Bab II Tinjauan Pustaka

4
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian meliputi pengambilan dan sterilisasi sampel, isolasi DNA
genom pada jaringan tanaman padi, amplifikasi gen 16S rRNA dan gen nifH,
analisis keragaman menggunakan teknik DGGE dan konstruksi pohon filogenetik.
TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Padi
Padi merupakan tanaman yang memiliki karakteristik tipe rumput dengan
umpun kuat, termasuk tumbuhan annual (berumur 1 tahun), tinggi tanaman
bervariasi antara 1,5-2 m, helaian daun berbentuk garis (linearis) dengan tepi yang
kasar dan panjangnya 15-80 cm. Tanaman padi memiliki malai dengan panjang
15-40 cm yang tumbuh keatas dengan ujung menggantung. Buah tanaman padi
tersusun atas bulir yang memiliki bentuk beragam, panjang bulir 7-10 mm dan
memiliki lebar ± 3 mm. Buah tanaman padi ini mengandung pati (van Steenis et
al. 2008).
Pengelompokan tanaman padi secara taksonomi adalah sebagai berikut
Dasuki (1991):
Dunia
: Plantae
Kelas
: Monocotyledoneae
Sub-Kelas
: Commelinidae
Ordo
: Cyperales
Famili
: Poaceae
Genus
: Oryza
Spesies
: Oryza sativa
Fiksasi Nitrogen
Fiksasi nitrogen merupakan proses pengubahan dinitrogen (N2 atau N N)
menjadi amonia (NH3) yang berguna untuk pertumbuhan tanaman. Reaksi yang
terjadi pada semua mikrob pemfiksasi nitrogen dalam proses fiksasi gas nitrogen
dikatalisis oleh enzim nitrogenase (Kaminski et al. 1998). Nitrogenase terdiri atas
2 jenis komponen protein yang sensitif terhadap oksigen. Komponen 1
(dinitrogenase) terdiri atas protein besi-molibdenum yang mengandung 2 subunit.
Komponen 2 (dinitrogenase reduktase) terdiri atas protein besi-sulfur yang
mentransferkan elektron pada dinitrogenase. Protein-protein ini beserta ATP,
Mg2+, dan sumber elektron merupakan komponen-komponen yang esensial dalam
aktivitas fiksasi N2 (Moat et al. 2002).
Nitrogenase memerlukan donor elektron dari adenosin-3-fosfat (ATP)
untuk memulai proses fiksasi nitrogen. Elektron dihasilkan secara in vivo, baik
secara oksidatif maupun fotosintetik. Siklus oksidasi-reduksi dimulai ketika
elektron ini ditransfer ke flavodoxin atau ferredoxin, (4Fe-4S) yang mengandung
5
elektron carrier yang mentransfer elektron ke protein Fe dari nitrogenase. Dua
molekul MgATP terikat pada Fe protein yang tereduksi dan dihidrolisis untuk
menghasilkan elektron yang akan ditransfer ke protein FeMo. Proses reduksi
molekul N2 terjadi pada protein FeMo melalui beberapa tahapan reaksi. Transfer
elektron harus terjadi sebanyak enam kali pada setiap molekul N2 yang difiksasi.
Oleh karena itu total ATP yang dibutuhkan untuk memfiksasi molekul N2 yaitu 12
ATP, akan tetapi nitrogenase juga mereduksi proton menjadi H2. Reaksi tersebut
menggunakan dua elektron, sehingga total energi yang digunakan untuk
mereduksi molekul N2 menjadi NH3 yaitu 8 elektron yang ditransfer dan 16
MgATPs yang dihidrolisis (Cheng 2008).
