama 10 menit selanjutnya dilakukan sentrifugasi 13000 rpm selama 15 menit.
Setelah isopropanol (supernatannya) dibuang dengan bantuan aspirator, ke dalam
tabung mikro berisi pelet DNA ditambahkan sephaglass 150 µl, dihomogenasi
dengan vortex selama 1 menit selanjutnya sentrifugasi 13.000 rpm selama 30
12
detik. Supernatan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 200 µl larutan Wash
Buffer dihomogenasi dengan vortex selama 1 menit dan kemudian disentrifugasi
13.000 rpm selama 30 detik. Supernatan dibuang, dan diganti dengan etanol 70%
dingin sebanyak 300 µl kemudian dihomogenasi dengan vortex selama 1 menit
dan kemudian disentrifugasi 13.000 rpm selama 30 detik.
Setelah semua etanol dibuang, tabung mikro dibiarkan kering udara selama
sekitar 10 menit, selanjutnya plasmid DNA dilarutkan dengan SDW sebanyak 3050 µl, dihomogenasi dengan vortex dan tabung mikro yang berisi plasmid
dibiarkan selama 5 menit pada suhu ruang. Selanjutnya disentrifugasi 13.000 rpm
selama 1-2 menit. Selanjutnya supernatan yang berisi plasmid DNA dipindahkan
ke tabung yang baru menggunakan mikropipet. Sebanyak 1 µl hasil isolasi
digunakan untuk elektroforesis dan selanjutnya diamplifikasi dengan PCR.
Amplifikasi PCR. Untuk mendapatkan fargmen GH mature (mGH)
masing-masing ikan dilakukan amplifikasi degan PCR. Primer yang digunakan
untuk amplifikasi mGH ikan kerapu kertang (El-mGH) adalah primer forward ElmGH-F 5’- ctcgag cag cca atc aca gac ggc cag - 3’ dan primer reverse El-mGH-R
5’- aagctt cta cag ggt aca gtt ggc ctc agg - 3’ yang masing-masing dilengkapi
dengan situs restriksi XhoI dan HindIII (digaris bawahi dan dicetak tebal). Primer
untuk amplifikasi fragmen DNA GH mature ikan gurame (Og-mGH) adalah
primer forward Og-mGH-F 5’- ggatcc cag cca atc aca gac agc cag - 3’ dan reverse
Og-mGH-R 5’- gaattc cta cag agt gca gtt agc ttc tgg - 3’ yang dilengkapi dengan
situs restriksi BamHI dan EcoRI. Selanjutnya primer untuk amplifikasi fragmen
DNA GH mature ikan mas (Cc-mGH) adalah primer forward Cc-mGH-F 5’ggatcc tca gac aac cag cgg ctc ttc - 3’ dan reverse Cc-mGH-R 5’- gtcgac cta cag
ggt gca gtt gga atc cag - 3’ yang dilengkapi dengan situs restriksi BamHI dan
SalI.
Reaksi PCR dilakukan dengan volume 10 µl yang mengandung 1 µl plasmid
cDNA GH masing-masing ikan dari hasil isolasi, 1 µl primer GH mature forward
maupun reverse (10 pmol/µl), 1 µl dNTP, 1 µl Ex Taq buffer, 0.05 µl Ex Taq
polymerase (TAKARA) kemudian sisanya ditambahkan SDW. Selanjutnya proses
PCR dijalankan pada suhu 94°C selama 3 menit (Pra PCR); (Denaturasi 94° C
selama 30 detik; Annealing 67° C selama 30 detik; Extension 72° C selama 1
13
menit) sebanyak 35 siklus; dan Pasca PCR 72° C selama 3 menit: dan 4oC (tak
hingga), untuk amplifikasi El-mGH dan Cc-mGH menggunakan suhu annealing
67°C, sedangkan Og-mGH menggunkan suhu annealing 69°C.
Ligasi ke vektor kloning. Fragmen DNA produk PCR diligasi
(disambungkan) ke vektor kloning pGEM-T Easy menggunakan T4 DNA ligase
(TAKARA). Vektor pGEM-T Easy disentrifugasi agar kandungannya terkumpul
pada dasar tabung, selanjutnya reaksi ligasi dicampur pada tabung mikro dengan
komposisi: 6,5 µl 2x buffer ligasi; 0,5 µl Vektor pGEM-T Easy (50 ng); 1 µl T4
DNA ligase sebanyak; produk PCR sebanyak 5 µl; dan SDW 5,2 µl. Inkubasi
dilakukan selama 2 jam pada suhu ruang dan dilanjutkan semalaman di dalam
refrigerator (suhu 4°C).
