Seleksi Isolat Bakteri untuk Fermentasi Asam Laktat dari Air Kelapa

BioSMART
Volume 4, Nomor 2
Halaman: 32-35
ISSN: 1411-321X
Oktober 2002
Seleksi Isolat Bakteri untuk Fermentasi Asam Laktat dari Air Kelapa Varietas
Rubescent (Cocos nucifera L. var. rubescent)
Selection of isolate bacteria for acid lactic fermentation of coconut water variety of rubescent
(Cocos nucifera L. var. rubescent)
ENY WIDAYATI, SUTARNO, RATNA SETYANINGSIH
Jurusan Bio1ogi, FMIPA Universitas Sebelas Maret Surakarta 57126
Diterima: 15 April 2002. Disetujui: 31 Juli 2002.
ABSTRACT
The objectives of the research were to isolate, select lactic acid bacteria from coconut water, examine its activities, and to know the
lactic acid concentration produced. Abundance of coconut water was not been used maximally, and therefore potentially pollutes the
environment. Coconut water can be used as sources of isolate bacteria and as fermentation substrate. The fermentation could produce
lactic acid, a raw material for industries. In this research, isolation and selection of lactic acid bacteria that having high activity in
converting coconut water to lactic acid were done. Isolation of the bacteria was done in two different ways, directly and in nutritionenriched media. From each experiment, lactic acid bacteria is isolated by dilution series and grown up on PGY media. Parameters
measured for its ability in fermenting lactic acid with coconut water as based ingredient are growth, change of pH, and reduction of
glucose. The concentration of lactic acid produced was measured by HPLC. Streptococcus sp., lactic acid bacteria, that able to be
isolated and having a high ability in fermenting coconut water. Streptococcus sp. bacteria begin to form lactic acid on day one, and
production of the lactic acid occurred for four days. The concentration of lactic acid produced by the bacteria on day four was up to
55,52 mg/lt, with bacteria counting of 11.317.350.
Key words: lactic acid bacteria, fermentation, coconut water.
PENDAHULUAN
BAHAN DAN METODE
Tersedianya air kelapa dalam jumlah besar di
Indonesia, merupakan potensi yang belum dimanfaatkan
secara maksimal. Biasanya air kelapa dibuang langsung ke
lingkungan sebagai limbah rumah tangga, limbah pasar dan
limbah industri rumah tangga.
Air kelapa mengandung gula, protein, asam-asam
amino, bermacam-macam vitamin dan mineral (Woodroof,
1970), sehingga dengan kandungan nutrien yang relatif
lengkap tersebut, air kelapa mempunyai potensi yang baik
untuk dimanfaatkan sebagai bahan dasar fermentasi asamasam organik (Fardiaz dkk, 1996). Bakteri penghasil asam
laktat merupakan salah satu bakteri yang cenderung tertarik
pada habitat yang mengandung gula seperti air kelapa dan
bakteri ini akan memfermentasikan senyawa yang ada
menjadi asam laktat (Madigan et al. 2000). Asam laktat
mempunyai banyak manfaat, misalnya pada industri
plastik, industri pangan, serta dalam bidang obat-obatan
(farmasi).
Melihat begitu banyak manfaat asam laktat maka perlu
diketahui isolat bakteri yang mempunyai kemampuan
tinggi dalam fermentasi asam laktat dan perlu diketahui
juga aktivitas bakteri tersebut dalam menghasilkan asam
laktat melalui fermentasi dengan substrat air kelapa.
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September tahun
2001 sampai dengan bulan Februari tahun 2002 di Sub
Laboratorium Biologi dan Sub Laboratorium Kimia
Laboratorium Pusat MIPA Universitas Sebelas Maret
Surakarta. Air kelapa yang digunakan dari varietas
rubescent yang didapat dari pasar Ledoksari Jebres Solo.
Isolasi dan seleksi bakteri penghasil asam laktat
Isolasi bakteri penghasil asam laktat dilakukan secara
langsung dan secara tidak langsung melalui kultur
diperkaya.