Enzim nitrogenase merupakan enzim yang diekspresikan ketika N2
merupakan sumber nitrogen satu-satunya, karena gen yang menyandikan fiksasi
nitrogen dihambat oleh sumber nitrogen yang disuplai secara eksogen (contoh:
amonia) (White 2000). Kompleks nitrogenase mengandung dua protein yang
terpisah. Komponen 1 (dinitrogenase) merupakan komponen yang terdiri atas
empat sub unit 240 kDa yang disandikan oleh gen nifD dan nifK. Kofaktor besimolibdenum (FeMo-co) dari dinitrogenase disintesis oleh beberapa gen nif (nif Q,
B, V, N, E). Komponen 2 (dinitrogenase reduktase, disandikan oleh gen nifH)
merupakan protein yang terdiri atas 2 subunit 60 kDa. Protein ini mengandung
kluster besi-belerang (Fe4S4) pada bagian tengahnya (Moat et al. 2002). Gen yang
beperan mengekspresikan kemampuan fiksasi nitrogen (nif) telah dikaji dengan
baik pada Klebsiella pneumonia (Madigan et al. 2012), sehingga regulasi gen-gen
nif pada bakteri ini dijadikan model yang sangat baik untuk bakteri yang memiliki
kemampuan memfiksasi nitrogen. Regulasi gen-gen nif pada K. pneumoniae
diatur oleh operon nifLA. Protein NtrC mengaktivasi transkripsi operon nifLA
dibawah kondisi nitrogen yang terbatas. Protein nifA merupakan regulator positif
yang berperan sebagai faktor yang dibutuhkan untuk transkripsi gen nif. Produk
gen nifL berpengaruh dengan protein nifA untuk mencegah aktivasi nifA ketika
tersedianya produk fiksasi nitrogen (amonia atau asam amino) atau oksigen.
Fungsi nifZ, W, U, S, X, dan T masih belum diketahui secara jelas. Akan tetapi,
ada bukti yang menyatakan bahwa produk gen nifW dan nifZ terlibat dalam proses
salah satu komponen nitrogenase dan produk gen nifX merupakan regulator
positif pada regulasi nif ketika merespon adanya asam amino dan oksigen (Moat
et al. 2002).
Fragmen spesifik gen nifD dan nifH dari K. pneumoniae merupakan gengen yang memiliki sekuens yang konservatif pada semua mikrob pemfiksasi
nitrogen (Kaminski et al. 1998). Gen nifH sering digunakan sebagai penanda
molekuler suatu mikrob yang dapat memfiksasi nitrogen karena memiliki basis
data sekuen non-ribosomal terbesar dari berbagai mikrob. Selain itu gen ini telah
digunakan pada berbagai jenis primer dan mampu mengamplifikasi dengan baik
sampel dari lingkungan maupun mikrooganisme secara langsung (Zehr et al.
1989). Gen nifH memperlihatkan keunikan filogenetik sehingga dapat dibuat
hubungan kekerabatan dari mikrob diazotrof. Penelitian terdahulu mengenai
analisis keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen pada tanah sawah di Sukabumi
dengan menggunakan penanda molekuler gen nifH dan nifD menunjukkan bahwa
hasil analisis keragaman menggunakan penanda gen nifH lebih beragam
dibandingkan dengan gen nifD (Munjiati 2013). Hasil tersebut mengindikasikan
bahwa sekuen gen nifH tidak hanya memiliki situs yang conserved, melainkan
6
juga memiliki situs variatif yang lebih bervariasi dibandingkan dengan gen nifD,
sehingga penanda gen ini sangat baik digunakan untuk analisis keragaman bakteri
pemfiksasi nitrogen. Analisis keragaman mikrob pemfiksasi nitrogen pada rizosfer
dan akar rumput endemik (Lasiurus sandicus) yang tahan terhadap kekeringan
asal gurun Thar, India telah dilakukan dengan menggunakan primer spesifik gen
nifH. Hasil penelitian tersebut berhasil menemukan dominasi suatu sekuens nifH
yang berkerabat dekat dengan Pseudomonas pseudoalcaligens. Selain itu,
beberapa sekuen nifH memiliki kesamaan dengan diazotrof yang dapat dikultivasi
seperti Azospirillum brasilense, Rhizobium spp. dan berbagai macam bakteri
pemfiksasi nitrogen yang tidak dapat dikulturkan (Chowdury et al. 2009). Dua
aktinomiset endofit pada akar tanaman Casuarina equisetifolia asal Meksiko telah
berhasil diisolasi dan termasuk ke dalam anggota genus Thermomonospora dan
Micromonospora. Kedua aktinomiset terebut memiliki kemampuan menambat
nitrogen karena dapat tumbuh pada media tanpa nitrogen. Selain itu hasil
amplifikasi dengan menggunakan primer spesifik gen nifH menunjukkan adanya
kemiripan dengan gen nifH pada genus Frankia (Valdes et al. 2005).
