Pokok Bahasan V. KULTUR KALUS DAN SUSPENSI SEL

Pokok Bahasan V.
KULTUR KALUS DAN SUSPENSI SEL
Pendahuluan
Inisiasi pembentukan kalus merupakan salah satu langkah penting yang
menentukan keberhasilan teknik kultur in vitro. Kalus merupakan massa sel yang
tidak terorganisir, pada mulanya sebagai respon terhadap pelukaan (wounding).
Pembelahan selnya menjadi tidak terkendali, sel-selnya mengalami proliferasi
yaitu membelah terus menerus dengan sangat cepat, hal ini dimungkinkan
karena sel-sel tumbuhan yang secara alamiahnya bersifat autotrof dikondisikan
menjadi heterotrof oleh adanya nutrisi yang cukup komplek dan zat pengatur
tumbuh didalam medium kultur. Selain dari luka bekas irisan, kalus juga dapat
berasal dari pembelahan sel-sel kambium yang terus membelah dan
berproliferasi. Proliferasi sel-sel akan terjadi lebih baik jika eksplan yang
digunakan berasal dari jaringan yang masih muda. Sel-sel kalus secara fisiologis
dan biokimia sangat
berbeda dengan sel-sel eksplannya
yang sudah
terdiferensiasi. Sel-sel pada kalus bersifat meristematik dan merupakan salah
satu wujud dari dediferensiasi. Dediferensiasi merupakan reversi dari sel-sel
hidup yang telah terdiferensiasi menjadi tidak terdiferensiasi, atau dengan kata
lain menjadi meristematik kembali. Dediferensiasi merupakan langkah awal bagi
perbanyakan vegetatip dengan teknik kultur in vitro karena merupakan dasar
terjadinya primordia tunas dan akar.
Kalus
dapat
diperbanyak
secara
tidak
terbatas
dengan
cara
memindahkan sebagian kecil kalus kedalam medium baru (sub kultur). Kalus
dengan sel-selnya yang bersifat meristematik, dapat didispersikan didalam
medium cair sehingga dapat diperoleh kultur suspensi sel.
Tujuan Instruksional Khusus
Setelah mengikuti kuliah ini diharapkan mahasiswa dapat menjelaskan
prinsip dasar pelaksanaan teknik kultur kalus dan suspensi sel, faktor-faktor yang
mempengaruhi pertumbuhan pada kultur kalus dan suspensi sel.
Subpokok Bahasan 1: KULTUR KALUS
Pendahuluan
Teknik kultur jaringan dimulai dengan mengisolasi bagian-bagian
tanaman (sel, jaringan, organ) kemudian menumbuhkannya secara aseptis
diatas atau didalam suatu medium budidaya sehingga bagian-bagian tanaman
tersebut dapat memperbanyak diri, dalam 1 - 2 bulan, tergantung dari jenis
tumbuhannya, akan terbentuk kalus. Kalus biasanya terjadi pada eksplan
ditempat irisan, karena jaringan kalus ini merupakan jaringan yang bertujuan
menutup luka. Pembelahan sel-sel pada kalus dipacu oleh hormon endogen dan
eksogen auksin dan sitokinin yang ditambahkan pada medium kultur. Kalus juga
dapat timbul karena adanya infeksi dari mikroorganisme tertentu seperti
Agrobacterium tumefaciens, gigitan serangga dan nematoda. Kalus yang
diakibatkan oleh infeksi Agrobacterium disebut tumor (crown gall). Pembentukan
kalus tergantung dari jenis tumbuhan, asal eksplan, umur fisiologi dari tanaman
donor dan komposisi medium kultur. Pada kenyataannya sulit untuk memperoleh
kalus dari hasil kultur jaringan yang eksplannya diambil dari sembarang bagian
jaringan tumbuhan. Kultur kalus bertujuan untuk mendapatkan kalus dari eksplan
yang ditumbuhkan diatas medium kultur secara terus menerus.