Isolasi bakteri secara langsung. Bakteri penghasil
asam laktat diisolasi dari sampel air kelapa melalui seri
pengenceran (10-1 sampai 10-6) yang dilakukan secara
aseptis. Masing-masing suspensi (10-3 sampai 10-6) diambil
1 ml, diinokulasikan ke medium PGY agar yang
mengandung CaCO3 secara pour plate (taburan)
Isolasi bakteri melalui kultur diperkaya. Bakteri
penghasil asam laktat diisolasi melalui kultur diperkaya,
yang diawali dengan penyimpanan sampel air kelapa (100
ml) selama 72 jam pada suhu 300C. Setelah bakteri tumbuh
di permukaan air kelapa tersebut, bakteri diisolasi melalui
pengenceran seperti yang dilakukan pada isolasi langsung.
© 2002 Jurusan Biologi FMIPA UNS Surakarta
WIDAYATI, dkk. – Bakteri Fermentasi Asam Laktat Air Kelapa
Selain itu dilakukan pula pengayaan kultur dengan
menggunakan larutan Bayerinck yang dapat menstimulir
pertumbuhan bakteri penghasil asam laktat dari air kelapa
(Bangun,1993). Seri pengenceran dibuat seperti yang
dilakukan dalam isolasi langsung kemudian diambil 1 ml,
diinokulasikan ke larutan Bayerinck, setelah itu diinkubasi
selama 72 jam pada suhu 300C. Setelah bakteri tumbuh,
diisolasi seperti yang dilakukan dalam isolasi langsung.
Koloni bakteri penghasil asam laktat dipilih dari semua
koloni yang mampu membentuk zona jernih
(Bangun,1993). Koloni bakteri tersebut diseleksi lebih
lanjut berdasarkan luas zona jernih atau kuning pada
medium PGY agar yang mengandung BPC. Koloni yang
mempunyai zona jernih lebih luas dipilih untuk percobaan
selanjutnya, dipindahkan ke medium agar miring,
diinkubasikan pada suhu 300C selama 24-48 jam.
Identifikasi bakteri asam laktat
Identifikasi bakteri asam laktat terpilih mengacu pada
Bergey’s Manual Determinative of Bacteriology (Sneath et
al., 1986). Identifikasi yang dilakukan meliputi uji
morfologi sel yang melalui pewarnaan gram dan uji
biokimia melalui uji katalase dan uji pembentukan gas.
33
diperkaya dengan larutan Bayerinck ini lebih luas jika
dibandingkan dengan pembentukan zone jernih dari kedua
perlakuan lainnya yaitu yang diawali dengan penyimpanan
sampel air kelapa maupun yang diisolasi secara langsung.
Hal ini menunjukkan bahwa isolat bakteri yang diisolasi
dari kultur yang diperkaya dengan larutan Bayerinck
terpacu pertumbuhannya sehingga mempunyai kemampuan
yang lebih tinggi dalam mengkonversi gula yang terdapat
di dalam medium menjadi asam dan dengan penambahan
indikator BCP akan bereaksi membentuk warna kuning
jernih yang lebih luas.
Setelah dilakukan uji morfologi sel dan uji biokimiawi
dapat diketahui bahwa bakteri yang berhasil diisolasi
tersebut merupakan bakteri asam laktat dan termasuk
dalam genus Streptococcus. Hasil identifikasi sampai
tingkat genus didasarkan atas ciri-ciri yang terdapat pada
bakteri tersebut yaitu mempunyai bentuk bulat, membentuk
rantai, gram positif dengan warnanya yang keungu-unguan
(violet) (Gambar 1), bersifat katalase negatif yang berarti
bahwa bakteri ini tidak menghasilkan enzim katalase yang
dapat menghidrolisis senyawa H2O2 yang bersifat racun
dan di samping itu isolat bakteri ini juga tidak mempunyai
kemampuan membentuk gas dalam uji produksi gas dari
glukosa.