Penelitian mengenai bakteri pemfiksasi nitrogen telah banyak dilakukan
termasuk dengan teknik DGGE. Analisis keragaman dengan teknik DGGE telah
mampu menggambarkan keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen yang ada pada
lingkungan. Penelitian yang ada saat ini lebih kearah bakteri pemfiksasi nitrogen
yang ada pada tanah. Penelitian mengenai bakteri pemfiksasi nitrogen yang ada
pada tanah rizosfer dan jaringan akar tanaman padi serta pengaruh tipe
agroekosistem masih belum ada kajian lebih lanjutnya. Sehingga sangat penting
untuk mengetahui keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen yang ada pada tanah
rizosfer dan jaringan akar tanaman padi agar dapat melengkapi informasi yang
ada. Beberapa penelitian mengenai keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen yang
dianalisis dengan teknik DGGE dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen pada tanah rizosfer
Sampel
Diazotrof
Referensi
Tanah Rizosfer
Uncultured
nitrogen-fixing Wartiainen et al. 2008
tanaman padi di
bacterium
Provinsi Fujian,
Uncultured bacterium clone nifH
Cina
gene. Rhizosphere soil
Uncultured bacterium clone
Diazotrophic
rhizosphere
community, Bt-transgenic white
spruce
Endophytic Azoarcus wild rice
Azoarcus kallar grass endophyte
Diazotrophs associated with rice
roots
Uncultured endophytic bacterium
clone associated with maize
Azonexus caeni
Methylococcus capsulatus Bath
Rhizobium daejeonese
Sphingomonas azotifigens
7
Tabel 1 Keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen pada tanah rizosfer (Lanjutan)
Sampel
Diazotrof
Referensi
Tanah rizosfer Uncultured bacterium clone IS110
Coelho et al.
tanaman
EU048166.1
2009
gandum
Uncultured bacterium clone IPA74
(Sorghum
EU048016.1
bicolor) di
Klebsiella pneumoniae AY242355.1
Brazil
Azohydromonas lata AB188122.1
Uncultured
bacterium
clone
IS98
EU048155.1
Klebsiella pneumoniae AY242355.1
Uncultured
bacterium
clone
IS92
EU048149.1
Uncultured
bacterium
clone
IS41
EU048099.1
Uncultured bacterium clone DQ995905.1
Uncultured bacterium clone IPA69
EU048011.1
Tanah pertanian
hortikultura di
Shanghai, Cina
Rhizobium sp. (GQ241353.1)
Bradyrhizobium japonicum (GQ289565.1)
Azospirillum brasilense (GQ161239.1)
Azospirillum amazonense (GU256445.1)
Azospirillum lipoferum (FQ311868.1)
Sphingomonas azotifigens (AB217474.1)
Burkholderia xenovorans (EF158805.1)
Azohydromonas lata (AB188122.1)
Azoarcus sp. BH72 (AM406670.1)
Dechloromonas sp. (AJ563286.1)
Zoogloea oryzae (AB201045.1)
Azonexus hydrophilus (EF626685.1)
Rhodocyclales Azospira oryzae (U97115.2)
Azoarcus indigens (U97118.2)
Sideroxydans lithotrophicus (CP001965.1)
Methylocaldum szegediense (DQ002937.1)
Acinetobacter sp. (EU693341)
Ectothiorhodospira sp. (HM149325.1)
γ-Proteobacterium BAL281 nifH isolate
(AY972874.1)
Anabaena sp. (HQ836199.1)
Uncultured bacterium (EU048119.1)
Uncultured bacterium (HQ335575.1
Uncultured bacterium (GU097336.1)