Materi Subpokok Bahasan 1
Kalus telah berhasil diinduksi dari bermacam-macam eksplan, yang perlu
mendapat perhatian pada pemilihan eksplan adalah, harus mengandung sel-sel
yang aktip membelah. Semua bagian tanaman yang masih muda (kecambah)
sangat responsip untuk induksi kalus. Bagian-bagian tanaman seperti embrio
muda, hipokotil, kotiledon, koleoptil, umbi akar wortel yang mengandung
kambium dan batang muda merupakan bagian yang mudah untuk dediferensiasi
menghasilkan kalus. Eksplan terbaik untuk induksi kalus adalah jaringan dari
bagian-bagian semai (seedling) yang dikecambahkan secara in vitro. Jaringan
yang mengandung parenkim tidak hijau, seperti parenkim empulur, mempunyai
respon yang lebih baik dibandingkan dengan sel-sel daun yang mengandung
kloroplas. Ukuran eksplan juga penting untuk diperhatikan, idealnya ukuran
eksplan yang dikehendaki adalah yang kecil tetapi tetap mempunyai kemampuan
yang tinggi untuk membelah, hal ini dimaksudkan agar diperoleh sel-sel yang
relatip homogen.
Inisiasi pembentukan kalus dimulai dari hasil pembelahan sel yang terus
menerus pada jaringan induk yang tidak perlu harus berhubungan langsung
dengan medium kultur, pertumbuhan yang tercepat terjadi didaerah perifer. Hal
ini disebabkan karena pada daerah tersebut ketersediaan hara dan oksigennya
lebih baik. Pertumbuhan kalus merupakan hasil interaksi yang sangat komplek
antara eksplan, komposisi medium dan kondisi lingkungan selama periode
inkubasi. Sel-sel memperlihatkan peningkatan aktivitas sitoplasmik yang ditandai
dengan meningkatnya respirasi dan jaringan kembali kekeadaan meristematik
(dediferensiasi). Selama pertumbuhannya kalus dapat mengalami lignifikasi yang
cukup kuat hiugga menyebabkan kalus bertekstur keras dan kompak, ada juga
yang friabel dan lunak sehingga mudah terpecah-pecah menjadi serpihanserpihan kecil. Kalus dapat berwarna kekuningan, putih, hijau atau terpigmentasi
oleh antosianin. Pigmentasi dapat seragam pada keseluruhan kalus atau
sebagian daerah tidak terpigmentasi. Sel-sel pembentuk antosianin dan nonantosianin telah berhasil diisolasi dari kalus wortel.
Induksi kalus dan pertumbuhan kalus yang terus berlangsung (dengan
melakukan subkultur), memerlukan gula dan garam-garam mineral pada
medium, selain itu juga memerlukan zat pengatur tumbuh:
(i) Auksin (pada kebanyakan monokotil)
(ii) Sitokinin (misalnya, pada gymnospermae)
(iii) Auksin dan Sitokinin (pada kebanyakan dikotil dan beberapa spesies
monokotil)
(iv) Tidak memerlukan zat pengatur tumbuh (misalnya tumor, jaringan yang
mengalami habituasi penuh)
Zat pengatur
tumbuh yang umum dan
efektip digunakan untuk
induksi kalus (dediferensiasi) adalah 2,4-D, dicamba atau picloram.
Kalus dari eksplan yang berasal dari satu macam tipe sel akan
mengandung sel-sel yang seragam pula, misalnya sel-sel parenkim floem dari
wortel. Eksplan batang, akar dan daun sel-sel penyusunnya sangat heterogen,
kalus yang terbentuk dari eksplan tersebut sel-selnya juga sangat heterogen dan
terdiri dari bermacam-macam tipe sel misalnya sel-sel meristematik (ditengah),
sel-sel yang parenchymatous, sel-sel yang mengandung vacuola, sel-sel
raksasa, sel-sel seperti tracheid dsb, heterogenitas ini mencerminkan asal dari
eksplannya. Sel-selyang heterogen dari jaringan yang kompleks menunjukkan
pertumbuhan yang berbeda. Dengan mengubah komposisi media, terjadi seleksi
sel-sel yang mempunyai sifat khusus. Media seleksi dapat didasarkan pada
unsur-unsur hara atau zat pengatur tumbuh yang ditambahkan kedalam media.
