Analytical Method Validation Definition and Protocol

TRANSFORMASI GEN
Ir. Makhziah, MP
UPN “Veteran” Jawa Timur
1
Transformasi Gen
Masuknya gen target (DNA
rekombinan) ke dalam sel inang.
Proses Transfer Gen:
a. Biologis
b. Mekanis
c. Kimia
2
A. TRANSFER GEN SECARA BIOLOGIS
Hasil cloning gen
dikonjugasi, antara:
pBR322 + pGV 3850
(E. coli)
(Agrobacterium)
Jenis Agrobacterium:
1. Agrobacterium Tumefacient
2. Agrobacterium Rhizogen
3
1. Agrobacterium tumefaciens (At)
Penyebab tumor
“CROWN GALL”
sintesis asam amino “OPINE”
sumber carbon & nitrogen
4
Nama Plasmid : Ti (Tumor inducing)
sifat : stabil dalam At. pada suhu < 30 C
Segmen Ti :
 Transfer DNA (T-DNA)
 Virulence (Vir)
 Konjugasi
 Replikasi plasmid
5
2. Agrobacterium Rhizogene (Ar)
Penyebab ” Hairy Root “
Nama Plasmid : Ri (Root Inducing)
Segmen : sama dg At
 Transfer DNA (T-DNA)
 Virulence (Vir)
 Konjugasi
 Replikasi plasmid
6
MEKANISME TRANSFER DNA
Agrobacterium
menginfeksi sel tanaman
Eksudate
Asetosyringone (AS)
Induksi transkripsi gen-gen vir.
Aktifasi:
Gen vir. A
Gen vir. G
Gen vir. D
Gen vir. E
“Single stranded nick” “
Lepasnya single stranded “T-DNA”
Integrasi dalam sel tanaman
7
8
9
10
MEKANISME TRANSFER GEN
MELALUI Ti PLASMID
11
IDENTIFIKASI TRANSFORMASI
a. Plasmid dimasuki gen ketahanan antibiotik
(selectable marker)
misal: KANAMYCIN RESISTANCE
b. Analisis DNA
PCR (Polymerase Chain Reaction)
12
B. SECARA MEKANIS
a. Microinjection
Cara :
Immobilisasi :
1. Immobilisasi protoplas
2. Holding Pipette mobilization
Polylisine
Efisiensi Transformasi tergantung :
Lokasi injeksi
Bentuk fisik DNA
Konsentrasi DNA
13
TEKNIK MIKRO INJEKSI
14
MIKRO INJEKSI pada KENTANG & BAWANG MERAH
Microinjection into the cell
of a potato callus.
Using fine cannulae, DNA that
codes for a fluorescent protein
was inserted into onion cells. Two
days after the injection, the green
dye can be seen. The integration
of the foreign DNA into the onion
genome was successful
15
b. Electroporation
Listrik tegangan tinggi (± 2500 V)
“Reversible Break-Down” membran protoplas
DNA masuk ke protoplas
Faktor-faktor yang mempengaruhi :
1. Voltage
2. Waktu
3. Umur sel/jaringan
4. Bagian tanaman
16
17
18
PROSES TRANSFER GEN CARA ELEKTROPORASI
19
PERALATAN ELEKTROPORASI
20
ELEKTROPORASI PADA JAGUNG
21
Particle Bombardment
Digunakan untuk memasukkan DNA/ gen ke
dalam tanaman yang sulit diregenerasikan dari
protoplas
Particle :
Gold
Coated DNA/Gene
Tungsten
Yang digunakan gas : Helium
22
23
PERALATAN PARTICLE BOMBARDMENT
24
MEKANISME PENEMBAKAN GEN
by PARTICLE BOMBARDMENT
25
PENEMBAKAN GEN PADA TANAMAN PISANG
26
The End
27