Isolasi DNA
advertisement
ISOLASI DNA Oleh : Sonia Tambunan 105040201111171 DNA 2 Benang TAHAPAN UMUM ISOLASI DNA Perusakan Dinding Sel • Penggunaan Nitrogen Cair Lisis Membran Sel • Penggunaan Detergen Kationik (CTAB) Pemurnian • Beberapa Kontaminan Seperti Senyawa Sekunder Presipitasi (Penggumpulan DNA) • Menggunakan isopropanol dingin ALAT YANG DIGUNAKAN Mortar dan Pestle Tabung Nitrogen Tube Eppendorf 1,5 ml atau 2 ml Mikropipet Oven Freezer Mesin Elektrofotometer Mesin Spektrofotometer Mesin Sentrifuse Pipet tip 1000 µl dan 20 µl METODE 1. • Doyle and Doyle, 1987 2. • Fatchiyan 3. • Karsian, et al, 2002 LANGKAH KERJA Timbang daun 0,5 gram. Gerus ( + Nitrogen Cair dan PVP) + Buffer CTAB 1 ml + betq mertcaptoethanol 5 µl Vortek, inkubasi T = 65°C 30 menit + chisam/CIA 700 µl, vortek Sentrifuse 6000 rpm, 10 menit diambil supertan + CHISAM 100 µl Sentrifuse 6000 rpm . 10 menit ambil supernatan + isopropanol dongin inkubasi freezer 30 menit Sentrifuse 6000 rpm. 10 menit. Ambil pellet dan buang supernatannya + 200 µl buffer pencuci (2x) endapan dikeringkan + 500 µl TE (resuspensi DNA) + 1 µl RNAase, inkubasi T = 35°C, 30 menit Setelah dingin + ethanol dingin, inkubasi dalam freezer 30 menit Sentrifuse 6000 rpm, 10 menit, endapan dikeringkan Resuspensi 200 µl buffer TE Elektroforensis • Besar DNA total hasil isolasi • Semakin besar maka semakin tebal dan dekat dengan sumur • Kontaminan Spektrofotometer • Prinsip kerja • Visualisasi dengan sinar UV • DNA bergerak mengikuti aliran listrik • Ethidium Bromida • Smear • Fire type Kualitas Hasil Isolasi Elektroforensis dengan gel agarose UJI KUALITAS DNA • DNA : 260 dan Protein : 280 • 1,8 – 2,0 = DNA murni • < 1,8 = kontaminan protein • > 2,0 = kontaminasi fenol, kloroform, RNA (RNAase) PCR Polimerase Chaine Reaction KOMPONEN PCR MgCl2 Buffer dNTP Primer Enzim DNA Template TAHAPAN PCR (SIKLUS PCR) Denaturas • Proses pemecahan ikatan hidrogen dari double strand menjadi singlestrand • Suhu 94°C – 95°C Annealing • Proses penempelan primer pada DNA template yang komplemen dengan urutan basa primer • Suhu 50°C – 55°C Elongation • Proses pemanjangan daerah yang komplemen dengan primer • Suhu 72°C Seleksi Tiga Keragaman genetik tanaman kekerabatan Dua Satu MANFAAT PCR Uji kemurnian benih DOKUMENTASI PRAKTIKUM ALAT DAN BAHAN