Selain dari eksplannya, sel-sel yang heterogen pada kalus juga dapat
disebabkan karena masa kultur yang terlalu lama melalui serangkaian sub kultur
yang berulang-ulang. Masa kultur yang terlalu lama menyebabkan adanya
perubahan terhadap kebutuhan zat pengatur tumbuh eksogen, ketidak
tergantungan sel-sel untuk terus membelah tanpa adanya zat pengatur tumbuh
eksogen disebut habituasi. Sel-sel dapat mengalami habituasi terhadap auksin
maupun sitokinin. Masa kultur yang terlalu lama juga dapat menyebabkan
adanya heterogenitas karyologis, yang dicerminkan dengan adanya perubahan
dari siklus sel dan ketidak teraturan pembelahan mitosis selama masa kultur.
Perubahan-perubahan yang terjadi dapat berupa:
(i) Poliploidi meningkat secara progresif sejalan dengan lamanya kultur
kalus, zat pengatur tumbuh 2,4-D dapat menigkatkan frekuensi poliploidi.
(ii) Aneuploidi yang kerapkali berkaitan dengan fragmentasi inti dan
abnormalitas dari mitotic spindle.
(iii) Perubahan structural pada kromosom, misalnya disentrik, fragmen
aksentrik, ring kromosom dsb.
(iv) Transposisi urutan DNA
(v) Amplifikasi gen, jumlah gen untuk sifat tertentu per genom haploid
bertambah
(vi) Delesi, hilangnya suatu gen
Adanya perubahan-perubahan karyologis ini menyulitkan aplikasi kultur
kalus untuk mikropropagasi dan produksi metabolit sekunder, tetapi dapat
dimanfaatkan untuk pemuliaan in vitro karena dapat menambah keragaman
genetik.
Setelah periode waktu tertentu, biasanya 2 minggu sampai 3 bulan,
pertumbuhan kalus akan menurun, kalus akan menunjukan gejala-gejala
penuaan seperti nekrosis atau menjadi coklat dan akhirnya mengering. Hal
tersebut sebagai akibat dari beberapa faktor berikut:
1. Kandungan nutrisi media menyusut
2. Penguapan
(evaporasi)
yang
mengakibatkan
agar-agar
semakin
mengeras sehingga menghambat difusi nutrien dan meningkatnya
konsentasi dari beberapa komponen medium
3. Sel-sel pada kalus juga mengeluarkan persenyawaan-persenyawaan
hasil metabolisme yang menghambat karena terakumulasinya sejumlah
senyawa toksik pada medium disekitar eksplan
4. Sel-sel yang terdapat ditengah-tengah massa sel mengalami kekurangan
oksigen .
Untuk mengatasi hal tersebut diatas, kalus harus disubkultur pada
medium baru, tergantung dari tujuannya medium baru yang digunakan untuk
subkultur dapat sama atau berbeda dengan medium semula. Secara umum
dapat dikatakan, tujuan dilakukannya subkultur adalah untuk menjaga kehidupan
dengan mempertahankan laju pertumbuhan sel tetap konstan sehingga dapat
diperoleh kalus dengan sel-sel yang homogen, untuk memperbanyak kalus dan
untuk diferensiasi kalus. Untuk tujuan diferensiasi biasanya digunakan medium
yang mengandung kombinasi zat pengatur tumbuh dari auksin dan sitokinin yang
berbeda. Pembentukan organ umumnya membutuhkan zat pengatur tumbuh
yang lebih tinggi daripada yang dibutuhkan untuk pertumbuhan kalus.
Hal yang perlu diperhatikan pada subkultur adalah massa sel yang
dipindah harus cukup banyak. Hal ini dapat dilakukan dengan membiarkan kalus
tumbuh hingga mencapai diameter 2-3 cm sebelum dipisahkan dari eksplan dan
membaginya menjadi 4-8 inokula untuk disubkulturkan pada medium baru. Bila
kalus menunjukkan rupa yang hetcrogen, yang harus dipilih sebagai inokulum
adalah kalus yang menunjukan pertumbuhan tercepat, biasanya yang berwarna
agak pucat dan lunak. Doods & Roberts (1982) menganjurkan inokulum yang
mempunyai diameter 5-10 mm dengan berat sekitar 20-100 mg. Subkultur yang
berhasil biasanya dilakukan setiap 28 hari, namun waktu yang tepat tergantung
pada kecepatan pertumbuhan kalus. Pertumbuhan kalus diukur dengan
menghitung berat basah dan berat kering kalus pada periode waktu tertentu. Laju
pertumbuhan kalus, seperti halnya pada kebanyakan organisme sel tunggal,
membentuk kurva sigmoid (gambar 5.1).
