bahan dan metode

BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu
Sampel rayap diambil dari Cagar Alam Yanlappa-Jasinga dan Kampus IPBDramaga, Bogor. Rayap diidentifikasi dan diuji perilaku agonistiknya di
Laboratorium Biosistematika Serangga. Ekstraksi dan amplifikasi gen COI rayap
dan gen 16S rRNA bakteri simbion di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan,
Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, IPB. Penelitian ini
dilaksanakan pada bulan September 2013 sampai Juni 2014.
Metode Penelitian
Pengambilan dan Identifikasi Sampel Rayap Tanah M. gilvus
Sampel rayap diambil dengan menggunakan teknik transek strip sensus
dengan ukuran 1 x 10 meter. Metode ini dilakukan dengan cara peneliti berjalan
sepanjang garis transek dan pengamatan dilakukan pada kedua sisi transek. Bila
menjumpai sarang rayap peneliti berhenti di suatu titik (di sarang rayap) dan
mencatat secara langsung posisi sampel dengan menggunakan GPS (Lampiran 1).
Rayap yang sudah dikoleksi dari lapangan dibedakan untuk perlakuan
lanjutan yaitu rayap kasta prajurit mayor dan minor disimpan di dalam alkohol 70%
untuk diidentifikasi hingga tingkat spesies menggunakan buku identifikasi Ahmad
(1959) dan Tho (1992) dengan mengukur panjang kepala dan mandibel, lebar
kepala, meso- dan metanotum, dan ruas antena. Sebagian rayap disimpan di alkohol
absolut untuk ekstraksi DNA rayap dan sebagian disimpan dalam botol dalam
keadaan segar atau hidup untuk pengujian perilaku agonistik dan isolasi bakteri
simbion dari saluran pencernaannya.
Analisis Kekerabatan Rayap Tanah M. gilvus dengan Pendekatan Perilaku
Uji Agonistik
Rayap yang telah diidentifikasi kemudian digunakan untuk pengujian
agonistik. Perilaku agonistik adalah kemampuan anggota koloni dalam mengenali
dan membedakan antara anggota koloninya atau bukan anggota koloninya (Shelton
dan Grace 1996). Rayap kasta pekerja dari setiap koloni digunakan untuk pengujian
agonistik. Satu individu rayap pekerja dari dua koloni yang berbeda ditempatkan di
wadah plastik sebagai arena pengujian dan diamati perilaku agonistiknya (Gambar
2). Setiap koloni rayap yang ditemukan, diujikan dengan keseluruhan koloni rayap
yang ditemukan (Tabel 1). Hasil perilaku agonistik pada tiap koloni rayap dicatat
dan dianalisis.
Rayap pekerja yang diadu di dalam arena diamati dengan melihat perilakunya
yaitu (1) tidak terlihat adanya reaksi, (2) antenasi dan grooming satu sama lain, (3)
berkerumun atau thigmotaxis, (4) mengetuk-ketukkan kepala atau tubuh ke substrat,
(5) lari berputar-putar, (6) menghindari satu sama lain, atau (7) berusaha menggigit.
Perilaku nomor 1-4 menunjukkan bahwa rayap bersifat pasif, perilaku 5-6
merupakan respon menghindari atau menolak, sedangkan perilaku nomor 7
merupakan respon menyerang secara langsung (Delphia et al. 2003).
10
Rayap yang mempunyai perilaku menolak dilaporkan ketika kedua rayap
saling menjauh, berusaha melarikan diri atau mundur dari yang lain. Rayap dengan
perilaku menyerang secara langsung dilaporkan ketika rayap menyerang dan
menggigit atau berusaha menggigit satu sama lain.