Perez et al. 2014
8
Mikrob Endofit
Mikrob endofit merupakan mikrob yang hidup di dalam jaringan tanaman,
akar, batang, daun, dan buah selama periode tertentu dari siklus hidupnya (Tan
dan Zou 2001). Mikrob endofit membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa
membahayakan inangnya. Pada satu jaringan tanaman kemungkinan ditemukan
beberapa jenis mikrob endofit (Strobel dan Daisy 2003). Hampir setiap tanaman
tingkat tinggi memiliki beberapa mikrob endofit yang mampu menghasilkan
senyawa bioaktif atau metabolit sekunder. Salah satu mikrob endofit yang mulai
dikembangkan terutama dalam bidang kesehatan dan pertanian yaitu aktinomiset.
Aktinomiset merupakan kelompok bakteri gram-positif yang memiliki filamen
dan tergolong bakteri yang memiliki komposisi basa nitrogen GC yang tinggi
yaitu >55% (Miyadoh 1997). Sebagian besar aktinomiset membentuk spora dan
hal ini dapat digunakan sebagai dasar identifikasi. Aktinomiset secara taksonomi
termasuk dalam Kelas Actinobacteria, Sub-kelas Actinobacteridae, Ordo
Actinomycetales, dan berdasarkan klasifikasi molekuler terbagi dalam 10 Subordo (Stackebrandt et al. 1997).
Aktinomiset telah diketahui mampu menghasilkan beragam metabolit
sekunder dengan beragam fungsi biologi seperti antimikrob dan enzim
pendegradasi bahan organik. Oleh karena itu aktinomiset digunakan sebagai agen
biokontrol dan mampu menginduksi tanaman menjadi tahan terhadap penyakit
(Hasegawa et al. 2006). Beberapa penelitian telah menunjukkan hasil yang
mendukung pendapat tersebut. Streptomyces spp. yang diisolasi dari rizosfer
mampu menghasilkan senyawa metabolit yang dapat menghambat pertumbuhan
mikrob patogen tular tanah (Lestari 2006). Streptomyces sp. juga dilaporkan
mampu menekan perkembangan penyakit hawar daun bakteri pada tanaman padi
yang disebabkan oleh X. oryzae pv. oryzae. Kemampuan isolat yang diperoleh ini
juga menunjukkan spektrum penghambatan yang cukup luas karena mampu
menghambat mikrob kompetitor lainnya, seperti bakteri Gram positif dan Gram
negatif serta fungi patogen (Hastuti et al. 2012b). Aktinomiset endofit PM5 telah
diketahui mampu menghasilkan senyawa antifungi alifatik dengan unit lakton dan
keton karbonil yang dapat menghambat pertumbuhan miselia Pyricularia oryzae
dan Rhizoctonia solani pada tanaman padi (Prabavathy et al. 2006). Penelitian
mengenai keragaman aktinomiset lebih banyak pada aktinomiset yang dapat
dikulturkan, sedangkan keragaman aktinomiset yang tidak dapat dikulturkan
belum banyak diketahui. Selain itu belum ada informasi mengenai keragaman
aktinomiset pada berbagai tipe agroekosistem pada tanaman padi. Oleh karena itu
penelitian ini sangat penting untuk melengkapi data mengenai keragaman
aktinomiset endofit pada tanaman padi asal Indonesia baik yang dapat
dikulturkan, maupun yang tidak dapat dikulturkan. Beberapa penelitian mengenai
keragaman aktinomiset dapat dilihat pada Tabel 1.
