TUGAS KULIAH FISIOLOGI MOLEKULAR

1 TUGAS KULIAH FISIOLOGI MOLEKULAR KHAIRUL ANAM P051090031/BTK BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010 2 TUGAS FISIOLOGI MOLEKULER
KHAIRUL ANAM (P051090031/BTK)
1. Apa yang anda ketahui tentang kematian sel terprogram? Dimana dan kapan proses
tersebut terjadi selama siklus hidup tumbuhan?
Kematian sel terprogram (programmed cell death/ PCD) merupakan kematian sel yang
dikendalikan oleh organisme sebagai bagian dari proses pertumbuhan dan perkembangan,
termasuk di dalamnya mekanisme inisiasi dan eksekusi.
Dua contoh dari PCD antara lain kematian sel akibat senesen dan akibat respon
hipersensitivitas. Sense merupakan proses kematian terprogram yang sangat lambat dari suatu
jaringan pada akhir dari waktu hidupnya. Sedangkan akibat dari hipersensitivitas, PCD
berlangsung lebih cepat untuk mempertahankan diri dari penyakit yang diakibatkan patogen.
3 Selama siklus hidup tumbuhan, kematian sel terprogram terjadi pada saat:
•
Pembentukan gamet, termasuk pembentukan megaspora di bunga (1).
•
Perkembangan embrio, misalnya degenerasi suspensor pada bunga (2).
•
Degenerasi jaringan pada biji dan buah. Misalnya kematian terprogram pada endosperm (3).
•
Perkembangan jaringan dan organ tanaman. Misalnya: pada perkembangan trikoma (4),
pembentukan elemen trakeari (tracheary element/ TE) (5), dan pada tudung akar (6).
•
Senesen pada daun (7).
•
Tanaman merespon sinyal lingkungan pada pembentukan aerenkim (8),
•
Tanaman merepon sinyal pathogen yang merupakan respon hipersensitivitas untuk dapat
resisten terhadap penyakit (9).
4 2. Jelaskan tiga tahapan senesen pada daun? Apa yang terjadi pada tingkat fisiologis dan
molekular dari tiap tahapan?
Tahapan Proses pada Senesen daun:
1. Fase inisiasi
Penandaan permulaan metabolisme baru. Pada daun senesen terjadi beberapa
metabolisme baru seperti, katabolisme klorofil, sintesis amida, kegiatan transport,
pembentukan glukosa dari lipid melalui glukoneogenesis dan sintesis protein de novo.
Katabolisme atau metabolisme pigmen klorofil terjadi melalui jalur kompleks enzim yang
5 melibatkan beberapa kompartemen di dalam sel dan gejala yang paling mudah diamati
adalah hilangnya warna hiaju daun dari waktu ke waktu.
Perubahan keadaan menjadi redox. Terjadi perubahan keadaan redox dimana pada daun
dewasa terjadi transfer elektron untuk membentuk NADPH dimana NADPH melepas
elektron ke asam askorbat dengan mereduksi glutathione (GSH), sedangkan pada daun
senesen, produksi NADPH berkurang, menyebabkan meningkatnya rasio glutathione
teroksidasi menjadi GSH dan dehidro askorbat menjadi askorbat.
Pada tingkat molekuler, terjadi aktivasi jalur transduksi sinyal oleh berbagai stimulus
tersebut (hormonal, lingkungan, perkembangan, dan patologis) mengakibatkan fase inisiasi
yang mencakup aktivasi dan inaktivasi dari berbagai macam gen untuk menginduksi
terjadinya senesen.
2. Fase reorganisasi
Aktivasi Jalur penyelamatan. Nitrogen dan sulfur organik dikeluarkan oleh daun senesen
daimana glutamine dan asparagin diekspor dari daun yang mengalami senesen.
Perubahan metabolime dari autotrof menjadi heterotrof. Kebutuhan energi untuk
metabolisme, mobilisasi dan proses lainnya menyebabkan meningkatnya energi yang
diambil dari proses heterotrof dimana asam amini sebagai sumber karbon.
Detoksifikasi. Terjadinya metabolisme pembentukan asam salisilat dan phenol yang
dibentuk secara tidak langsung melalui metabolisme fenilpropanoid.
Rediferensiasi organel yang reversible. Merupakan fase transisi di mana terjadi
pengendalian rediferensiasi dari struktur sel dan pengaturan kembali posisi material.