5 cm
a
b
Gambar 2 Skema uji agonistik rayap kasta pekerja M. gilvus
Keterangan: (a) pekerja dari koloni a, (b) pekerja dari koloni b
Analisis Kekerabatan Rayap Tanah M. gilvus dengan Teknik Molekuler
Ekstraksi, Amplifikasi, dan Sekuensing DNA gen COI pada Rayap
Ekstraksi DNA rayap. DNA total rayap diekstraksi menggunakan metode
Sambrook et al. (1989) yang telah dimodifikasi. Torak rayap kasta pekerja dipotong
menggunakan scalpel dan dimasukkan ke dalam tabung 1.5 mL. Bagian torak
dihancurkan sampai halus menggunakan micropestle di dalam tabung 1.5 mL
kurang lebih selama 1 menit dengan terlebih dahulu ditambah bufer CTAB 2% (pH
8) sebanyak 200 μl yang mengandung mercapto-ethanol 0.2%. Suspensi diinkubasi
pada suhu 65 ⁰C selama 15 menit. Larutan Chlorofoam: Isoamil alcohol (CI) (24:1)
(v/v) sebanyak 200 μL ditambahkan ke dalam suspensi dan dibolak-balik selama
30 menit. Suspensi yang sudah dibolak-balik kemudian disentrifugasi selama 20
menit dengan kecepatan 10 000 rpm sehingga dihasilkan supernatan.
Supernatan yang telah diperoleh dipindah ke tabung 1.5 mL yang baru
sebanyak 150 μL. Larutan RNAse ditambahkan sebanyak 2 μL dan diinkubasi pada
suhu 37 ⁰C selama 20 menit. Larutan Isopropanol sebanyak 200 μL ditambahkan
ke dalam supernatan untuk proses presipitasi (pengendapan DNA) dan diinkubasi
di lemari pendingin pada suhu -20 ⁰C selama 3 jam atau semalam (overnight).
Tabung yang berisi cairan supernatan DNA total rayap hasil inkubasi
disentrifugasi pada suhu 4 ⁰C dengan kecepatan 12 000 rpm selama 20 menit.
Supernatan yang terbentuk dibuang dan tersisa pelet yang mengandung DNA total.
Pelet dicuci dengan etanol 70% sebanyak 700 μL dan disentrifugasi kembali pada
suhu 4 ⁰C dengan kecepatan 12 000 rpm selama 3 menit. Supernatan yang terbentuk
kembali dibuang dan tersisa pelet DNA yang sudah bersih. Pelet DNA total rayap
disuspensikan kembali dengan larutan Tris-EDTA (TE) pH 8(0.5 mM) (Lampiran
4) sebanyak 30 μL.
Amplifikasi gen COI pada rayap. Amplifikasi gen COI pada rayap hasil
ekstraksi dilakukan untuk dua individu M. gilvus dari tiap lokasi pengambilan
sampel. Proses amplifikasi menggunakan mesin PCR (ESCO). Amplifikasi
11
fragmen gen COI M. gilvus menggunakan primer forward dan reverse dengan
panjang amplikon sebesar 762 pb (pasang basa).
Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen COI dari rayap M. gilvus
merupakan hasil design manual dan perangkat lunak Primer 3
(http://frodo.wi.mit.edu/). Primer forward dan reverse dibuat karena primer spesifik
untuk gen COI pada rayap M. gilvus belum ada. Sekuen DNA mitokondria dari
rayap M. barneyi (No. Akses Genbank: JX050221) digunakan sebagai dasar
pembuatan design primer pada penelitian ini. Panjang amplikon dari primer
forward dan reverse dari gen COI rayap M. barneyi berukuran sekitar 762 basa
(Gambar 3). Masing-masing sekuen primer forward dan reverse mempunyai
panjang 23 basa (Tabel 1).