Pembuatan Sel Kompeten. Sel kompeten adalah sel bakteri yang
digunakan dalam proses transformasi, untuk kloning (perbanyakan) digunakan
bakteri Escherichia coli DH5α, sedangkan untuk ekspresi digunakan bakteri
Escherichia coli BL21 (DE3). Pembuatannya adalah; koloni tunggal bakteri E.
coli DH5α atau BL21 (DE3) dikultur dalam 25 ml LB (komposisinya adalah 1
gram tryptone 1%, 0,59 gram yeast exstract 0,5%, dan 1 gram NaCl 1% di dalam
100 ml SDW ) kemudian diinkubasi (shaker) pada suhu 37 oC selama 16-18 jam.
Selanjutnya 1% kultur E. coli diambil untuk dilakukan sub kultur dengan
memasukkan ke dalam 25 ml LB yang baru kemudian selanjutnya diinkubasi
selama 3 jam (peremajaan bakteri), selanjutnya kultur bakteri tersebut disimpan
dalam wadah yang berisi es selama 30 menit.
Kemudian, kultur bakteri sebanyak 1,5 ml dimasukkan ke dalam tabung
mikro dan disentrifugasi pada 5000 rpm selama 2 menit, supernatan yang
terbentuk kemudian dibuang (dilakukan sebanyak 2 kali). Pelet yang ada dalam
tabung mikro selanjutnya dicuci dengan menggunakan 1 ml NaCl mix dingin dan
disentrifugasi selama 2 menit pada 5000 rpm, supernatan yang terbentuk dibuang
dan kemudian ditambahkan CaCl2 mix dingin sebanyak 1 ml, selanjutnya di
biarkan selama 20 menit dalam wadah yang berisi es, kemudian disentrifugasi
kembali selama 2 menit pada 5000 rpm, selanjutnya supernatannya dibuang.
Kemudian pelet yang terbentuk disuspensikan dengan 200 µl CaCl2 mix,
selanjutnya campuran tersebut diinkubasi dalam es selama 20 menit hingga 1 jam,
kemudian siap digunakan sebagai sel kompeten.
14
Transformasi. Transformasi merupakan proses memasukkan plasmid yang
mengandung fragmen DNA insersi ke dalam bakteri E. coli DH5α sebagai
wahana kloning plasmid atau ke dalam bakteri E. coli BL21 sebagai wahana
ekspresi protein. Sebanyak 6,5 µl plasmid hasil ligasi dimasukkan ke dalam
tabung mikro yang berisi sel kompeten. Kemudian, campuran ini didiamkan
selama 20 hingga 30 menit di dalam wadah yang berisi es. Transformasi
dilakukan dengan cara diberikan kejutan suhu 42 oC selama 45 detik. Setelah itu
tabung mikro diinkubasi on-ice selama 2-3 menit. Selanjutnya, sebanyak 200 µl
LB ditambahkan ke dalam tabung mikro. (Larutan LB mengandung 1 gram
tryptone 1%, 0,59 gram yeast extract 0,5%, 1 gram NaCl 1% dengan pelarut 100
ml SDW). Selanjutnya diinkubasi pada shaker dengan suhu 37oC selama 1,5 jam
pada 200 rpm. Kemudian bakteri disebar di dalam media agarosa 2xYT yang
mengandung IPTG, X-gal dan ampisilin, sehingga disingkat menjadi 2xYT (I, X,
A). 2xYT mengandung tryptone 1,6%, yeast extract 1%, NaCl 0,5%, Bacto agar
dalam SDW). Kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 16-18 jam.
Identifikasi Transforman. Identifikasi dilakukan dengan metode cracking
(Alimuddin et al. 2008). Koloni putih hasil transformasi yang tumbuh di atas
agarosa 2xYT diambil menggunakan tusuk gigi steril dan dioleskan ke ujung
tabung mikro dan dilanjutkan dengan pembuatan master plate agarosa 2xYT (I, X
dan A). Master plate kemudian diinkubasi pada suhu 37oC sekitar 8 jam. Ke
dalam tabung mikro yang telah dioleskan bakteri ditambahkan 10 µl cracking
buffer, 10 µl EDTA 1 M dan 1 µl loading buffer cracking berisi KCl 1 M dengan
perbandingan volume 1:1. (Cracking buffer mengandung 0,2 gram saccharosa, 40
µl NaOH 5 M, 50 µl SDS 10% dan sisanya SDW hingga volume larutan menjadi
1 ml). Selanjutnya tabung mikro di Spin down pada 5000 rpm selama 2 hingga 3
detik kemudian divortex. Larutan tersebut disentrifugasi pada 12.000 rpm selama
5 menit. Selanjutnya dielektriforesis sebanyak 10 µl supernatan yang terbentuk
dengan gel agarose 0,7% untuk mengidentifikasi apakah bakeri yang sudah
ditransformasi membawa plasmid yang berisi gen yang kita insersikan dan
membandingkannya dengan kontrol, vektor pGEM-T Easy tanpa insersi fragmen
DNA mGH.