3. Fase terminal/ akhir
Terjadi akumulasi antibiotic ketika terjadinya daun senesen dimana berfungsi untuk
mencegah masuknya pathogen yang secara oportunis memanfaatkan daun senesen
sebagai rute infeksi.
Terjadinya pelepasan radikal bebas, eliminasi sisa hasil metabolisme dan hilangnya
integritas dan viabilitas sel secara irreversible dimana terjadi autofage dan pembesaran
vakuola di sitoplasma dimana membran tidak pecah atau pembentukan autofage vakuola.
Integritas dari membran subseluler dan pengaturan kompartemen dari jalur-jalur biokimia
tetap dipertahankan hingga terjadinya kematian sel.
6 Ethylene evolution 3. Jelaskan teknologi antisen etilen untuk mengatur pemasakan tomat.
Day after pollination Kontrol Antisense Air Ethylene 50 53 56 59 70 57 59 63 67 70 7 •
Etilen adalah hormon yang berfungsi sebagai penginduksi senesen. Etilen sendiri berperan
dalam menginduksi senesen yang terjadi pada pemasakan buah tomat. Inhibitor kimia pada
biosintesis etilen diyakini dapat menghambat proses pemasakan buah. Asam 1-amino
siklopropane -1 - karboksilat (ACC) synthase dan ACC oksidase adalah dua enzim yang
mengkatalisis tahap akhir pada proses biosintesis etilen.
•
Dalam percobaan dinyatakan bahwa dalam pemasakan buah tomat secara normal dibutuhkan
dua hal yaitu etilen dan faktor yang bergantung pada umur buah. Buah tomat tipe liar sebagai
kontrol yang diberi perlakuan disimpan dalam ruangan yang pertama hanya terdiri dari udara
dan dan kedua udara yang mengandung etilen dimana hasil dari percobaan tersebut terjadi
pemasakan buah pada waktu yang sama pada kedua perlakuan.
•
Dalam pengembangan tanaman tomat, ekspresi gen ACC synthase pada orientasi antisense
menyebabkan enzim ACC sinthase yang diproduksi tidak dapat menghasilkan etilen secara
normal sehingga buah tomat kekurangan etilen yang diperlukan untuk proses pematangan.
Ketika buah tomat dipetik dan dibiarkan pada udara maka buah tomat ini tidak akan mengalami
proses pematangan. Namun, jika ditambah etilen dari luar, maka akan terjadi pematangan buah
tomat.
•
Teknologi antisen ini kemudian dimanfaatkan untuk menentukan pemasakan buah tomat.
Tanaman tomat yang telah dimanipulasi sehingga enzim ACC sintase-nya ditranskripsi pada
orientasi antisen tidak akan masak meskipun dipetik dan diinkubasikan di udara. Pemasakan
buah tomat dapat diatur dengan cara penambahan etilen dari luar. Dengan demikian, waktu
masak buah tomat bisa ditentukan. Misalnya, buah tomat yang akan didistribusikan pasca
panen, belum ditambah etilen sehingga tidak akan masak dan membusuk. Setelah dipersiapkan
untuk dijual, buah tomat tersebut diberi perlakuan etilen sehingga masak dan dapat dijual.
8 4. Jelaskan basis genetic interaksi pathogen-tumbuhan (model satu gen untuk satu gen)!
Pada gambar sebelah kiri, untuk dapat menjadi resisten (inkompatibel) pasangan komplemen
dari gen yang dominan, satu pada inang dan satu pada pathogen, keduanya diperlukan.
Perubahan atau hilangnya gen resistensi pada tanaman (R berubah menjadi r) atau gen
avirulensi dari pathogen (Avr berubah menjadi avr) mengakibatkan kerentanan terhadap
penyakit (kompatibel).
Pada gambar sebelah kanan, interaksi yang terjadi melibatkan kompatibilitas yang tergantung
pada toksin. Gen Tox pada patogen wild type diperlukan untuk sintesis toksin yang penting
untuk pathogenesis; tox adalah resesif yang sesuai, yaitu alel yang tidak mempunyai fungsi.
Alel dominan dari inang yaitu gen R diperlukan sebagai gen resisten dari sebagai dasar dari
protein detoksifikasi. Resisten juga dapat muncul ketika inang mengekspresikan bentuk
insensitive toxin dari target toxin. Penyakit hanya ditimbulkan ketika tanaman tidak dapat
mendetoksifikasi toxin yang diproduksi oleh patogen.