1468
3017
COI
tRNA-Tyr
F-Mt D3
1733-1796
tRNA-Leu
R-Mt D3
2489-2512
762 pb
Gambar 3 Posisi primer forward dan reverse untuk amplifikasi gen COI
berdasarkan DNAmt M. barneyi (No. aksesi JX050221)
Tabel 1 Primer untuk amplifikasi gen COI dan posisi primer berdasarkan DNAmt
M. barneyi (No. aksesi JX050221)
Nama
Primer
F-Mt D3
R-Mt D3
Sekuen primer 5’-3’
GATTACTACCACCATCACTAACC
ACTACTCCTGTAAGTCCTCCTAT
Posisi primer
1773-1796
2489-2512
Panjang
amplikon
(bp)
762
Keterangan: F: Primer Forward, R: Primer Reverse, Mt: Mitokondria, D: Design
Total volume reaksi PCR yang digunakan adalah 25 μl yang terdiri atas 9.5
μl air destilata steril, 1 μl primer forward 20 pM, 1 μl primer reverse 20 pM, 1 μl
DNA cetakan, dan 12.5 μl PCR Master Mix 2X (Dream taqGreen Fermentas).
Kondisi PCR menggunakan modifikasi Singla et al. (2013) yaitu pre-denaturation
pada suhu 94 oC selama 5 menit, siklus yang digunakan sebanyak 35 (denaturation
pada suhu 94 oC selama 1 menit, annealing pada suhu 50 oC selama 30 detik,
extension pada suhu 72 oC selama 1 menit), dan final elongation pada suhu 72 oC
selama 7 menit.
12
Hasil PCR kemudian dielektroforesis menggunakan agarose 1% pada
tegangan 75 volt selama 30 menit dan divisualisasi menggunakan UV
transilluminator. Pita-pita yang tervisualisasi kemudian dianalisis ukuran masingmasing fragmen DNA yang dibandingkan dengan marker 1 kb (Fermentas).
Sekuensing DNA gen COI pada rayap. Identifikasi spesies lebih lanjut
dilakukan analisis homologi basa nukleotida. Produk PCR disekuensing (proses ini
dilakukan oleh perusahaan sekuensing) selanjutnya diolah menggunakan perangkat
lunak BioEdit 7.2. (http://bioedit.software.informer. com/7.2/) untuk dibandingkan
dengan sekuen database dari GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Analisis Homologi Sekuen DNA Gen COI pada Rayap Tanah M. gilvus
Analisis homologi dilakukan pada sekuen gen COI M. gilvus dengan data
GenBank. Program Basic Local Alignment Seacrh Tool-Nucleotide (BLAST-N)
(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) digunakan untuk analisis homologi. Sekuen
nukleotida gen COI M. gilvus di-alignment dengan data sekuen nukleotida gen COI
rayap anggota Termitidae yang diperoleh dari GenBank (Tabel 2). Data sekuen
nukleotida untuk gen COI M. gilvus yang diperoleh dari GenBank dianalisis
homologi sekuen nukleotida gen COI menggunakan program Clustal W (Thompson
et al. 1994) dan program BioEdit Versi 7.2.
Analisis Filogeni dan Jarak Genetik Rayap Tanah M. gilvus
Konstruksi pohon filogeni dilakukan antar gen COI M. gilvus (in-group) dan
spesies rayap M. annandalei (out-group) (Tabel 2). Proses analisis filogeni tersebut
menggunakan metode Neighbor-Joining (NJ) dan Maximum-Parsimony (MP)
dengan bootstrap 1000x pada program MEGA 6 (Tamura et al. 2011).
Analisis jarak genetik dilakukan antara gen COI M. gilvus dan M. annandalei
(Tabel 2). Proses analisis jarak gen COI menggunakan program BioEdit Versi 7.2.
