Karakterisasi Fenotipik Dan Molekuler Bakteri

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Penghutanan kembali (reforestation) dengan menggunakan spesies tanaman
yang tumbuh cepat (fast-growing) merupakan salah satu solusi untuk mengatasi
masalah menurunnya area hutan, degradasi lingkungan hutan, dan menurunnya
suplai kayu dikarenakan eksploitasi hutan. Spesies tanaman yang tumbuh cepat
dapat bersifat indigenus maupun eksotik. Salah satu spesies tanaman indigenus
yang tumbuh cepat yang dengan intensif dikembangkan sebagai Hutan Tanaman
Industri (HTI) di Indonesia adalah tanaman akasia.
Menurut Hadi dan Nuhamara (1996) Pemerintah Indonesia telah memulai
program penanaman tanaman akasia dalam perkebunan skala besar sejak tahun
1984. Hal ini untuk mendukung penyediaan kayu secara berkesinambungan bagi
industri yang berbasiskan kayu dan juga mengurangi tekanan terhadap hutan
tropika. Kayu merupakan sumber energi biomassa utama bagi jutaan orang di
negara sedang berkembang. Permintaan akan kayu meningkat setiap tahunnya
seiring meningkatnya jumlah penduduk (World Wide Wattle 2004).
Tanaman akasia (Acacia sp.) telah ditanam di lebih dari 80 negara di dunia
termasuk Indonesia. Tanaman akasia ini dapat digunakan untuk berbagai
keperluan seperti diambil kayunya, diolah menjadi bubur kayu (wood pulp),
kertas, bahan bakar (fuel), dan sebagainya (Eldoma dan Awang 1999). Daya
adaptasinya yang luas baik pada ekosistem sangat basah maupun sangat kering,
kemampuannya bersimbiosis dengan bakteri tanah yang dapat menfiksasi
nitrogen, pertumbuhan, hasil, dan kualitas yang lebih baik, menjadikan tanaman
akasia sebagai tanaman yang sangat menjanjikan untuk diusahakan secara luas
(Eldoma dan Awang 1999; Old et al. 1999).
Beberapa spesies tanaman akasia yang dikembangkan di Indonesia adalah
Acacia auriculiformis, A. mangium, A. crassicarpa, dan A. aulacocarpa (Zulfiyah
dan Gales 1996; Hadi dan Nuhamara 1996). Dalam usaha pembibitannya banyak
kendala yang dihadapi dan salah satunya adalah gangguan serangan hama dan
patogen. Beberapa
penyakit yang sering menyebabkan kerusakan pada
pembibitan tanaman akasia adalah karat tumor (gall rusts), embun tepung
2
(powdery mildew), becak daun (leaf spot), rebah semai (damping-off), nekrosis
pucuk (tip necrosis) (Hadi dan Nuhamara 1996), dan hawar daun (Budi Tjahjono
2004, komunikasi pribadi). Berdasarkan pengamatan mikroskopik terhadap
jaringan daun yang terinfeksi hawar didapatkan tanda penyakit berupa aliran ooze
bakteri dari potongan daun yang bergejala.
Penyakit hawar daun bakteri (bacterial leaf blight) merupakan salah satu
penyakit yang dijumpai pada pembibitan tanaman Acacia crassicarpa di Riau.
Penyebab penyakit hawar daun bakteri ini hanya menyerang bibit tanaman
A. crassicarpa (inang spesifik) dan tidak menyerang spesies tanaman akasia yang
lain
termasuk
tanaman
eucalyptus,
meskipun
mereka
ditanam
secara
berdampingan di pembibitan (Budi Tjahjono 2004, komunikasi pribadi).
Penyakit hawar daun bakteri ini merupakan penyakit baru pada pembibitan
tanaman A. crassicarpa di Indonesia (khususnya ditemukan di pembibitan
tanaman akasia di Riau) karena belum dilaporkan keberadaannya baik di
Indonesia maupun negara lain yang menanam tanaman akasia. Penyakit ini
muncul sejak tahun 2003 dan menyebabkan kerugian yang cukup signifikan
dalam pengadaan bibit tanaman akasia.