9 5. Jelaskan tiga tahapan urutan aktifasi system pertahanan tanaman terhadap pathogen.
10 Urutan aktivasi sistem pertahanan tanaman terhadap patogen:
1. Respon cepat dari sel yang terserang patogen
•
Sel yang diserang oleh patogen secara langsung merespon dengan cepat dengan
menginduksi
respon
pertahanan
maupun
terjadinya
kematian
sel
(respon
hipersensitivitas) ketika sel sudah tidak dapat mempertahankan diri.
•
Serangan patogen mengakibatkan pembentukan senyawaan oksigen yang reaktif
(reactive oxygen species/ ROS), pembukaan kanal ion, sintesis oksida nitrat, serta
fosforilasi.defosforilasi
protein
yang
pada
akhirnya
menginduksi
gen
untuk
mengekspresikan protein-protein yang berperan dalam pertahanan atau pemacuan
kematian sel.
2. Respon jaringan lokal dan aktivasi gen
•
Adanya komunikasi antar sel yang diperantarai oleh berbagai jalur transduksi sinyal
(cross-talk), mengakibatkan sel-sel di sekitar sel yang terserang patogen secara
langsung merespon untuk mempertahankan diri. Sel-sel lokal akan merubah aktivasi
jalur metabolit sekunder.
•
Pada kelompok sel ini, inisiasi peningkatan pertahanan terjadi dengan jalan
pembentukan molekul pemicu sinyal tambahan seperti: ROS yang lain, peroksida lipid,
asam benzoate (BA), asam salisilat (SA), asam jasmonat (JA), dan etilen. Molekulmolekul tersebut akan menginduksi ekspresi (aktivasi) gen-gen yang terkait dengan
pertahanan terhadap patogen (mensintesis pathogenesis related-protein/ PR) serta
memodifikasi protein dan enzim yang terlibat dalam pertahanan.
•
Etilen akan memacu sel untuk menghentikan siklus sel dan memacu senesen.
•
Perubahan status redoks atau kerusakan seluler yang bersamaan akan mengaktivasi
mekanisme untuk pertahanan sel, termasuk fortifikasi dinding sel dengan lignin, PGIP8,
dan HRGP8).
3. Respon secara sistemik dan aktivasi gen
•
Komunikasi antar sel yang meluas, akan memacu respon sistemik pada tanaman.
Sintesis molekul-molekul seperti BA, SA, dan JA akan mengaktivasi gen yang terkait
dengan pertahanan terhadap patogen seperti β-glukanase, kitinase, peroksidase,
maupun sintesis PR yang lain. Enzim-enzim tersebut akan menyerang/membunuh
patogen sehingga sel dapat mempertahankan diri.
11 6. Jelaskan cara identifikasi gen R pada tanaman dengan pendekatan map-based cloning!
12 Identifikasi sebuah gen R dengan cloning yang berdasarkan pada peta gen (map-basedcloning) dilakukan dengan tahapan sebagai berikut:
1. Dilakukan identifikasi dua marker genetik yang mengapit (flanking genetic marker) gen R
(genetic marker 1 dan genetic marker 2). Menemukan tanda genetic pada satu kromosom
dengan gen target
2. Pada tahap berikutnya dilakukan identifikasi dua marker genetic yang mengapit lebih dekat
pada gen R (M3 dan M4) sehingga jarak M3-M4 lebih pendek dari M1-M2. Menentukan
tanda genetic yang sangat dekat dengan gen target
3. Pada tahap selanjutnya, daerah yang mengapit (flanking region) gen R diperpendek lagi
dengan memanfaatkan YAC (yeast artificial chromosome) dan BAC (bacterial artificial
chromosome). Dibuat beberapa klon yang berisi fragmen-fragmen dari untai M3-M4
kemudian dilakukan identifikasi YAC atau BAC yang mengandung fragmen yang berisi gen
R sehingga dapat diperkirakan marker pengapit (flanking marker) yang paling dekat dengan
gen R (E3L-E2L). tanda genetic harus mengapit
4. Fragmen hasil analisis pada tahap 3 (E3L-E2L) tersebut dianalisis lagi untuk mendapatkan
jarak marker pengapit yang sedekat mungkin dengan gen R. Hal ini dilakukan dengan
membuat beberapa klon cosmid (COS1, COS2, COS3, COS4).