Gambar 5.1. Kurva pertumbuhan kalus (Dodds & Roberts, 1982)
Proses diferensiasi in situ adalah reversible, hal ini ditunjukkan pada
kultur in vitro . Eksplan yang berupa sel, jaringan dan organ tanaman pada
hakekatnya telah mengalami proses diferensiasi. Dengan menanam bagianbagian tanaman tersebut diatas medium kultur secara aseptis, terjadilah proses
dediferensiasi, yaitu terbentuknya sel-sel parenkimatis yang tidak terdiferensiasi
(kalus). Sel-sel tanaman menunjukkan kemampuan yang luar biasa untuk
meregenerasikan dirinya menjadi tanaman utuh dari sel-sel yang tidak
terdiferensiasi tersebut, prosesnya disebut rediferensiasi, yaitu keadaan menjadi
berdiferensiasi kembali untuk membentuk akar, tunas dan embrioid yang
kemudian membentuk plantlet.
Pembentukan struktur yang terorganisir pada kalus dimulai dengan
pembentukan kelompok-kelompok sel yang rapat (meristemoid) dari sel-sel
meristematik yang dicirikan dengan ukuran kecil, penuh plasma dan inti
menyolok. Meristemoid diharapkan mampu membentuk primordia tunas maupun
akar.
Prosedur untuk mempelajari teknik dasar induksi kalus dicontohkan pada
umbi akar wortel, tahapannya adalah sebagai berikut:
Bahan dan alat:
1. Umbi akar wortel yang segar dan sehat
2. Medium MS padat dengan zat pengatur tumbuh 2,4-D 1 mg/l, lihat cara
pembuatan medium pada Pokok Bahasan IV
3. Petridish steril dengan kertas saring
4.
Alkohol70%
5. Akuades steril
6. Detergent
7. Clorox, Sunclin
8. Sikatgigi
9. Skalpel, pisau, pinset
10. Erlenmeyer 250 ml, beker glass 250 ml
11. Sprayer
Cara kerja
1. Persiapan eksplan
Umbi akar wortel dicuci bersih dengan cara disikat permukaannya dengan
menggunakan sikat gigi dan detergent. Umbi kemudian dipotong
melintang pada bagian tengah setebal kira-kira 1 cm. Masukkan segera
5-8 potong umbi kedalam beker glass, kemudian segera dibawa kedalam
Laminar air flow.
2. Sterilisasi eksplan
a. Bersihkan permukaan meja kerja dengan menyemprotkan alkohol
70% dan melapnya dengan kertas tissue. Sterilisasi eksplan
dilakukan dengan Clorox 10%. Masukkan potongan-potongan
umbi kedalam beker glass steril, tuangkan 100 ml clorox kedalam
beker glass yang berisi potongan eksplan, biarkan kira-kira 10
menit, sesekali beker glass digoyang-goyang.
b. Dengan pipet steril, pindahkan potongan-potongan eksplan dari
larutan Clorox kedalam beker glass kosong yang steril. Bilaslah
eksplan dengan akuades steril dua kali masing-masing selama 10
menit.
3. Pemotongan eksplan
a. Pindahkan potongan umbi kedalam petridish yang berisi kertas
saring steril, dengan menggunakan skalpel yang tajam, potongan
umbi ditipiskan ukurannya menjadi setebal kira-kira 0,5 cm
b. Buatlah potongan umbi menjadi kubus dengan ukuran kira-kira 0,5
x 0,5 cm
4. Penanaman dan inkubasi
a. Dengan pinset steril, masukkan 3 potong eksplan untuk tiap botol
kultur yang berisi medium MS + 2,4-D 1 mg/l
b. Botol kultur yang telah berisi eksplan segera ditutup, bed label
yang menunjukkan : jenis tanaman, medium yang digunakan dan
tanggal penanaman
c. Bawa segera keruang incubator, inkubasi dilakukan pada suhu
25°C ditempat terang.