9
Tanaman inang
Akar dan daun
tanaman padi
asal Provinsi
Guangdong,
Cina
Tanaman tropis
asal Papua
New Guinea
dan Pulau
Solomon
Tabel 2 Keragaman aktinomiset pada berbagai tanaman
Aktinomiset endofit
Referensi
Culturable
Unculturable
S. cyaneus
Tian et al.
S. cyaneus
2007
S. exfoliates
S. lanatus
S. aurantiacus
S. galilaeus
S. paresii
Streptomyces sp.
S. glauciniger
S. turgidiscabies
S. kathirae
S. thermocarboxydus.
S. caviscabies
S. laceyi
S. scabies
Janibacter sp.
Actinomycete NK951
N. simplex
N. thermolilacinus
Mycobacterium sp.
Actinomycetales bacterium M. anthracenicum
M. chitae
M. rhodesiae
M. fortuitum
Micromonospora sp.
Corynebacterium sp.
Rhodococcus sp.
Actinoplanes sp.
Frankia sp.
Amycolatopsis sp.
Dactylosporangium sp.
Lechevalieria
Lentzea
Actinoplanes
Dactylosporangium
Amycolatopsis
Kibdelosporangium
Pseudonocardia
Kitasatospora
Streptomyces
Microbispora
Nonomuraea
Planotetraspora
Sphaerisporangium
Streptosporangium
Thermomonosporaceae
-
Janso dan
Carter
2010
10
Tabel 2 Keragaman aktinomiset pada berbagai tanaman (Lanjutan)
Aktinomiset endofit
Tanaman inang
Referensi
Culturable
Unculturable
Akar tanaman
Microbacterium sp.
Patrick et
tomat (Physalis M. foliorum
al. 2010
ixocarpa) asal Cellulomonas sp.
Meksiko
C. xylanilitica
20 Tanaman
padi asal India
Streptomyces albosporus
S. cinereus
S. flavus
S. globisporus
S. roseosporus
S. hygroscopicus
S. lavendulae
S. viridis
S. griseorubroviolaceus
Actinopolyspora sp.
Micromonospora sp.
Nocardia sp.
Saccharopolyspora sp.
-
Gangwar
et al.
2012
Akar tanaman
dataran pasang
surut asal Korea
Micrococcus
Mycobacterium
Microbacterium
-
Bibi et al.
2012
Daun tanaman
Spermacoce
verticillata
(Rubiaceae)
Microbispora sp.
Streptomyces sp.
Nocardia sp.
-
Conti et
al. 2012
Metagenom
Metagenom didefinisikan sebagai aplikasi teknik genom modern untuk
mempelajari komunitas organisme mikrob secara langsung pada lingkungan
alaminya, tanpa melewati tahapan isolasi dan pengayaan di laboratorium (Chen
dan Pachter 2005; Patrick dan Handelsman 2005). Metode analisis metgenom
telah berkembang menjadi pendekatan yang sangat efektif untuk penemuan
produk alami baru dan fungsi mikrob (He et al. 2007). Pada awalnya, target utama
studi metagenom yaitu mikrob yang tidak dapat dikulturkan dan DNA purba.
Namun pada saat ini teknologi metagenom di aplikasikan pada penelitian yang
mengkaji susunan keragaman mikrob (Shanks et al. 2006). Hanya 0.001-0.1%
dari seluruh total mikrob di air laut, 0.25% di air tawar, 0.25% di sediment, dan
hanya 0.3% mikrob tanah yang dapat dikulturkan secara in vitro (Amann et al.
1995; Singh et al. 2008). Pada zaman sekarang penelitian metagenom telah sangat
11
berkembang karena adanya perancangan (construction) vektor kloning gen seperti
kromosom artifisial bakteri (Bacterial Artificials chromosomes (BACs) atau
kosmid (Xu 2006; Babcock et al. 2007) yang memungkinkan untuk mengkloning
dan mengekspresikan segmen DNA yang besar dan kompleks (Singh et al. 2008).