15
Pembuatan Vektor Ekspresi Protein rGH
Isolasi Fragmen GH Mature. Plasmid pGEM-T Easy yang mengandung
mGH (El-mGH, Og-mGH dan Cc-mGH) yang telah dikloning di dalam bakteri E
coli DH5α kemudian diisolasi menggunakan kit GF-1 Plasmid DNA Extraction
Kit (Vivantis) dengan prosedur yang sesuai dengan manual kit yang digunakan.
Selanjutnya vektor pGEM-T Easy yang mengandung El-mGH (kerapu kertang)
dipotong dengan menggunakan enzim restriksi XhoI dan HindIII, vektor pGEM-T
Easy yang mengandung Og-mGH (gurame) dipotong dengan menggunakan enzim
restriksi BamHI dan EcoRI, sedangkan vektor pGEM-T Easy yang mengandung
Cc-mGH (mas) dipotong dengan menggunakan enzim restriksi BamHI dan SalI.
Untuk mengeluarkan fragmen GH mature dari vektor pGEM-T Easy, pereaksinya
adalah 5 µl masing-masing plasmid pGEM-T Easy yang mengandung mGH
dimasukkan kedalam tabung mikro selanjutnya di tambahkan 5 µl Buffer (ElmGH: 10x M Buffer; Og-mGH: 10x K Buffer; Cc-mGH: 10x T Buffer), kemudian
ditambahkan enzim restriksi masing-masing 1 µl, selanjutnya ditambahkan SDW
sebanyak 38 µl. Fragmen mGH terpotong dan siap diligasikan ke vektor ekspresi
protein.
Preparasi Vektor Ekspresi. Vektor ekspresi yang akan digunakan adalah
pCold 1 DNA (Takara-bio). Vektor ekspresi sebanyak 2 μl dimasukkan masingmasing ke dalam tabung mikro lalu dicampurkan dengan 5 µl 10x Buffer. Untuk
El-mGH ditambahkan enzim restriksi XhoI dan HindIII, untuk Og-mGH
menggunakan enzim BamHI dan EcoRI, dan untuk Cc-mGH menggunakan enzim
BamHI dan SalI masing-masing 1 µl, kemudian ditambah SDW sebanyak 30 μl.
Campuran ini diinkubasi pada suhu 37° C selama 2 hingga 4 jam. Selanjutnya,
vektor yang sudah dipotong kemudian disimpan pada suhu -20° C hingga akan
digunakan.
Ligasi mGH ke Vektor Ekspresi. Reaksi ligasi yang dilakukan meliputi 5
µl larutan mGH masing-masing El-mGH, Og-mGH, dan Cc-mGH; kemudian 0,5
µl pCold 1 DNA yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi; 6,5 µl 5x
buffer ligasi, dan 1 µl enzim T4 DNA ligase (TAKARA). Selanjutnya larutan
diinkubasi selama 2 jam pada suhu ruang, kemudian inkubasi dilanjutkan
semalaman direfrigerator (suhu sekitar 4oC).
16
Transformasi ke E. coli BL21. Bakteri yang digunakan untuk
mengekspresikan protein rekombinan rGH adalah bakteri E. coli BL21 yang
sebelumnya sudah dibuat menjadi kompeten. Sebanyak 6,5 µl plasmid hasil ligasi
yang sudah diinsersikan gen dimasukkan ke dalam tabung mikro yang berisi sel
kompeten. Kemudian, campuran ini didiamkan selama 20 hingga 30 menit di
dalam wadah yang berisi es. Transformasi dilakukan dengan cara diberikan
kejutan suhu 42oC selama 45-55 detik. Setelah itu tabung mikro diinkubasi on-ice
selama 2-3 menit. Kemudian ditambahkan LB sebanyak 200 µl ke dalam tabung
mikro. Selanjutnya diinkubasi pada shaker dengan suhu 37 oC selama 1,5 jam pada
200 rpm, kemudian bakteri disebar di dalam media agarosa 2xYT yang
ditambahkan ampisilin. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 16-18 jam.
