TRANSFEKSI

12 TRANSFEKSI PENDAHULUAN Salah satu vektor kloning DNA yang banyak digunakan adalah bakteriofage atau fage, yaitu virus yang menginfeksi bakteri. Seperti halnya virus, fage harus menginfeksi bakteri yang menjadi inangnya. Setelah jumlahnya mencukupi, fage akan melisis sel inang dan dapat menghasilkan 200 fage untuk setiap sel bakteri yang mengalami lisis. Oleh karena itu jumlah fage menjadi sangat besar bila yang mengalami lisis adalah kumpulan bakteri atau disebut koloni. Oleh karena itu kloning di dalam fage sangat menguntungkan jika DNA yang disisispkan ingin diperbanyak dalam jumlah besar. Konstruksi pustaka genom juga sering menggunakan fage sebagai vektornya. Selain kemampuan membawa DNA sisipan lebih besar daripada plasmid, penyimpanan fage relatif lebih mudah daripada bakteri. Penggunaan fage sebagai vektor kloning DNA juga menguntungkan dalam proses penapisan untuk mengisolasi suatu DNA atau gen, karena rasio kopi DNA atau gen target terhadap genom total fage jauh lebih tinggi daripada rasio kopi DNA atau gen terhadap genom total bakteri bilamana menggunakan plasmid sebagai vektornya. Selain itu proses purifikasi, denaturasi, dan fiksasi DNA di membran pada saat persiapan hibridisasi dalam rangka penapisan DNA target, lebih mudah pada fage yang mentransfeksi bakteri sehingga membentuk plak (plaque) daripada koloni bakteri yang mengandung plasmid (Suharsono dan Widyastuti, 2006). ALAT DAN BAHAN Alat Spektrofotometer, balok pemanas (heat block). Bahan Bakteri Escherichia coli ER 1647, pustaka genom kedelai kultivar lumut dan Slamet. METODE Satu koloni bakteri E.coli ER 1647 dibiakkan di media LB yang didalamnya ditambahkan Maltosa dan MgSO4. Kemudian, di shaker inkubasi pada suhu 37°C selama 4‐5 jam. Setelah itu diambil larutan media yang berisi bakteri sebanyak 100 ul dengan OD 1 dan ditambahkan ke dalamnya 100 ul pustaka 13 genom kedelai (Lumut dan Slamet), lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Campuran ditambah dengan IPTG dan X‐Gal, yang kemudian dicampurkan dengan pada 4 ml larutan top agar, yang mengandung 1 g/l bactotriptone, 0,5 g/l NaCl, 0,6 g/l Agarose, pada suhu larutan top agar 47‐50°C. Kemudian, segera tuang larutan top agar di atas H agar plate, yang mengandung 10 g/l bactotriptone, 8 g/l NaCl dan agar 15 g/l. Diinkubasi pada 37°C overnight dengan posisi cawan terbalik. Dilakukan penapisan, plak yang tidak berwarna, transparan adalah plak rekombinan sedangkan yang berwarna biru adalah plak bukan rekombinan. Plak yang terbentuk akan digunakan untuk proses pembuatan replika plak di membran Hybon N+ (Amersham, Pharmacia). HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Transfeksi fage ke dalam bakteri E. coli pada percobaan kali ini tidak berhasil karena tidak terbentuk plak. Hal ini menyebabkan proses hibridisasi southern dilakukan dengan DNA fage yang telah diamplifikasi yang kemudian dielektroforesis sehingga terbentuk pita pada gel agarose. Pembahasan Hasil dari transfeksi dapat dilihat dari terbentuknya plak pada medium Top Agar. Media Top Agar mengandung komposisi yang mirip dengan media H agar namun menggunakan agarose sebagai pengganti agar. Terbentuknya plak pada hamparan putih bakteri menunjukkan proses transfeksi fage ke dalam E. coli berhasil dengan baik. Ini juga berarti bahwa proses pengemasan hasil ligasi DNA fage berhasil dengan baik (Wulandari, 2009). Jika bakteriofage menginfeksi suatu biakan cair bakteri, maka suspensi biakan berwarna jernih. Sedangkan pada bakteri yang disebar di atas permukaan media padat, fage tidak dapat menginfeksi seluruh bakteri karena tidak dapat berdifusi secara bebas. Partikel fage yang dibebaskan dari sel bakteri yang sudah lisis hanya bisa menginfeksi sel bakteri lain yang berdekatan. Akibatnya akan terlihat zona bening yang disebut plak pada sebaran bakteri. Plak yang terbentuk dapat berwarna biru dan juga dapat berwarna jernih. Plak berwarna biru dikarenakan pada media ini ditambahkan X‐Gal substrat. Plak yang berwarna biru ini menandakan bahwa proses transfeksi tidak berhasil dimana gen lac z terekspresikan sehingga terbentuklah galaktosidase yang mengurai X‐Gal menjadi indol yang membuat koloni berwarna biru. Sedangkan plak berwarna jernih menandakan bahwa fage mengandung gen rekombinan di dalam DNA nya dimana gen lac z tersisipi oleh gen insert sehingga gen lac z tidak dapat diekspresikan, oleh karena itu galaktosidase tidak terbentuk sehingga X‐Gal tidak terurai. 14 Pada percobaan ini, plak berwarna jernih tidak terbentuk sehingga dapat disimpulkan bahwa transfeksi fage ke dalam E. coli tidak berhasil. Hal ini dapat disebabkan karena pustaka genom yang digunakan sudah lama dalam penyimpanan sehingga tidak lagi berfungsi sebagai mana mestinya. KESIMPULAN Transfeksi tidak berhasil karena pada media tidak terbentuk plak. DAFTAR PUSTAKA Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi – Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat IPB dengan DIKTI – DIKNAS, Bogor Wulandari, Y. R. E. Konstruksi Genom Tibouchina langsdorffiana Baill. Merupakan ringkasan yang di kopi pada bulan Desember tahun 2009