Tabel 2 Database gen COI in-group dan out-group yang diperoleh dari GenBank
untuk analisis filogeni dan jarak genetik
Group Organisme
Famili
Kode
No. aksesi
M. gilvus
Termitidae
Mg 4 DMG
InM. gilvus
Termitidae
Mg 6 DMG
group
M. gilvus
Termitidae
Mg 4 JSG
M. gilvus
Termitidae
Mg 5 JSG
M. gilvus
Termitidae
Mg 13 LAO
AB909013
M. gilvus
Termitidae
Mg 14 LAO
AB909014
M. gilvus
Termitidae
Mg 15 LAO
AB909015
M. gilvus
Termitidae
Mg 16 LAO
AB909016
M. gilvus
Termitidae
Mg 17 LAO
AB909017
OutM. annandalei
Termitidae
Man 09 LAO
AB909009
group
M. annandalei
Termitidae
Man 10 LAO
AB909010
Keterangan: Mg: Macrotermes gilvus, Man: M. annandalei, DMG: Kampus IPB Dramaga, JSG:
Cagar Alam Yanlappa-Jasinga, LAO: Laos (negara asal spesimen rayap)
13
Inventarisasi Bakteri Simbion Rayap Tanah M. gilvus
Isolasi Bakteri Simbion pada Saluran Pencernaan Rayap
Isolasi bakteri simbion pada saluran pencernaan dilakukan pada rayap kasta
pekerja. Sebanyak tiga rayap kasta pekerja diambil dari masing-masing lokasi
pengambilan sampel kemudian dicuci dengan air steril dan disterilisasi permukaan
tubuhnya dengan alkohol 70% sebanyak 3 kali. Bagian tubuh yang telah disterilisasi
permukaan kemudian dikelupas kutikula abdomen luarnya untuk diambil saluran
pencernaan tengah (mesenteron) dan belakang (proktodeum).
Saluran pencernaan tengah dan belakang yang sudah diperoleh lalu digerus
di dalam tabung 1.5 mL menggunakan hand pestle dan ditambahkan air steril 1 mL.
Tabung yang berisi suspensi bakteri diambil sebanyak 1 mL untuk ditambahkan ke
dalam tabung reaksi yang berisi air steril 9 mL dan dilakukan pengenceran berseri
yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, dan 10-5. Tabung reaksi yang berisi suspensi bakteri
diambil sebanyak 0.1 mL untuk dilakukan pencawanan (platting) ke dalam media
NA (Nutrient Agar) (Lampiran 2). Suspensi bakteri hasil pencawanan
diinkubasikan pada suhu ruang (25 oC) selama 24 sampai 48 jam sebelum
dikarakterisasi morfologi dan fisiologinya.
Identifikasi Morfologi, Fisiologi, dan Molekuler Bakteri Simbion
Identifikasi morfologi dan fisiologi. Isolat bakteri yang telah diisolasi
diamati secara morfologi yaitu berdasarkan ciri-ciri warna, bentuk, dan pinggiran
koloni. Isolat bakteri yang telah diisolasi diamati secara fisiologi yaitu berdasarkan
sifat fisiologi menggunakan uji gram, dan uji aerobik (Schaad et al. 2001). Uji Gram
dilakukan dengan mengambil satu inokulum dari isolat bakteri kemudian
ditambahkan larutan KOH 3%. Suspensi bakteri yang terbentuk menunjukkan
Gram positif (+) jika suspensi tidak berlendir (menggumpal) dan jika terbentuk
terlihat adanya lendir menunjukkan isolat bakteri termasuk Gram negatif (-).
Uji aerobik dilakukan dengan menumbuhkan bakteri ke media aerobik
(Schaad et al. 2001). Isolat bakteri yang tumbuh jika berwarna hijau maka termasuk
bersifat an-aerobik, jika tidak terlihat adanya perubahan warna pada media maka
isolat bakteri bersifat aerobik.
Identifikasi molekuler
a. Ekstraksi DNA Bakteri Simbion
Ekstraksi DNA total bakteri menggunakan metode Sambrook et al. (1989)
yang telah dimodifikasi. Pelet bakteri yang sudah diperoleh dari hasil pembiakan di
media NB (Nutrient Broth) (Lampiran 3), kemudian digunakan untuk ektraksi
DNA bakteri. Pelet disuspensikan dengan 250 uL buffer TE (mengandung 5 mg/ml
lisozym) kemudian di vortex sampai homogen. Suspensi bakteri diinkubasi pada
suhu 37 oC selama 30 menit. Larutan SDS 10% sebanyak 50 uL ditambahkan dan
dibolak-balik agar tercampur. Suspensi diinkubasi kembali pada suhu 37 oC selama
1 jam. Larutan NaCl 5M sebanyak 65 uL dan 80 uL CTAB-NaCl ditambahkan ke
dalam suspensi dan diinkubasi kembali pada suhu 65 oC selama 20 menit. Larutan
Clhorofoam:isoamil alkohol (24:1) (v/v) sebagai pelarut organik ditambahkan
sebanyak 450 uL ke dalam suspensi dan dikocok dengan gentle menggunakan
tangan selama 30 menit. Suspensi disentrifugasi pada kecepatan 11 000 rpm selama
15 menit pada suhu 25 0C. Supernatan yang terbentuk ditransfer ke tabung
14
eppendorf baru sebanyak + 400 uL. Supernatan yang ditransfer ke tabung baru
ditambahkan dengan isopropanol sebanyak 400 uL kemudian diinkubasi selama 30
menit atau semalam (overnight) pada suhu -20 0C.