Uji kemampuan tumbuh isolat bakteri dalam air kelapa
Kultur muda (24 jam) dari medium agar miring
diinokulasikan ke dalam 10 ml air kelapa, diinkubasi
selama 72 jam dan kemampuan tumbuh isolat bakteri ini
diketahui melalui pengamatan terhadap perubahan
absorbansi dari air kelapa tersebut selama 72 jam dengan
menggunakan spektrofotometer
Fermentasi
Percobaan fermentasi diawali dengan penyiapan
inokulum (starter). Kultur bakteri terpilih diinokulasikan ke
dalam 50 ml air kelapa, diinkubasikan pada suhu 300C
selama 48 jam (Wibowo,1990).
Setelah inokulum tumbuh diambil 20 ml, diinokulasikan ke dalam 200 ml (Rachman, 1989) medium air kelapa
varietas Rubescent. Fermentasi dilakukan selama tujuh hari
dengan pengamatan setiap 24 jam sekali terhadap berikut:
(1) kadar asam laktat, yang diukur dengan menggunakan
alat HPLC (Adnan,1997), (2) jumlah sel bakteri, yang
diamati dengan menggunakan spektrofotometer pada λ 650
nm dari nilai absorbansinya (Fardiaz, 1987), (3) kadar gula
reduksi, yang ditentukan dengan menggunakan metode
Nelson- Somagy (Suhardi, dkk. 1997), dan (4) pH kultur,
yang diamati dengan menggunakan pH meter.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Bakteri asam laktat hasil seleksi
Satu jenis bakteri yang paling banyak menghasilkan
asam laktat berhasil diisolasi dari kultur yang diperkaya
dengan larutan Bayerinck. Pertumbuhan bakteri tersebut
ditandai dengan terjadinya pembentukan zona jernih terluas
di sekitar koloni pada medium PGY yang ditambah
indikator BCP. Pembentukan zona jernih dari kultur yang
Gambar 1. Morfologi sel Streptococcus sp. yang diisolasi dari air
kelapa. a. kapsula. b. koloni berbentuk rantai.
Produksi asam laktat
Hasil yang diperoleh dari analisis konsentrasi asam
laktat dengan menggunakan alat HPLC memperlihatkan
bahwa selama proses fermentasi terjadi kenaikan produk
asam laktat yang cukup menyolok sampai hari ke-4 yaitu
mencapai 55,52 mg/lt (Tabel 1). Memasuki hari ke-5
sampai hari ke-7 masih terus terjadi kenaikan produk asam
laktat namun kenaikannya relatif kecil (Gambar 2). Hal ini
menunjukkan bahwa waktu effisien untuk pembentukan
asam laktat oleh bakteri Streptococcus sp. adalah 4 hari.
BioSMART Vol. 4, No. 2, Oktober 2002, hal. 32-35
34
Konsentrasi asam laktat (mg/lt)
60
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
Pembentukan asam laktat oleh bakteri Streptococcus sp.
melalui lintasan EMP atau glikolisis. Bakteri Streptococcus
sp. mempunyai enzim aldolase sehingga bakteri ini mampu
mengkonversikan 90% glukosa dalam air kelapa menjadi
asam laktat (Moat and Foster, 1988).
Produksi asam laktat dari air kelapa ini, memberikan
alternatif lain dalam pembuatan asam laktat. Air kelapa
dapat dipertimbangkan sebagai bahan dasar produksi asam
laktat karena di samping merupakan bahan yang kurang
dimanfaatkan sehingga harganya sangat murah, air kelapa
juga mempunyai kadar kontaminasi yang lebih kecil sebab
termasuk produk alami bukan merupakan sisa suatu proses
produksi, produk samping minimum serta terjamin
kontinuitas ketersediaannya.
Waktu (hari)
Gambar 2. Konsentrasi asam laktat selama fermentasi.
7.2
70
konsentrasi asam laktat
(mg/lt)
6.8
50
6.6
40
6.4
6.2
30
6
20
5.8
5.6
10
log jumlah bakteri per ml
7
60
5.4
0
5.2
0
1
2
3
4
5
6
7
Waktu/hari
Konsentrasi Asam Laktat
Pertumbuhan Bakteri Streptococcus sp.