Pengamatan:
1. Amati awal terbentuknya kalus, dari bagian mana kalus terbentuk
2. Lakukan subkultur pada minggu ke 3
3. Amati tekstur, struktur dan warna kalus
4. Ukurlah berat basah dan berat kering kalus
Gambar 5.2. Gambar skematis induksi kalus umbi akar wortel
Latihan soal-soal:
1. Apa yang disebut kalus, Jelaskan proses terbentuknya kalus!
2. Jelaskan bagaimana proses diferensiasi pada tanaman bersifat reversible
3. Jelaskan eksplan yang baik digunakan untuk induksi kalus!
4. Jelaskan apa yang terjadi pada kalus yang dipelihara untuk masa yang
panjang!
5. Jelaskan mengapa pada kultur kalus perlu dilakukan subkultur!
Petunjukjawaban latihan soal-soal
1. Ingat proses pembentukan kalus
2. Ingat proses dediferensiasi
3. Ingat jaringan yang meristematic
4. Ingat
adanya
habituasi,
karyologis yang terjadi!
5. Ingat pertumbuhan kalus!
heterogenitas
dan
perubahan-perubahan
Subpokok Bahasan 2 : KULTUR SUSPENSISEL
Pendahuluan
Kalus mengandung sel-sel yang lebih homogen dibandingkan dengan selsel yang terdapat pada eksplan, namun demikian sel-sel pada kalus tidaklah
seragarn. Kalus mengandung sel-sel yang mempunyai tingkat perkembangan
yang berbeda-beda (asynchronous) hal ini disebabkan karena kalus dikulturkan
pada medium padat, sehingga hanya bagian dasar dari kalus saja yang kontak
dengan medium kultur, akses ternauap nutrient menjadi berbeda. Sinkronisasi
dapat dilakukan dengan mengkulturkan kalus yang friabel kedalam medium cair
yang diinkubasi dengan penggojokan, setelah dua atau tiga minggu akan
terbentuk suspensi sel yang tumbuh aktip.
Kultur suspensi sel merupakan suatu system yang ideal untuk
mempelajari metabolisme sel, pengaruh berbagai persenyawaan pada sel dan
mempelajari diferensiasi sel. Dari segi praktis kultur suspensi sel dapat
digunakan sebagai sumber protoplas untuk difusikan atau manipulasi genetik,
untuk membuat single cell clone, untuk produksi embryo somatik , sel-sel pada
kultur suspensi sel juga dapat diperlakukan sebagai pabrik untuk memproduksi
metabolit sekunder.
Materi Subpokok Bahasan 2
Kalus yang friabel dan lunak jika ditransfer kedalam medium cair dan
diinkubasi dengan penggojokan, setelah dua atau tiga minggu, sel-sel akan
terpisah dari kalus dan inulai membelah, terdispersi didalam medium cair
membentuk suspensi sel yang aktip tumbuh. Populasi sel-sel didalam kultur
suspensi sel terdiri dari sel-sel tunggal yang bentuknya bermacam-macam,
agregat-agregat (kumpulan) sel yang beragam ukurannya, bagian eksplan
(inokulum) yang tersisa dan sel-sel mati, yang kesemuanya terdispersi didalam
medium cair. Medium cair yang digunakan komposisinya sama dengan medium
untuk induksi kalus, hanya pada kultur suspensi sel tidak menggunakan agaragar. Keuntungan dari digunakannya medium cair yang diinkubasikan dengan
penggojokan pada kultur suspensi sel adalah :
i.
tidak terjadi gradient nutrisi dan gas
ii.
semua permukaan sel dapat kontak dengan medium
iii.
aerasi yang lebih baik
iv.