Beberapa usaha pengendalian terhadap penyakit hawar daun bakteri sudah
dilakukan di pembibitan tanaman A. crassicarpa diantaranya penjarangan
(spacing), perlakuan benih, penggunaan bakterisida, sanitasi lingkungan,
penggunaan mikrob antagonis Pseudomonas fluorescens, Trichoderma spp. dan
Bacillus subtilis. Usaha pengendalian yang dilakukan dengan menggunakan
bakterisida antara lain Agrept 20 WP dan Kasumin 5/75 WP dengan interval
penyemprotan seminggu dan konsentrasi 2,5 - 5,0 g/l belum mampu menekan
perkembangan penyakit ini (Budi Tjahjono Agustus 2004, komunikasi pribadi).
Usaha pengendalian yang telah dilakukan nampaknya belum menunjukkan
hasil yang optimal. Hal ini terlihat dari masih tingginya kejadian penyakit di
pembibitan sehingga dari 5 juta bibit yang harus disediakan per bulan hanya 3-4
juta (tahun 2004) dan 1 (satu) juta (tahun 2005) yang mampu diproduksi (Budi
Tjahjono Juni 2005, komunikasi pribadi). Kerugian yang ditimbulkan ini berkisar
20 - 80%. Bagi perusahaan yang harus menyediakan bibit dalam jumlah besar
angka ini sangat meresahkan. Meskipun serangan patogen penyebab penyakit
3
hawar daun ini tidak mengakibatkan matinya bibit tanaman akasia, namun
kerugian yang ditimbulkan cukup besar karena menurunnya kualitas bibit yang
dihasilkan. Tanaman akasia di pembibitan yang terinfeksi hawar daun sampai
20% masih tetap dapat ditanam di lapang dan tanaman menjadi tahan terhadap
penyakit ini dengan semakin bertambahnya umur tanaman.
Sampai sekarang ini belum dikarakterisasi dan diidentifikasi bakteri patogen
yang menyebabkan penyakit hawar daun pada bibit tanaman A. crassicarpa ini.
Untuk itu perlu dilakukan karakterisasi dan identifikasi dari bakteri penyebab
penyakit hawar daun pada bibit tanaman A. crassicarpa baik karakteristik
fenotipik maupun molekulernya.
Diagnosis suatu penyakit baru atau yang belum terdapat dalam daftar
penyakit yang sudah baku dapat dilakukan dengan dua cara (Hayward 1983;
Lelliott dan Stead 1987). Pertama, cara diagnosis pendugaan
(presumtive
diagnosis) untuk mendapatkan informasi yang cepat tentang penyakit baru
tersebut sehingga metode pengendalian yang memadai dapat direkomendasikan.
Cara diagnosis pendugaan yang cepat ini biasanya sangat dibutuhkan oleh petani
hortikultura. Pengamatan berdasarkan pada gejala, karakteristik koloni patogen
pada media isolasi, dan sejumlah kecil uji kunci termasuk dalam cara diagnosis
pendugaan yang cepat. Kedua, cara diagnosis konfirmasi (confirmatory diagnosis)
untuk mendapatkan identifikasi yang akurat sehingga memenuhi standar daftar
penyakit dan diterima oleh komunitas keilmuan yang ada. Identifikasi patogen
baik secara fisiologi maupun molekuler dan pengujian pada inang termasuk dalam
cara diagnosis konfirmasi ini.
