Aplikasi Enzim pada Berbagai Proses

m.K DASAR REKAYASA BIOPROSES
(TIN 221 /2(2-0)
IMOBILISASI ENZIM
Departemen Teknologi Industri Pertanian
FATETA - IPB
2012
ENZIM
1. Larut dan tidak stabil
 Hanya dapat digunakan satu kali dalam larutan bebas
2. Enzim sangat mahal dan merupakan bahan yang sulit
diperoleh dalam jumlah memadai (isolasi & purifikasi)

 Harus digunakan cara yang ekonomis dan dapat
memperpanjang aktivitas biologisnya

Imobilisasi
(membuat konformasi aktif enzim tahan terhadap lingkungan)

Terbentuk struktur granula enzim padat yang stabil dan tidak
larut air.
TEKNIK IMOBILISASI ENZIM
DEFINISI (Chibata, 1978)
Enzim yang secara fisik ditempatkan di dalam suatu
daerah/ruang tertentu, sehingga kestabilannya meningkat
dan dapat mempertahankan aktivitas katalitiknya serta dapat
digunakan secara berulang-ulang dan kontinyu.
“Imobilisasi = biokatalis terbatas pergerakannya
diakibatkan oleh perlakuan fisik atau kimia,
sehingga konformasi enzim tahan thd
lingkungan
Enzim menjadi bersifat tak larut (Insoluble enzyme)
– mempunyai keuntungan seperti katalis heterogen klasik
(yang biasa digunakan)
Keuntungan Imobilisasi :
1.Dapat digunakan berulang  biaya <<
2.Pemisahan produk lebih mudah
3.Penghentian proses cepat (diambil dengan filtrasi; laju alir <<)
4.Kestabilan lebih baik dengan adanya proses imobilisasi.
5.Produkl tidak terkontaminasi enzim cocok untuk pangan dan
farmasi
6.Dapat digunakan untuk proses sinambung ”low residence
time” (high volumetric activity) & Pengontrolan lebih baik
Kelemahan Imobilisasi :
1. Biaya carrier/penyangga dan proses imobilisasi cukup besar
2.Terjadi perubahan karakteristik enzim
3. Pembatasan transfer massa
- problem dengan kofaktor & regenerasi
- problem dengan sistem multienzim
4. Aktivitas enzim hilang selama imobilisasi
ENZYME IMMOBILIZATION METHOD
“Carrier –binding”
Adsorp
si Fisik
Ikatan
Ionik
“Cross-linking”
Ikatan
Kovalen
Jenis
Kisi
“Entrapment”
Jenis
Mikrokapsul
Metode Imobilisasi :
1. “Carrier Binding” (Pengikatan/Pelekatan pada Carrier)
• Enzim diikat pada “carrier” (matriks) yang tidak larut air