5. Untuk mengidentifikasi cosmid yang menyandi gen R, maka dilakukan transformasi setiap
jenis cosmid pada tanaman yang resisten terhadap penyakit. Kemudian dilakukan seleksi
terhadap tanaman yang dapat resisten terhadap penyakit (mengandung COS1 atau COS2).
6. Setelah didapat fragmen dengan flanking region yang cukup pendek (yaitu dalam hal ini
sekuen yang overlap antara COS1 dengan COS2), dilakukan sekuensing untuk dapat
memprediksikan sekuen dari gen R serta menentukan kemungkinan protein yang dapat
dihasilkan (mengidentifikasi kandidat open reading frame dari gen R).
13 7. Bagaimana osmotic adjustment pada sel dapat menyebabkan tanaman toleran terhadap
kekeringan.
Ψw= Ψs + Ψp + Ψg + Ψm
Ψw = potensial air; Ψs = jumlah zat yang terlarut (solute); Ψp = tekanan hidrostatik yang
diberikan dinding sel; Ψg = tekanan gravitasi; Ψm = tekanan matriks
Apabila potensial air lebih besar daripada potensial air di dalam sitoplasma (Ψw eksternal > Ψw
internal) maka sel akan mengalami turgid, sedangkan apabila potensial air lebih kecil daripada
potensial air di dalam sitoplasma (Ψw eksternal < Ψw internal) maka sel akan mengalami
plasmolisis.
Kekeringan adalah dimana potensial air yang berada diluar lebih rendah dibandingkan
dengan potensial air di dalam sitoplasma sehingga menyebabkan air di dalam sitoplasma keluar
sel sehingga sel mengalami plasmolisis, tanaman menjadi layu. Hal ini tidak terjadi apabila ada
osmotic adjustment dimana osmotic adjustment adalah penyesuaian potensial air di dalam
sitoplasma agar tidak lebih tinggi dengan potensial air di luar sitoplasma. Hal-hal yang
mempengaruhi potensial air adalah jumlah zat yang terlarut, tekanan hidrostatik yang diberikan
dinding sel, tekanan gravitasi, tekanan matriks. Osmotic adjustment sendiri dipengaruhi oleh
senyawa osmo regulator yang salah satunya adalah compatible solute. Compatible solute bisa
merupakan senyawa asam amino yaitu proline; senyawa sulfat tersier seperti dimetil
sulfoniopropionate; senyawa ammonium kuartener yaitu glycine betaine, β – alanine betaine,
14 proline betaine, choline –O- sulfate; serta senyawa polyhydric alcohol yaitu pinitol dan mannitol.
Compatible solute ini mempengaruhi nilai potensial dindingsel dan solute sehingga berpengaruh
juga terhadap besarnya nilai potensial air di dalam sitoplasma. Dengan adanya compatible
solute tersebut diharapkan Ψw eksternal > Ψw internal.
15 8. Jelaskan mekanisme fisiologis dan molekular yang terjadi pada akar ketika terendam air
dan terjadi kekurangan oksigen. Kaitkan dengan aktifitas gen ADH.
Mekanisme fisiologis yang terjadi apabila akar terendam air adalah perubahan mekanisme
respirasi sel untuk memperoleh ATP yang dipengaruhi ada tidaknya oksigen. Ada tiga status
oksigen pada saat akar terendam air, yaitu 1. normoxic (aerobic) memungkinkan masih
terjadinya pembentukan ATP secara normal yaitu meliputi glikolisis, siklus krebs, transport
elektron; 2. hypoxic, respirasi masih normal, akan tetapi ATP yang dihasilkan rendah; anoxic
(anaerobic) respirasi secara normal berhenti, terjadi fermentasi, ATP tergantung pada proses
glikolisis. Pada kondisi kekurangan oksigen baik dalam kondisi anoxia dan hypoxia, maka
glukosa yang diubah menjadi piruvat pada tahap glikolisis difermentasi menjadi etanol, dengan
perantara acetaldehyde, yang dikatalis oleh enzim alcohol dehidrogenase (ADH) dan laktat
yang dikatalis oleh enzim laktat dehydrogenase.
16 Pada kondisi anoxia, laktat yang terbentuk tidak dikeluarkan langsung dari sitoplasma sehingga
laktat terakumulasi di dalam sel yang mengakibatkan akar mati karena asidosis sitoplasma.
Sedangkan pada kondisi hypoxia, karena masih adanya oksigen, laktat keluar melalui kanal
asam organik sehingga dapat memperpanjang umur sel dibandingkan dengan kondisi anoxia.