Pengamatan gejala dan tanda penyakit merupakan langkah awal dalam
diagnosis suatu penyakit baru. Akan tetapi, pengamatan gejala penyakit saja tidak
cukup untuk mengidentifikasi suatu penyakit. Oleh karena itu, untuk memperoleh
hasil diagnosis yang akurat perlu dilakukan uji postulat Koch. Postulat Koch
bertujuan untuk mengetahui apakah suatu patogen yang diisolasi dari tanaman
yang terinfeksi penyakit baru tersebut memang benar merupakan penyebab dari
gejala penyakit yang ditimbulkannya. Langkah postulat Koch tersebut antara lain:
patogen harus ditemukan berasosiasi dengan tanaman sakit yang diuji, patogen
harus dapat diisolasi dan ditumbuhkan sebagai kultur murni pada media nutrisi
4
(untuk parasit non-obligat) atau harus ditumbuhkan pada tanaman inang rentan
(untuk parasit obligat), patogen dari kultur murni tersebut harus diinokulasikan
pada tanaman sehat dari spesies yang sama atau varietas yang menunjukkan gejala
penyakit tersebut dan harus menghasilkan penyakit yang sama pada tanaman yang
diinokulasikan, dan langkah terakhir adalah patogen harus dapat diisolasi kembali
sebagai kultur murni dengan karakteristik yang sama seperti isolasi pertama
(Agrios 1997).
Karakterisasi bakteri patogen secara fenotipik penting untuk mendapatkan
gambaran tentang bakteri patogen seperti morfologi sel dan koloni maupun
karakter fisiologi dan biokimianya. Identifikasi secara biokimia dan fisiologi
berdasarkan pada metabolisme senyawa-senyawa tertentu seperti uji reaksi gram,
uji fluoresens, uji oksidase, uji oksidatif/fermentatif, uji urease, dan sebagainya
bertujuan untuk mengetahui identitas genus dan spesies bakteri penyebab penyakit
hawar daun pada bibit tanaman A. crassicarpa (Hayward 1983a; Schaad 2001).
Selain analisis fenotipik, analisis secara molekuler perlu dilakukan untuk
konfirmasi identifikasi secara non-molekuler yang telah dilakukan. Menurut
Suwanto (1994) hasil analisis fenotipik seperti uji fisiologi atau biokimia sering
sangat dipengaruhi oleh faktor lingkungan atau kondisi sel itu sendiri. Metoda
molekuler yang berbasiskan DNA memiliki keuntungan karena keakuratan
identifikasi tidak tergantung pada kondisi lingkungan, umur, atau sifat fisiologi
dari patogen, namun lebih tergantung pada kualitas DNA yang diekstraksi (Louws
dan Cuppels 2001). Identifikasi secara molekuler ini penting untuk mendapatkan
gambaran yang akurat tentang penyebab penyakitnya. Selain itu, untuk tujuan
jangka panjang informasi ini akan berguna sebagai dasar untuk penelitian
selanjutnya.
Teknik molekuler yang digunakan untuk mendukung identifikasi bakteri
secara non-molekuler adalah menggunakan sekuensing gen 16Sr-RNA. Hal ini
karena ribosomal RNA ada pada semua organisme dan merupakan target molekul
yang baik. Sekuensing gen 16Sr-RNA dapat dilakukan dengan mengamplifikasi
bagian 16Sr-RNA dari DNA dengan menggunakan teknik PCR (polymerase chain
reaction) dan primer universal untuk prokaryot. Produk amplifikasi PCR dapat
langsung disekuen atau dipurifikasi dahulu dan diligasikan ke dalam vektor. Hasil
5
sekuensing dapat dianalisis dengan menggunakan database internet dengan
menggunakan fasilitas program BLAST (Dickstein et al. 2001). Hasil analisis
dengan program BLAST ini dapat menunjukkan apakah spesies bakteri yang
menyebabkan penyakit hawar daun pada bibit tanaman A. crassicarpa sama
dengan spesies yang sudah ada atau merupakan spesies baru.
Deteksi
dan
identifikasi
secara
non-molekuler
berdasarkan
pada
karakterisasi morfologi sel maupun koloni, uji fisiologi dan biokimia termasuk uji
patogenisitas dari patogen biasanya membutuhkan waktu yang lama. Dengan
makin berkembangnya teknik identifikasi patogen baik teknik serologi maupun
teknik molekuler maka waktu yang dibutuhkan untuk deteksi dan identifikasi
patogen jauh lebih cepat, akurat, spesifik, dan sensitif. Contohnya, untuk
mendeteksi Pseudomonas avellanae agen penyebab menurunnya hazelnut di
Northern Greece dan central Italy membutuhkan sedikitnya 6-7 bulan untuk
identifikasi patogen secara lengkap berdasarkan teknik tradisional, sedangkan
dengan menggunakan teknik repetitive-PCR dengan primer ERIC hanya
dibutuhkan 4-6 hari (Scortichini dan Marchesi 2001).