luas permukaan & diameter pori→ muatan enzim
E
Jenis :
a. Adsorbsi fisik
- Mudah dilakukan dan ekonomis
- Enzim diadsorbsi pada permukaan “carrier”
Kelebihan :
- Kondisi lunak → aktivitas enzim tetap tinggi
- Dapat diregenerasi
Kelemahan :
- Kekuatan ikatan lemah
 pH atau kekuatan ion berubah → bocor!
- Enzim dirusak oleh mikroba/enzim proteolitik
Contoh “Carrier” untuk adsorbsi fisik :
•
•
•
•
•
•
•
Karbon aktif
Gelas porous
Tanah liat
Kaolin
Alumina
Silika gel
Bentonit
Karbon
aktif
-amilase
• hidroksil apatit
• gel Ca-fosfat
• pati
• gluten
• butil sefarosa
• concana valin A
Lar.
Pati
Aduk 10
1 jam
0C,
Saring
Enzim
Imobil
Amilase
imobil
Gula
Ikatan Ionik
• Terjadi ikatan ionik antara enzim dengan “carrier” yang
tidak larut air dan mengandung residu penukar ion (R)
E
+ R+
R + R +
R
• Selulosa, DEAE-sefadex, “glass-fibre paper”, polistiren
sulfonat
• Kelebihan dan kekurangan sama dengan cara
Aminoasilase + buffer
+
adsorbsi
fosfat (pH 7)
• Cara imobilisasi :
Substrat
(camp. D/L asam amino.)
Jaket air
DEAE-sefadex + air
L-aa
Terjadi interaksi antara gugus amin (carrier) yang
bermuatan positif dengan gugus karboksil (enzim) yang
bermuatan negatif.
Setelah 32 hari  keaktifan masih 60 %
c. Ikatan Kovalen
• Terbentuk ikatan kovalen antara enzim dengan “carrier”
tidak larut dalam air  ikatan kuat & tidak bocor
• Gugus fungsional enzim yang berperan :
1).  atau -amino
2). , , atau -karboksil
3). Sulfuhidril
4). Hidroksil
5). Imidazol
6). Fenolik
• “Carrier” mengandung gugus reaktif :
E
Diazonium
Asam azida
“carrier”
Isosianat
Cyanogen bromide dll
 Kelemahan : konformasi enzim berubah  aktivitas
hilang
Imobilisasi dgn Ikatan Kovalen
Carrier yg memiliki gugus hidroksil (polisakarida, manik
gelass) diaktivasi dgn cyanogen bromide  menghasilkan
turunan imidokarbonat yang reaktif lalu berikatan dengan
ggs amino enzim :
support
Carrier turunan diazonium yang memiliki gugus amino
diaktivasi untuk imobilisasi enzim :
2. Cross Linking (Ikatan Silang)
• Terjadi ikatan kimia, tetapi tidak digunakan carrier tidak
larut air
 Pembentukan ikatan melintang inter molekuler antara
moleklul enzim dengan pereaksi bifungsional atau
multifungsional.
• Pereaksi :
 glutaraldehid paling banyak digunakan
 diazobenzidine (atau turunannya)
 Etil khloroformat
 N-N-hexamethilene bisiodoasetat
 dll
Untuk meningkatkan stabilitas  cross linking + adsorbsi
E
• Kopolimerisasi
polimer
Imobilisasi
dg Ikatan
(Crosslinking)
Cross Linking
(IkatanSilang
Silang)
Pereaksi umumnya mempunyai 2 gugus
fungsional identik yang bereaksi dengan
residu asam amino
Contoh pereaksi :
glutaraldehida
diisocyanate
3. Entrapment (penjeraban)
• Lokalisasi enzim dalam kisi matriks atau mikrokapsul
(membran semipermeabel)
 Enzim tidak terikat pada matriks gel atau membran
 tipe kisi (alginat,
k-karagenan, Poliakrilamida )
 tipe mikrokapsul
1 – 300 m
Bahan : Nilon, poliurea,
etil selulosa, polistiren,
Membran
Kolodion, nitroselulosa,
Mikrokapsul
polimer
butil asetat selulosa dll
tidak
permanen
permanen
•
Immobilization by Entrapment
Gel Poliakrilamida
Cara Penjeraban Tipe Kisi
enzim
Makropipet 2 mL
Lar. Na-alginat  2 %
CaCl2 0.1 M
Skala 4.5
Gel kalsium alginat
yang berisi enzim
Perubahan Sifat Enzim Terimobilisasi
1. Aktivitas
V1(aktivitas relatif)
 Perbandingan aktivitas enzim imobil vs
enzim larut dalam jumlah sama
V2 (aktivitas spesifik absolut)
 Kecepatan reaksi per unit berat atau unit
volume seluruh katalis
V1  tidak deaktivasi enzim akibat prosesimobilisasi
V2  kemungkinan untuk mengimobilisasi enzim lebih
banyak/sedikit per unit berat/volume katalis
Penyebab penurunan aktivitas :
• Konfigurasi  menghalangi substrat
• Gugus reaktif pada sisi aktif ikut terikat pada matriks
• Terbentuk konfigurasi tidak aktif
• Kondisi reaksi ekstrim  denaturasi
2. pH optimum enzim imobil
Penyebab perubahan pH :
 distribusi yang tidak seragam ion H+, ion OH- dan
substrat bermuatan
Aktivitas Relatif (%)
Carrier bermuatan negatif  pH optimum bersifat basa
CMC, Asam galakturonat, Asam poliaspartat, anhidrida
etilen
Carrier bermuatan positif  pH lebih asam
DEAE-selulosa, Polimer poliornithil
c
4
a
7
b
a : enzim chymotripsin larut
b :kopolimer chym – anhidrida
etilen (-)
c :chym – poliornithil (+)
→ pH
3. Stabilitas
 Stabilitas operasi = t1/2 (half-life)
= waktu dimana terjadi kehilangan 50 % dari aktivitas
enzim semula
t1
2
0.693

k
E0
2.303
k
log
t
E
k = konstanta kerusakan enzim
t = waktu operasi
E0 = aktivitas enzim mula-mula
E = aktivitas enzim pada wktu t
Stabilitas operasi ditentukan oleh :
• Jenis enzim
• Cara imobilisasi
• Jenis bioreaktor
Bioreaktor Enzim Imobil
Reaktor Curah (Batch) :
• Sederhana
• Viskositas tinggi &
aktivitas enzim rendah
CSTR :
• Pengontrolan lbh mudah
• Cocok untuk kasus inhibisi
(penghambatan) substrat
• Menghindari kontak enzim
oleh substrat dan produk
yang terlalu lama
Fixed-bed PFR (Unggun Diam/Terkemas) :
- Sinambung  paling sering digunakan
- Aliran substrat dpt dari atas, bawah atau
daur-ulang
Fluidized-bed (Unggun Terfluidisasi) :
- Untuk viskositas tinggi & terbentuk gas
- Laju fluidisasi perlu diatur agar enzim
imobil tak rusak
Recycle Packed Column Reactor :
- Bioreaktor dpt diopersikan dgn laju alir tinggi
- Digunakan untuk substrat yang tdk dpt dg sekali proses
Pengukuran Efisiensi Imobilisasi
(Aktifitas enzim yang teradsorbsi pada penyangga)
• Larutan enzim :
- aktifitas
: 591 U/mL
- volume larutan : 40 mL
 Total aktifitas : 40 x 591 = 23600 U
• Bobot Penyangga (carrier) : 11 gram