Supernatan yang mengandung DNA total bakteri hasil presipitasi
disentrifugasi pada suhu 4 ⁰C dengan kecepatan 12 000 rpm selama 15 menit.
Supernatan yang terbentuk dibuang dan tersisa pelet yang mengandung DNA total.
Pelet dicuci dengan etanol 70% dan disentrifugasi pada suhu 4 ⁰C dengan kecepatan
12 000 rpm selama 3 menit. Supernatan yang terbentuk kembali dibuang dan tersisa
pelet DNA yang sudah bersih. Pelet disuspensikan kembali dengan larutan TE pH
8 (0.5 mM) sebanyak 30 μL.
b. Amplifikasi gen 16S rRNA Bakteri Simbion
Amplifikasi gen 16S rRNA bakteri simbion hasil ekstraksi dilakukan pada
bakteri simbion hasil identifikasi morfologi dan fisiologi dari masing-masing isolat.
Proses amplifikasi menggunakan mesin PCR (ESCO). Primer yang digunakan
adalah primer unversal 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) (Lane 1991) dan
1492R (5’-TTACCTTGTTACGACTT-3’) (Turner et al. 1999). Amplifikasi fragmen
gen 16S rRNA menggunakan primer universal forward dan reverse yang akan
menghasilkan amplikon dengan panjang 1500 pb (pasang basa).
Total volume reaksi PCR yang digunakan adalah 25 μl yang terdiri atas 9.5
μl air destilata steril, 1 μl primer forward 20 pM, 1 μl primer reverse 20 pM, 1 μl
DNA cetakan, dan 12.5 μl PCR Master Mix 2X (Dream taqGreen Fermentas).
Kondisi PCR, pre-denaturation pada suhu 95 oC selama 5 menit, siklus yang
digunakan sebanyak 35 (denaturation pada suhu 95 oC selama 1 menit, annealing
pada suhu 55 oC selama 1 menit, extension pada suhu 72 oC selama 2 menit), dan
final elongation pada suhu 72 oC selama 10 menit.
Hasil PCR kemudian dielektroforesis menggunakan agarose 1% pada
tegangan 75 volt selama 30 menit dan divisualisasi menggunakan UV
transilluminator. Pita-pita DNA yang tervisualisasi kemudian dianalisis ukuran
masing-masing fragmen DNA yang dibandingkan dengan marker 1 kb (Fermentas).
c. Sekuensing DNA Gen 16S rRNA Bakteri Simbion
Identifikasi spesies lebih lanjut dilakukan dengan analisis homologi basa
nukleotida. Hasil amplifikasi gen 16S rRNA bakteri simbion disekuensing (proses
ini dilakukan oleh perusahaan sekuensing) selanjutnya diolah menggunakan
perangkat lunak BioEdit 7.2 (http://bioedit.software.informer.com/7.2/) untuk
dibandingkan dengan sekuen database dari GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov).
d. Homologi DNA Gen 16S rRNA Bakteri Simbion
Analisis homologi dilakukan pada sekuen gen 16S rRNA bakteri simbion
dengan data GenBank. Program Basic Local Alignment Seacrh Tool-Nucleotide
(BLAST-N) (www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) digunakan untuk analisis homologi.