Gambar 3. Pertumbuhan bakteri Streptococcus sp. selama
fermentasi.
4.5
4
% Gula reduksi
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0
1
2
3
4
5
6
Waktu (hari)
Gambar 4. Perubahan gula reduksi selama fermentasi.
7
Pertumbuhan bakteri Streptococcus selama fermentasi
Perubahan jumlah sel bakteri Streptococcus sp.
disebabkan karena adanya pertumbuhan bakteri
Streptococcus sp. di dalam medium fermentasi.
Pertumbuhan bakteri Streptococcus sp. terlihat jelas
melalui pengukuran optical density (OD). Melalui hasil
pengukuran OD yang kemudian dikonversikan ke jumlah
bakteri dapat diketahui terjadinya peningkatan jumlah
bakteri. Hal ini menunjukkan adanya aktivitas bakteri di
dalam medium fermentasi. Keadaan tersebut lebih jelas lagi
terlihat pada kurva pertumbuhan bakteri Streptococcus sp.
(Gambar 3). Dari gambar 3 terlihat mulai hari ke-0 sudah
terjadi peningkatan jumlah bakteri yang berarti bahwa
inokulum yang dibuat sudah aktif.
Mulai hari ke-0 sampai hari ke-4 bakteri Streptococcus
sp. mengalami pertumbuhan yang pesat sejalan dengan
pembentukan produk asam laktat (Gambar 3). Hal ini
disebabkan karena dengan semakin tingginya kecepatan
pertumbuhan
bakteri
Streptococcus
sp.
akan
mengakibatkan peningkatan aktivitas bakteri untuk
mengkonversi glukosa. Semakin cepat pemecahan glukosa
akan meningkatkan reduksi asam piruvat menjadi asam
laktat.
Memasuki hari ke-5 sampai hari ke-7 pertumbuhan
bakteri Streptococcus sp. sejalan dengan pembentukan
asam laktat yang sudah mulai stabil. Hal ini disebabkan
adanya kehilangan bakteri yang lambat karena kematian
yang diimbangi dengan pembentukan bakteri-bakteri baru
melalui pertumbuhan dan pembelahan
Gula reduksi
Konsumsi gula oleh bakteri Streptococcus sp. dalam
fermentasi air kelapa ini diukur dengan menggunakan
metode Nelson-Somagyi. Hasil yang diperoleh dari
pengukuran gula reduksi dengan menggunakan standar
glukosa murni memperlihatkan bahwa selama proses
fermentasi terjadi perubahan gula reduksi dari hari ke-0
sampai hari ke-7 mencapai 0,429% Dari gambar 4 jelas
terlihat terjadinya perubahan gula reduksi selama proses
fermentasi. Perubahan besarnya gula reduksi terlihat sangat
menyolok mulai hari ke-0 sampai hari ke-5. Pada hari
tersebut kecepatan pertumbuhan bakteri Streptococcus sp.
sangat pesat sehingga dengan terjadinya peningkatan
pertumbuhan, bakteri Streptococcus sp. ini lebih banyak
dalam mengkonsumsi glukosa sebagai sumber nutrisi untuk
WIDAYATI, dkk. – Bakteri Fermentasi Asam Laktat Air Kelapa
Mulai hari ke-5 sampai hari ke-7 pH cenderung bersifat
tetap (stabil). Pada hari tersebut aktivitas bakteri
Streptococcus sp. dalam pembentukan asam laktat telah
mengalami penurunan sehingga kadar asam laktat dalam
medium fermentasi tersebut cenderung bersifat tetap.
5
4.8
4.6
4.4
4.2
pH
35
4
KESIMPULAN
3.8
3.6
3.4
3.2
3
0
1
2
3
4
5
6
7
Waktu/hari
Gambar 5. Perubahan pH selama fermentasi.
pertumbuhannya. Akibatnya gula reduksi akan semakin
berkurang sedangkan pembentukan asam laktat dalam
medium fermentasi air kelapa tersebut akan semakin
bertambah .