Setelah mobilisasi
 Aktifitas enzim terimobilisasi : 381 U/g penyangga
 Total aktifitas enzim yang teradsorbsi pada penyangga
= 11 x 381 U = 4191 U
Persentase aktifitas enzim teradsorbsi = 4191/23600 x 100%
= 17,8 %
Imobilisasi Sel :
•Meningkatkan konsentrasi biomassa  produktivitas >
•Konsentrasi sel menentukan waktu tinggal dlm bioreaktor
•Operasi sinambung dg laju alir > (waktu tinggal pendek),
tidak terjadi wash out
•Biomassa dapat digunakan kembali
•Pemisahan biomassa lebih mudah
Metode :
1. Carrier biding : E. coli
A. oryzae, dll
2. Entraping  paling banyak diteliti
Matriks yang digunakan :
• Kolagen, Selulosa triasetat  tipe membran
• Alginat, Agar, Karagenan, Poliakrilamida  tipe kisi
3. Cross linking : E. coli
Contoh :
Aplikasi sel imobil di industri
Aplikasi Enzim Imobil di Industri
1. Produksi Fruktosa dari Glukosa (HFS)
Glukosa
Fruktosa
Glukoisomerase : Intraseluler & Mahal
(diimobilisasi dg ikatan ionik - DEAE-Selulosa)
2. Produksi L-asam amino (e.g L-Metionin)  bentuk yg
dapat diserap tubuh
Hasil reaksi kimia  campuran asam amino : asetil D&L
asam amino (rasemat) + aminoasilase imobil (DEAESephadex)  terjadi deasilasi hanya pada asam amino yg
bentuk L
3. Produksi Antibiotika APA (6-amino penicillanic acid)
- Benzil Penisilin (hasil fermentasi) + penisilin
amidase(diimobilisasi ikatan ionik dg selulosa asetat)
 APA
- APA + gugus metil  α-metil benzil penisilin (=Ampisilin,
antibiotika spektrum luas)
BIOSENSOR
Prinsip pengukuran : perubahan oksigen, kofaktor NADH
(menyerap cahaya pd λ 340 nm) atau senyawa lain (amonia dll)
Contoh
(lar glukosa) Kolom kapiler
Sistem Monitoring Glukosa
Glukosa
O2
Glukosidase Glukonolakton + H2O2
Elektroda O2
Glu.oks imobil
O2  diukur dengan elektroda
Recording electrometer
Penentuan Asam Askorbat
Asam L-Askorbat + ½ O2  asam dehidroaskorbat + H2O
Askorbat oksidase
O2  diukur dengan elektroda
Senyawa Kimia
Enzim
Perangkat
Elektroda
Glukosa
Glukosa oksidase
Elektroda oksigen
Etanol
Alkohol oksidase
Elektroda oksigen
Nitrit reduktase
Elektrode gas
amonia
L-Tirosin
L-tirosin
dekarboksilase
Elektroda oksigen
Urea
Urease
Elektroda gas
amonia
Sulfit
Sulfit oksidase
Elektroda oksigen
Asam L-askorbat
Askorbat
dehidrogenase
Elektroda oksigen
Kreatin
Kreatinase
Elektroda oksigen
H 2O2
Katalase
Elektroda oksigen
Nitrit
Contoh Aplikasi
• Produksi sirup Fruktosa dari Inulin Umbi Dahlia
Dalam Reaktor Sinambung Unggun Terkemas (Fixedbed) Menggunakan Enzim Inulinase Imobil
( Skripsi Sujatmono , T.S, 1992)
Pembuatan Substrat Inulin
Ampas
Penyaringan
Umbi Dahlia
Pencucian dan
Pengupasan
Pelarutan Dengan Air
Perajangan
Tepung Umbi Dahlia
Pengeringan dengan sinar
matahari 3- 4 jam
Penggilingan, 40 mesh
Pengeringan dengan oven
suhu 50 – 60 0 C
Irisan Umbi Kering
Substrat Inulin
Siap pakai
Pembuatan Enzim Inulinase Imobil
Inulinase
(Novozym 230 )
Na-Alginat 1 %
Pencampuran
Pengaliran lewat
Pompa Peristaltik
Imobilisasi dalam
CaCl2 0.05 M
Perendaman dalam
CaCl2 1-2 jam
Pencucian manik-manik
dalam Buffer Asetat
Penyaringan
Inulin Imobil Siap
Pakai 2.3 mm
Bioreaktor yang digunakan
Fermentasi Etanol Sinambung menggunakan Sel Khamir Imobil
Fermentasi Etanol Sinambung menggunakan Sel Khamir Imobil
5