tidak terjadi akumulasi senyawa-senyawa toksik
Kesemuanya membuat pertumbuhan sel pada kultur suspensi sel menjadi
sangat cepat. Derajat dispersi sel-sel didalam medium cair sangat dipengaruhi
oleh zat pengatur tumbuh. Penggunaan auksin dengan konsentrasi tinggi
(sampai 10μM) bersama dengan sitokinin dengan konsentrasi yang lebih rendah
(0,1 - 5) μM dapat meningkatkan dispersi sel. Inisiasi dari kultur suspensi sel
memerlukan kalus sebagai inokulum yang jumlahnya relatip cukup banyak, yaitu
sekitar 2-3 gram untuk 100 ml medium. Kalus sebanyak itu dapat menghasilkan
suspensi sel dengan densitas awal sekitar 0,5-2,5 x 105 per ml medium. Kultur
suspensi sel akan tumbuh dengan sangat cepat, untuk itu harus dilakukan
subkultur dengan cara mengenapkan sel-sel pada dasar botol kultur, kemudian
dengan hati-hati medium yang ada diatasnya dituang. Endapan sel-sel kemudian
dibagi menjadi dua bagian, masing-masing digunakan sebagai inokulum dengan
memasukkan kedalam medium baru yang komposisi dan volumenya sama
dengan medium lama. Biasanya subkultur dilakukan secara teratur setiap satu
atau dua minggu sekali, yaitu ketika sel berada pada awal fase stationary. Dasar
yang digunakan untuk subkultur ini adalah untuk mempertahankan kultur tetap
pada fase pertumbuhan logaritmik.
Ada sejumlah metoda yang digunakan untuk mengukur laju pertumbuhan
sel pada kultur suspensi sel, yaitu dengan menghitung:
a. Jumlah sel termampat (Packed Cell Volume, PCV)
b. Jumlah sel
c. Berat basah dan berat kering
d. Total protein
Sedangkan viabilitas sel ditentukan dengan pengecatan PDA, Evan's
blue, tetrazolium salt dsb. Viabilitas sel menentukan kemampuan sel-sel untuk
membelah. Pada semua metoda pengukuran tersebut diatas, sampling dari kultur
dilakukan pada interval waktu tertentu. Hasil pengukuran yang diplotkan dengan
waktu sampling tersebut akan menghasilkan kurva pertumbuhan yang khas,
berbentuk sigmoid, yang dicirikan dengan 5 fase pertumbuhan (gambar 5.3).
Gambar 5.3. Kurva pertumbuhan sel pada kultur suspensi sel
Pada saat inokulasi, sel-sel pada medium kultur berada dalam tahap
persiapan untuk membelah, sel-sel berada pada lag fase. Sel-sel kemudian
mengalami fase pertumbuhan eksponensial yang pendek, ditandai dengan laju
pembelahan yang maksimal. Kemudian diikuti dengan fase pertumbuhan linear,
pembelahan sel melambat tetapi laju ekspansi/pembentangan sel meningkat.
Pembelahan dan pembentangan sel menurun selama fase progressive
deceleration. Akhirnya sel-sel masuk ke fase stationary. Selama fase stationary
jumlah sel pada kultur kurang lebih konstan karena sel-sel tidak membelah lagi.
Siklus ini dapat diulang bilamana pada awal fase stationary sel-selnya disubkultur
pada medium segar.
Pada setiap metode pengukuran pertumbuhan, kultur suspensi sel
mempunyai kurve perumbuhan yang berbeda. Pada suatu kultur suspensi sel
mungkin saja didapatkan lag fase yang sangat pendek, setelah mencapai fase
stationary kemudian menurun sangat drastik, ini menunjukkan adanya sejumlah
sel yang mengalami lisis. Pada kultur yang lain setelah fase stationary kurva naik
lagi ini disebabkan karena sel-selnya membesar.