Setelah hari ke-5 dan memasuki hari ke-6 perubahan
gula reduksi sudah mulai tidak terlihat menyolok dan
cenderung mendekati stabil. Setelah hari ke-6 sampai hari
ke-7 kadar gula reduksi relatif stabil, hal ini disebabkan
karena aktivitas bakteri Streptococcus sp. dalam
memproduksi asam laktat telah mengalami penurunan
sejalan dengan berkurangnya glukosa sebagai sumber
nutrisi bagi pertumbuhan bakteri Streptococcus sp.
Derajat keasaman (pH)
Pengukuran pH mempunyai tujuan untuk mengetahui
tingkat keasaman pada kondisi fermentasi. Melalui hasil
pengukuran dapat diketahui bahwa pH terendah mencapai
sekitar 3,05. Terjadinya penurunan pH ini sejalan dengan
pembentukan asam laktat. Melalui gambar 5 jelas terlihat
bahwa mulai hari ke-0 sampai hari ke-5 masih terus terjadi
penurunan pH. Hal ini disebabkan karena pada hari
tersebut terjadi peningkatan produksi asam laktat. Semakin
tinggi produk asam laktat yang dapat dibentuk oleh bakteri
Streptococcus sp. akan menyebabkan terjadinya
peningkatan gugus H+ sehingga mengakibatkan tingkat
keasaman dalam medium fermentasi semakin tinggi.
Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan maka
dapat disimpulkan bahwa: (1) bakteri Streptococcus sp.
yang diisolasi dari air kelapa memiliki kemampuan tinggi
dalam fermentasi asam laktat dengan substrat air kelapa,
(2) bakteri Streptococcus sp. sudah mulai membentuk asam
laktat pada hari ke-1 dan terjadi peningkatan produksi
secara pesat sampai hari ke-4, selanjutnya pada hari ke-5
sampai ke-7 pembentukan asam laktat relatif sedikit, dan
(3) kadar asam laktat yang dihasilkan oleh bakteri
Streptococcus sp. pada hari ke-4 mencapai 55,52 mg/lt,
dengan jumlah bakteri 9.148.916,55/ ml substrat.
DAFTAR PUSTAKA
Adnan, M. 1997. Teknik Kromatrografi Untuk Analisis Bahan Makanan.
Yogyakarta: Penerbit Andi
Bangun, A. 1993. Teknik Khusus Penanaman Mikroorganisme.
Yogyakarta: PAU Bioteknologi UGM.
Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Bogor: Pusat Antar Universitas
Pangan dan Gizi. IPB.
Fardiaz, S., E.D. Nuraini, dan H. Kusumaningrum. 1996. Pemanfaatan air
kelapa untuk produksi minuman sehat anti diare melalui proses
fermentasi laktat. Buletin Teknologi dan Industri Pangan 7 (2): 47-53.
Madigan, M.T., J.M. Martinko, and J. Parker. 2000. Biology of
Microorganisme, Brock. New Jersey: Prentice-Hall Inc.
Moat, A.G. and J.W. Foster. 1988. Microbial Physiology. New York:
Wiley-Interscience Publication.
Rachman, A. 1989. Pengantar Teknologi Fermentasi. Bogor: Pusat Antar
Universitas Pangan dan Gizi IPB.
Sneath, P.H.A., N.S. Mair, M.E. Sharpe, and J.G. Holt. 1986. Bergey,’s
Manual of Systematic Bacteriology. Baltimore: The Williams and
Wilkins.
Soedijanto dan M. Sianipar. 1991. Kelapa. Jakarta: CV. Yasaguna.
Suhardi, S. Sudarmadji, dan B. Haryono. 1997. Prosedur Analisa untuk
Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta: Penerbit Liberty.
Wibowo, D. 1990. Dasar-dasar Teknologi Fermentasi. Yogyakarta: PAU
Pangan dan Gizi UGM.
Woodroof, J.G. 1970. Coconut Prodution, Processing, Product. London:
Avi Publishing Co. Inc.