Pengadaan bibit tanaman A. crassicarpa dalam jumlah banyak dan secara
terus menerus sepanjang tahun dapat memicu ledakan (epidemi) penyakit di
pembibitan tanaman akasia. Menurut Sinaga (2003) beberapa faktor yang dapat
menyebabkan terjadinya epidemik penyakit adalah tersedianya inang secara
berkesinambungan dan bersifat rentan, adanya patogen yang virulen, dan adanya
faktor lingkungan yang mendukung perkembangan patogen. Untuk itu perlu dikaji
beberapa faktor yang dapat meningkatkan perkembangan penyakit di pembibitan
tanaman A. crassicarpa.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk: (1) mendeskripsikan perkembangan gejala
penyakit hawar daun bakteri serta pembuktian uji Postulat Koch, (2) mengetahui
morfologi bakteri dan mengidentifikasi bakteri penyebab penyakit hawar daun
pada bibit tanaman A. crassicarpa dengan cara uji fisiologi dan biokimia, (3)
mengidentifikasi bakteri penyebab penyakit hawar daun pada bibit tanaman
A. crassicarpa dengan teknik molekuler, (4) mengetahui pengaruh kultur teknis
6
terhadap perkembangan penyakit hawar daun bakteri pada bibit tanaman
A. crassicarpa, (5) mengetahui populasi bakteri patogen hawar daun di sekitar
tanaman inang, (6) mengetahui pengaruh curah hujan dan bibit asal biji dan stek
terhadap perkembangan penyakit hawar daun bakteri pada bibit tanaman
A. crassicarpa.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan berguna dalam menyediakan informasi dasar
tentang
bakteri
penyebab
penyakit
hawar
daun
pada
bibit
tanaman
A. crassicarpa terutama tentang spesies yang menyerang, karakteristik fenotipik
dan molekuler, serta faktor yang mempengaruhi terjadinya epidemi penyakit.
Informasi ini diharapkan dapat membantu dalam menyusun pengelolaan penyakit
yang tepat.
Strategi Penelitian
Strategi penelitian yang ditempuh untuk mencapai tujuan penelitian yang
sudah diuraikan tersebut meliputi kelompok tahapan penelitian sebagai berikut:
(1) survei, koleksi, isolasi dan uji postulat Koch bakteri penyebab penyakit hawar
daun pada bibit tanaman A. crassicarpa, (2) karakterisasi dan identifikasi bakteri
penyebab penyakit hawar daun pada bibit tanaman A. crassicarpa dengan uji
fisiologi dan biokimia dan dengan teknik molekuler, (3) kajian faktor epidemik
penyakit hawar daun bakteri. Bagan alur dari strategi penelitian disajikan pada
Gambar 1.
7
Penyakit Hawar Daun Bakteri
Pada Tanaman Acacia crassicarpa
Masalah di Pembibitan
Pengamatan Gejala dan
Perkembangan Penyakit
Kajian Epidemi
Penyakit
Koleksi tanaman sakit dan isolasi
bakteri patogen hawar daun
Isolat Murni
Patogen Hawar daun
Uji Postulat
Koch
Identifikasi Bakteri
Patogen Hawar Daun
Uji morfologi,
Uji Fisilogi
dan Biokimia
*Pengaruh kultur
teknis
*Deteksi patogen
pada benih, air,
dan media tanam
*Pengaruh curah
hujan
*Pengaruh bibit
asal biji & stek
Uji Molekuler
Isolasi DNA
Uji Genus
PCR dan
Purifikasi DNA
Uji Spesies
Sekuen Gen
16S-rRNA
Spesies
teridentifikasi
Program BLAST
Spesies Sama/Baru
Informasi Dasar
Gambar 1. Bagan kerangka alur penelitian