Metode sederhana untuk mengukur laju pertumbuhan pada kultur
suspensi sel dikembangkan oleh Dr. Christianson dari Michigan state Univ. Dasar
teknik ini adalah pengukuran volume sel yang terendapkan pada periode waktu
tertentu. Sebagai contoh: 50 ml suspensi sel dimasukan dalam gelas ukur atau
tabung sentrifugasi yang berskala, sel-sel dibiarkan mengendap sampai tidak
ada penambahan volume sel-sel yang mengendap. Waktu pengendapan sel
untuk setiap kali pengukuran harus sama, misalnya V30 artinya volume
pengendapan sel-sel selama 30
menit. Waktu yang diperlukan untuk
mengendapkan sel-sel ini berbeda-beda, tergantung dari tipe kultur suspensinya.
Metode ini sangat menguntungkan karena kecepatannya dan tidak ada sampel
yang terbuang.
Yang perlu diperhatikan pada proses pemeliharaan kultur suspensi sel
adalah menyeleksi tipe-tipe sel yang tumbuh dan membelah pada medium cair.
Laju pertumbuhan sel yang sangat cepat dapat diseleksi dengan sering
melakukan subkultur dengan hanya menggunakan sel-sel tunggal atau agregatagregat kecil sebagai inokulum. Untuk memisahkan sel-sel dari agregat-agregat
besar dan kecil dapat dilakukan dengan menyaring suspensi sel dengan
menggunakan nilon filter atau stainless stell filter sebelum disubkultur.
Penyaringan ini biasanya hanya dilakukan pada subkultur yang pertama,
subkultur yang kedua dan seterusnya tidak perlu dilakukan penyaringan, teknik
penyaringan ini merupakan salah satu usaha sinkroninasi pada kultur suspensi
sel.
Kultur sel yang sinkronous adalah jika sebagian terbesar dari populasi sel
melewati setiap fase dari siklus sel (Gi, S, 62 dan M) secara serentak. Untuk
mempelajari pembelahan sel dan metabolisme sel pada kultur suspensi sel,
sebaiknya digunakan kultur suspensi sel yang sinkronous, yang memperlihatkan
amplifikasi dari setiap kejadian dari siklus sel dibandingkan dengan kultur yang
tidak sinkronous. Pada umumnya kultur suspensi sel itu tidak sinkronous,
sehingga perlu dilakukan sinkronisasi. Ada dua metoda yang dapat digunakan
untuk sinkronisasi pada kultur suspensi sel:
1. Starvation, metode ini dikerjakan pertama, dengan menahan sel-sel
pada G1 atau G2 dari siklus sel dengan mengkulturkan sel-sel pada
medium starvasi hormon dan nutrien, proses pelaparan ini akan
mengakibatkan sel- sel berada pada fase pertumbuhan yang stasioner.
Setelah periode starvasi dilewati, sel-sel kemudian disubkultur dengan
medium yang mengandung nutrient penuh dan hormon, sel-sel yang
berada pada fase stationary akan membelah secara sinkronous. Kultur
suspensi sel Acer pseudoplatanus yang ditumbuhkan dengan medium
starvasi nitrogen berada pada fase stationary, dapat membelah secara
sinkronous setelah disubkultur pada medium segar yang diperkaya. Selsel yang berada pada fase stationary tertahan pada fase G1 siklus sel,
yang kemungkinan disebabkan karena ketiadaan ion nitrat pada medium
starvasi. Pada kultur sel A. pseudoplatanus dengan skala besar, derajat
sinkronitas dapat dipertahankan lebih dari lima siklus sel, seperti yang
ditunjukkan dengan adanya peningkatan jumlah sel pada setiap
tahapan sitokinesis yang berurutan. Hal serupa juga terjadi pada kultur
sel Vinca rosea yang dikulturkan pada medium starvasi phosphate
selama 4 hari kemudian ditransfer kedalam medium yang mengandung
phosphate.
2. Penghambatan
(inhibition).
Penghambat
sintesis
DNA
seperti
5-
aminouracil, FUdR, hydroxyurea, thymidine dan aphidicolin, sering
digunakan untuk sinkronisasi kultur sel. Sel-sel yang diperlakukan dengan
bahan-bahan kimia tersebut hanya akan melanjutkan siklus selnya
sampai pada fase G1 dan semua sel akan terkumpul pada batas G1/S.
Penghilangan inhibitor akan menyebabkan pembelahan sel-sel terjadi
secara sinkronous. Dengan metoda ini pembelahan sel yang sinkronous
dibatasi hanya untuk satu siklus sel.