Mekanisme molecular yang terjadi ketika akar terendam air dalam kondisi anoxia diperoleh
bahwa ekspresi gen ADH lebih banyak dibandingkan akar yang terendam dalam kondisi
aerobic.
17 Pada kondisi anoxia, gen Adh1 pada sel akar akan di induksi untuk melakukan transkripsi
akibat peningkatan acetaldehyde. Hasil dari transkripsi akan ditranslasikan secara efisien oleh
ribosom sehingga sel akar memproduksi banyak sekali protein ADH1, dimana mRNA hasil
transkripsi gen lainnya hanya sedikit ditranslasikan. Dibandingkan dengan sel akar dalam
kondisi aerob, ekspresi gen Adh1 pada kondisi ini tidak sebanyak pada kondisi anoxia.
Kondisi akar terendam air pun juga dipengaruhi oleh jenis tanaman. Ada tanaman yang dapat
hidup di air, seperti padi, gulma; ada tanaman yang toleran terhadap rendaman, seperti barley,
gandum, jagung; dan ada tanaman yang sensitive terhadap rendaman, seperti kedelai, tomat,
kapri.
18 9. Tanaman yang toleran Al dapat mensekresi malat dalam jumlah yang lebih tinggi dari
tanaman peka Al. Bagaimana hal ini dapat diterangkan.
Tanaman, khususnya pada tanaman yang peka terhadap Al, bisa mengalami keracunan
alumunium sehingga membatasi pertumbuhan tanaman. Keracunan alumunium ini disebabkan
antara lain karena faktor lingkungan tanah sekitar tanaman mengandung lebih dari 7 %
alumunium pada pH tanah yang rendah (pH tinggi Al tidak bersifat toksik karena membentuk
senyawa Al(OH)4.
Tanaman yang peka terhadap Al akan mengeluarkan asam organik yang bisa berupa asam
malat untuk mengatasi cekaman Al dengan cara mengkhelat Al agar supaya Al tersebut tidak
toksik terhadap tanaman.
Asam malat dapat disekresikan oleh tanaman melalui kanal asam organik di akar oleh karena,
1. Ion Al berikatan dengan kanal asam organik menginduksi kanal asam organik sehingga
mengeluarkan asam malat
2. Ion Al berikatan dengan membran plasma menginduksi kanal asam organik sehingga
mengeluarkan asam malat
3. Ion Al di angkut ke dalam sitoplasma melalui kanal tertentu pada spesies tertentu dan
menginduksi kanal asam organik sehingga mengeluarkan asam malat
19 10. Bagaimana rekayasa terhadap lintasan fiksasi CO2 dapat dilakukan agar laju fotosintesis
dapat ditingkatkan.
Agar laju fotosintesis dapat ditingkatkan, maka rekayasa terhadap lintasan fiksasi CO2
dilakukan
dengan
merekayasa
enzim
pem-fiksasi
CO2
yaitu
ribulosa
1,5-bisfosfat
karboksilase/oksigenase (RuBisCO). RuBisCO merupakan enzim penentu laju fotosintesis pada
tanaman. Rekayasa RuBisCO yang ideal memiliki karakteristik: laju turn-over yang lebih tinggi,
memiliki afinitas CO2 yang lebih tinggi, dan Srel (Srel : rasio spesifisitas dari reaksi karboksilasi
dengan reaksi oksigenase) yang lebih tinggi. Strategi rekayasa RuBisCO yang lain di antaranya
merekayasa agar RuBisCO dapat tetap memfiksasi CO2 meskipun pada kondisi kekeringan
ketika celah stomata berkurang. Selain itu, terdapat enzim RuBisCO yang superior pada
tanaman tertentu.
Rekayasa genetik RuBisCO dapat dilakukan di antaranya dengan cara:
1. Melakukan berbagai mutasi gen RuBIsCO (yaitu gen rbcL) untuk mendapatkan enzim yang
lebih ideal, kemudian mengganti gen asli tanaman dengan gen yang telah dimutasi tersebut.
Selain memutasi, peningkatan kinerja RuBisCO dapat dilakukan dengan mengganti gen
penyandi RuBisCO asli dari tanaman dengan gen RuBisCO yang superior.
2. Melakukan kloning pada gen penyandi sub unit besar maupun sub unit kecil dari RuBisCO
yang superior pada Srel dan Km nya untuk fiksasi CO2, dan mentransfeksikannya pada lokus
rbcL dari DNA kloroplas pada tanaman target.