Identifikasi dan Peremajaan Transforman. Bakteri E. coli BL21 yang
membawa plasmid pCold 1 DNA yang telah disisipi fragmen mGH ikan kerapu
kertang (El-mGH), ikan gurame (Og-GH), dan ikan mas (Cc-mGH) dicracking
kemudian diidentifikasi untuk membuktikan bahwa bakteri tersebut membawa
plasmid yang berisi gen yang telah kita insersikan. Selanjutnya bakteri tersebut
diremajakan dan dikultur secara massal untuk memproduksi protein rekombinan
yang diekspresikan oleh plasmid pCold-mGH di dalam bekteri tersebut.
Produksi Protein rGH
Ekspresi protein rGH di dalam E. coli BL21. Klon bakteri E. coli BL21
yang positif mengandung pCold-mGH dikultur selama 16-18 Jam dengan dishake
pada tabung erlenmeyer dengan media 2xYT cair 200 ml tambah ampisilin,
selanjutnya subkultur selama 2 jam pada suhu 37 oC dengan dishake. Selanjutnya
kultur bakteri diberi kejutan dingin pada suhu 15oC selama 30 menit. Kemudian
ditambahkan 200 µl IPTG 100 mM, kultur dilanjutkan selama 24 jam dengan
dishake pada suhu 15oC, kemudian pelet bakteri dikoleksi dengan disentrifugasi
4000 rpm selama 5 menit, selanjutnya pelet bakteri E. coli BL21 yang
mengandung protein rekombinan hormon pertumbuhan (rGH) dianalisis dengan
teknik SDS-PAGE.
Analisis protein rGH. Pelet BL21 hasil ekspresi kemudian diresuspensi
dengan PBS (16 mM Na2HPO4-2H2O, 4 mM NaH2 PO4·2H2O, 120 mM NaCl, pH
17
7.4) ditambah 0.1% (w/v) Triton X-100 kemudian dilisis dengan alat sonikasi 6
siklus dengan kekuatan penuh menggunakan probe 9 mm, dengan perlakuan 1
menit dihidupkan dan 1 menit dimatikan sambil suspensinya dibenamkan di
dalam es. Kemudian disentrifugasi untuk memisahkan material yang tidak larut
dalam homogenate sel, protein rGH akan terikat di dalam pelet dan supernatannya
dibuang, selanjutnya pelet yang terbentuk dicuci dua kali dengan 1 M NaCl yang
berisis 1% (w/v) Triton X-100 dan terakhir dibilas dengan PBS, selanjutnya pelet
bakteri yang mengandung protein rGH ikan kerapu kertang, ikan gurame dan ikan
mas dianalisis dengan teknik SDS-PAGE.
SDS-PAGE atau sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel elektroforesis
merupakan teknik yang secara luas digunakan dalam bidang biokimia, forensik,
genetika, dan biologi molekuler untuk memisahkan protein berdasarkan berat
molekulnya dengan memigrasikannya pada gel elektroporesis atau SDS-PAGE
berfungsi mengikat polipeptida sehingga terbentuk protein kompleks yang
tereduksi sesuai dengan berat molekulnya. Protein dari 1 µg pelet bakteri
dianalisis menggunakan metode SDS-PAGE dengan konsentrasi gel poliakrilamid
10%, dan protein divisualisasi menggunakan pewarna Coomassie Blue. Ukuran
protein rGH diprediksi berdasarkan konsensus bahwa 10 kDa protein sama
dengan 270 bp DNA.
Uji Bioaktivitas Protein rGH
Bioaktivitas protein rGH ditentukan dengan menganalisis pertumbuhan ikan
nila yang diinjeksi dengan rGH dan dibandingkan dengan ikan nila yang hanya
disuntik dengan PBS atau protein dari pCold 1 tanpa fragmen DNA mGH. Juvenil
ikan nila ukuran ±11 g/ekor diinjeksi dengan protein total (inclusion body) dengan
dosis 1 µg pelet bakteri yang dilarutkan dalam 10 μl PBS per gram ikan. Injeksi
dilakukan secara intramuscular seminggu sekali selama 4 minggu. Bobot ikan
diukur seminggu sekali selama 2 bulan pengamatan dan diakhir dihitung kelulus
hidupannya
Analisis Data
Vektor kloning dan vektor ekspresi yang dihasilkan serta produksi protein
rekombinan hormon pertumbuhan (rGH) ikan kerapu kertang (El-mGH), ikan
18
gurame (Og-mGH), dan ikan mas (Cc-mGH) disajikan dalam bentuk gambar
kemudian dianalisis dan dijabarkan secara deskriptif. Selanjutnya data hasil uji
bioaktivitas di analisis ragam dan jika terjadi perbedaan antar perlakuan
dilanjutkan dengan uji beda nyata terkecil.