Kultur suspensi sel memungkinkan dilakukanya seleksi sel dan membuat
klon dari sebuah sel
dengan teknik sel plating. Sel disuspensikan didalam
medium cair dengan kerapatan duakali lipat dari kerapatan akhir yang dibutuhkan
untuk sel plating. Suspensi sel kemudian dicampur dengan medium yang
mengandung agar-agar yang masih mencair (35°C) dengan perbandingan 1:1.
Gambar 5. 4. Diagram cara pembuatan sel plating
Suspensi sel yang sudah bercampur medium yang mengandung agaragar kemudian segera dituang kedalam Petridis, petridish di segel dengan
parafilm dan diinkubasi 25°C dalam kondisi gelap, koloni sel akan tumbuh dari
sebutir sel pada permukaan medium agar. Untuk penghitungan efisiensi plating
digunakan formula:
Jumlah koloni pada akhir kultur
Plating efficiency (PE) =
X 100
Jumlah awal sel/plate
Kultur suspense sel dapat diinisiasi dari kalus. Tahapan pekerjaan dapat
dilihat pada gambar 5.5.
Gambar 5.5. Pembuatan kultur suspense sel dan sel plating
Pembuatan kultur suspensi sel dan sel plating dilaksanakan dengan prosedur :
1. Kalus wortel yang dibuat seperti yang dijelaskan pada suppokok bahasan
1
2. Siapkan medium cair MS dengan zat pengatur tumbuh 2,4-D 1 mg/l
didalam Erlenmeyer 100 ml. Tiap Erlenmeyer berisi 50 ml medium cair
3. Siapkan medium MS padat dengan zat pengatur tumbuh 2,4-D 1 mg/l
didalam petridish.
4. Pilihlah kalus yang lunak dan berwarna putih cerah, timbang secara
aseptis sebanyak (1 - 1,5) gram, masukkan kalus kedalam Erlenmeyer
yang berisi medium MS cair, tutup yang rapat dan beri label.
5. Letakkan Erlenmeyer yang sudah berisi kalus pada penggojok (shaker),
atur kecepatan 120 rpm, inkubasi dilakukan pada suhu 25°C pada kondisi
gelap.
6. Setelah 2-3 minggu akan terbentuk suspensi sel, lakukan subkultur
didalam laminar air flow cabinet, dengan menyaring suspensi sel
menggunakan nilon filter porositas 80 μm, bagilah filtratnya menjadi dua
bagian, biarkan selama 30-50 menit, supaya sel-sel mengendap,
buanglah medium lama dengan cara menuang, tambahkan medium baru
sebanyak 100 ml, kembalikan salah satu Erlenmeyer yang berisi sel-sel
dengan medium baru diatas shaker.
7. Pindahkan sisa filtrate kedalam tabung sentrifugasi, endapkan dengan
kecepatan 1000 rpm selama 10 menit, buanglah supernatant.
8. Resuspensikan pellet dengan 1 ml medium cair baru, taburkan diatas
petridish yang telah berisi medium MS padat, ratakan dengan
menggoyang petridish pelan-pelan, tutuplah petridish dan segel dengan
parafilm, beri label dan tempatkan kultur didalam incubator 25°C pada
kondisi gelap.
Latihan soal-soal:
1. Jelaskan apa keuntungan digunakannya medium cair dibandingkan
dengan medium padat?
2. Jelaskan kurva pertumbuhan sel pada kultur suspensi sell
3. Kapan sebaiknya dilakukan subkultur pada kultur suspensi sel, tnengapa
4. Jelaskan bagaimana sinkronisasi pada kultur suspensi sel dikerjakan!
5. Jelaskan apa manfaat kultur suspensi sel!
Petunjuk jawaban latihan soal-soal
1. Ingat keunggulan penggunaan medium cair !
2. Ingat fase-fase pertumbuhan sel pada kultur sel !
3. Ingat tipe pertumbuhan sel pada setiap fase !
4. Ingat prinsip penghambatan siklus sel !
5. Ingat manfaat kultur sel !