Lect_08 Ekstraksi DNA 2016

EKSTRAKSI DNA
13 Juni 2016
Pendahuluan
• DNA: polimer untai ganda yg tersusun dari
deoksiribonukleotida (dari basa purin atau
pirimidin, gula pentosa,dan fosfat).
• Basa purin: A,G
• Basa pirimidin: C,T
• DNA merupakan komponen penyusun
kromosom ( materi penyimpan informasi
genetik)
Komponen DNA
• DNA berada dalam sel sehingga untuk
mendapatkannya harus merusak dinding dan
membran sel
Ekstraksi DNA
• Ekstraksi DNA : memisahkan DNA dari
komponen seluler lainnya.
• Ekstraksi DNA merupakan langkah yang tepat
untuk mempelajari DNA.
Prinsip Ekstraksi DNA
• Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan
presipitasi.
• Sentrifugasi : teknik untuk memisahkan campuran
berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul
yang mempunyai berat molekul besar akan berada
di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan
berada pada bagian atas tabung.
• Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam
fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian
atas dan pelet pada bagian bawah.
• Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan
untuk mengendapkan suatu komponen dari
campuran.
Aplikasi Ekstraksi DNA
1. Sains: DNA digunakan dalam beberapa aplikasi,
seperti pengenalan DNA dalam sel dan hewan atau
tanaman untuk tujuan diagnostik (kloning gen).
2 Obat: Untuk memprediksi virulensi
mikroorganisme.
3 Sains forensik: DNA untuk identifikasi individu
(misalnya untuk kasus perkosaan, pencurian,
kecelakaan, atau korban perang) dan uji paternitas.
Tahapan Ekstraksi dan
Purifikasi DNA
1. Perusakan dinding dan membran sel (Lisis sel)
2. Purifikasi DNA dari komponen lain :
• Ekstraksi organik & presipitasi
• Salting out
• Kromatografi Adsorpsi
• Menggunakan kit purifikasi DNA komersial
3. Pencucian dan Resuspensi
Pemilihan Metode
Tergantung Banyak Faktor:
1. Jumlah dan berat molekul DNA
2. Tingkat kemurnian yang diperlukan untuk
aplikasi
3. Waktu dan biaya
Lisis Sel
• Pada ekstraksi DNA dari tanaman, tahapan ini
terjadi perusakan dinding sel dan membran
seluler (membran plasma dan nukleus).
1. Dinding sel (terbuat dari selulosa) dirusak dengan
kekuatan mekanik (misal, menggerus daun).
2. Penambahan detergen akan menghancurkan membran
sel.
• Detergen mampu merusak membran karena
amphipatic (memiliki bagian hidrofilik dan hidrofobik),
sehingga molekul detergen dapat memisahkan
membran.
3. Akhir dari lisis yaitu bagian sel tanaman tersebar di
dalam larutan.
Lisis Sel
Merusak dinding sel:
-mekanik (digerus), mesin micro smash, sonikasi,
tekanan tinggi, beku-leleh.
-enzimatik (bakteri: lisozim), (kapang:kitinase &
selulase)
Lisis Sel
Penggunaan detergen untuk merusak membran lipid.
Purifikasi DNA
• Memisahkan DNA dari komponen seluler
lainnya seperti protein, lipid, RNA, dll.
• Secara efektif menginaktivasi endogenous
nucleases (enzim DNase) dan mencegahnya
dari memotong DNA genom adalah langkah
kunci dalam proses purifikasi. DNAse dapat
diinaktivasi dengan panas atau chelating
agents.
Ekstraksi Organik & Presipitasi
1. Menggunakan fenol/kloroform untuk menghilangkan
protein dari DNA.
• Fenol mendenaturasi protein dan melarutkan protein
yang terdenaturasi.
• Kloroform juga merupakan protein denaturan.
2. Penambahan garam.
• Garam mengganggu ikatan hidrogen antara air dan
molekul DNA.
3. DNA lalu dipresipitasi dari protein dengan
isopropanol/etanol
• Dengan adanya kation, etanol menginduksi perubahan
struktur molekul DNA yang menyebabkan molekul DNA
terpresipitasi dari larutan.
4. Dihasilkan pelet DNA dari sentrifugasi dan supernatan
dibuang.
Ekstraksi Organik & Presipitasi
Tahap 1: Ekstraksi dengan pelarut organik
Ekstraksi Organik & Presipitasi
Tahap 2: Presipitasi DNA
Metode Salting Out
Lisis sel
Pemecahan protein dengan enzim proteinase.
Presipitasi protein dengan konsentrasi garam
tinggi
Sentrifugasi akan menghilangkan protein
terpresipitasi
Supernatan berisi DNA
DNA lalu terpresipitasi dengan penambahan
etanol
DNA yang terpresipitasi diresuspensi dalam
buffer
Kromatografi Adsorpsi
Tahapan kromatografi adsorpsi
DNA dan kontaminan akan
berikatan dengan silika
Silika dicuci untuk
menghilangkan kontaminan
Silika dielusi untuk mendapatkan DNA
Menggunakan Kit Purifikasi
DNA Komersial
Larutan lisis pada umumnya berisi:
A. Sodium klorida
B. Trimethamine (tris ), yang merupakan buffer
untuk menjaga pH kagar konstan.
C. Ethylendiaminetetraacetic (EDTA), yang
mengikat ion metal.
D. Sodium deodecyl sulfate (SDS) berupa
detergen.
E. Enzim yang digunakan ekstraksi DNA adalah
proteinase K.
Pencucian dan Resuspensi
Pencucian:
DNA yang terpresipitasi mengandung garam asetat.
DNA tersebut “dicuci” dengan larutan etanol 70% untuk
menghilangkan garam dan impurities lain yang larut air,
tanpa meresuspensi DNA.
Resuspensi:
DNA yang bersih diresuspensi dalam buffer untuk
meyakinkan stabilitas dan penyimpanan jangka panjang.
Buffer yang umum digunakan untuk resuspensi yaitu
1xTE.
Overview Ekstraksi DNA
Penghancuran
dinding dan
membran sel
Sentrifugasi
untuk
memisahkan
larutan dari
DNA terlarut
Presipitasi DNA
menggunakan
isopropanol
Sentrifugasi
untuk
memisahkan
DNA dari garam
dan gula terlarut
Larutkan DNA
dalam buffer
(resuspensi)
Cuci pelet DNA
dengan etanol dan
keringkan pelet
Ekstraksi DNA pada Prokariot
• Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau
pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan
baik dengan cara mekanis seperti sonikasi,
tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara
enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah
berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel
yang relatif lunak dapat dengan mudah
diresuspensi
di
dalam
medium
bufer
nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang
lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen
yang kuat seperti triton X-100 atau dengan
sodium dodesil sulfat (SDS).
Ekstraksi DNA pada Eukariot
• Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan
perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis,
remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya
pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi.
Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau
pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian
disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan
proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan
remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga
perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari
RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian
dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan
alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan
CaCl .