Prinsip analisis keragaman secara metagenomik berdasarkan analisis DNA
yang diambil secara langsung dari lingkungan. Saat ini beberapa gen telah
digunakan sebagai penanda molekuler bagi kelompok prokariot, dan yang paling
banyak digunakan adalah gen penyandi 16S rRNA. Gen ini bersifat ubikuitus
hanya pada kelompok prokariot sehingga dapat menjadi penanda universal yang
spesifik untuk kelompok prokariot. Gen 16S rRNA dapat digunakan sebagai
penanda molekuler karena molekul ini bersifat ubikuitus dengan fungsi yang
identik pada seluruh organisme. Molekul ini juga dapat berubah sesuai jarak
evolusinya, sehingga dapat digunakan sebagai kronometer evolusi yang baik
(Stackebrandt dan Goebel 1994). Molekul 16S rRNA memiliki beberapa daerah
yang memiliki urutan basa yang relatif konservatif dan beberapa daerah urutan
basanya variatif. Perbandingan urutan basa yang konservatif berguna untuk
mengkonstruksi pohon filogenetik universal karena mengalami perubahan relatif
lambat dan mencerminkan kronologi evolusi bumi. Sebaliknya, urutan basa yang
bersifat variatif dapat digunakan untuk melacak keragaman dan menempatkan
galur-galur dalam satu spesies. Selain gen 16S rRNA, gen nif juga memiliki
sekuens yang konservatif pada semua mikrob pemfiksasi nitrogen, sehingga dapat
digunakan untuk mengetahui keragaman mikrob pada suatu sampel lingkungan
(Kaminski et al. 1998).
Beberapa teknik berbasis molekuler yang digunakan untuk menganalisis
keanekaragaman mikrob adalah Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
(DGGE), Fluorescent in-situ Hybridization (FISH), Terminal Restriction
Fragment Length Polymorphism (TRFLP) dan Amplified Ribosomal DNA
Restriction Analysis (ARDRA) (Marsh et al. 2000). Analisis keragaman genetika
yang sederhana untuk menelaah keanekaragaman dapat dilakukan dengan teknik
ARDRA. ARDRA dan TRFLP merupakan metode yang paling sering digunakan,
akan tetapi metode ini memiliki kelemahan yaitu teknik ARDRA memiliki
keterbatasan dalam hal kepraktisan, dibutuhkan pustaka gen 16S rRNA dalam
ukuran yang besar untuk menggambarkan keragaman mendekati kergaman yang
sebenarnya di alam. TRFLP memiliki keterbatasan yaitu data yang kurang
representatif karena fragmen yang dianalisis hanya pada bagian ujung 5’ dari
produk amplifikasi saja, sehingga ada kemungkinan berbagai kelompok besar
bakteri yang berbeda hanya memunculkan satu macam TRF (Pangastuti 2008).
Oleh karena itu, dalam penelitian ini menggunakan teknik DGGE dikarenakan
oleh kesederhanaan dan kepraktisan untuk menganalisis komunitas mikrob secara
langsung. Selain itu penggunaan teknik ini dapat memisahkan fragmen yang
memiliki panjang sama tetapi urutan basa berbeda. Dengan demikian, sekuen
DNA yang berbeda, bahkan perbedaan hanya satu pasang basa nukleotida, akan
muncul sebagai pita pada posisi yang berbeda di dalam gel poliakrilamida
(Muyzer dan Smalla 1998).
Penggunaan DGGE telah berhasil digunakan untuk mendeteksi komunitas
aktinomiset pada tanah di pulau Barrientos (Learn-Han et al. 2012). Teknik
DGGE juga dapat dimanfaatkan untuk memonitor komunitas bakteri selama
proses eksperimen bioremidiasi pada tumpahan minyak di pesisir pulau Pari