Templat tesis dan disertasi
advertisement
PEMANFAATAN SENYAWA METABOLIT BAKTERI ENDOFIT UNTUK MENEKAN CENDAWAN PATOGEN TERBAWA BENIH KEDELAI NOVI MALINDA SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Pemanfaatan Senyawa Metabolit Bakteri Endofit untuk Menekan Cendawan Patogen Terbawa Benih Kedelai adalah benar karya saya denganarahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, November 2015 Novi Malinda NIM A352130091 RINGKASAN NOVI MALINDA.Pemanfaatan Senyawa Metabolit Bakteri Endofit untuk Menekan Cendawan Patogen Terbawa Benih Kedelai. Dibimbing oleh BONNY POERNOMO WAHYU SOEKARNO dan TITIEK SITI YULIANI. Salah satu kendala dalam penyediaan benih kedelai yang bermutu adalah patogen terbawa benih yang dapat menyebabkan kejadian penyakit pada tanaman di lapangan. Cendawan merupakan salah satu kelompok patogen terbawa benih yang penting. Salah satu pengendalian cendawan patogen terbawa benih adalah dengan menggunakan bakteri endofit. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan bakteri potensial dan mengetahui kemampuan bakteri endofit beserta senyawa metabolitnya untuk menghambat pertumbuhan cendawan patogen terbawa benih. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Balai Proteksi Tanaman Pangan dan Hortikultura Medan Sumatera Utara dan Laboratorium Mikologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor.Isolasi bakteri endofit dari tanaman kedelai dilakukan dengan menggunakan metode sterilisasi permukaan sedangkan isolasi cendawan patogen dilakukan dengan metode inkubasi yaitu blotter test. Pemilahan bakteri yang berpotensi dilakukan dengan uji respons hipersensitif pada daun tembakau dan uji daya hambat bakteri terhadap cendawan Fusarium oxysporum. Ekstraksi senyawa metabolit dilakukan dari ketiga bakteri yang berpotensi.Senyawa metabolit yang diperoleh diuji terhadap cendawan patogen secara in vitro dan in vivo untuk mengetahui metabolit yang paling berpotensi menekan pertumbuhan F. oxysporum. Hasil pengujian menunjukkan dari 48 isolat bakteri endofit nonpatogenik yang dapat diisolasi terdapat tiga bakteri endofit potensial yang mampu menghambat pertumbuhan cendawan patogen Fusarium oxysporum. secara in vitro. Ketiga isolat bakteri endofit tersebut adalah EDA 3 (Listeria sp.), EBA 6 (Pseudomonas sp.), dan EBA 7 (Xenorhabdus sp.) dengan daya penghambatan sebesar 60.14%, 57.69%, 57.08% secara berturut-turut. Senyawa metabolit dari ketiga bakteri yang menunjukkan daya hambat tertinggi berasal dari bakteri Xenorhabdus sp. dan Listeria sp. yaitu sebesar 34.88% dan 25.53% secara berturut-turut. Perlakuan perendaman benih dengan senyawa metabolit bakteri endofit Xenorhabdus sp. dan Listeria sp. juga mampu menurunkan infeksi F. oxysporum.Xenorhabdus sp. mampu menekan tingkat infeksi sebesar 76.6789.47% pada metode blotter test dan growing on test. Listeria sp. mampu menekan tingkat infeksi sebesar 63.16-78.24% pada metode blotter test dan growing on test. Bakteri endofit asal tanaman kedelai yang memiliki potensi untuk menghambat pertumbuhan F. oxysporum adalah Listeria sp., Pseudomonas sp. dan Xenorhabdus sp. secara in vitro.Senyawa metabolit yang berpotensi dalam menghambat pertumbuhan F. oxysporum adalah Xenorhabdus sp. dan Listeria sp. secara in vitro dan in vivo. Penelitian ini diharapkan dapat menjadi pedoman dalam pengembangan pengendalian cendawan patogen terbawa benih penyebab penyakit tanaman. Kata kunci: blotter test, Fusarium oxysporum, respons hipersensitif SUMMARY NOVI MALINDA.Utilization of Endhophytic Bacteria’s Metabolite Compound to Inhibit Growth of Seedborne Pathogenic Fungi of Soya Seed.Supervised by BONNY POERNOMO WAHYU SOEKARNO and TITIEK SITI YULIANI. The most problems to supply of soya seed is seedborne pathogen that causes disease incidenct on plant in yard. The fungi is one of the important pathogenic seedborne. One of the disease control of the seedborne pathogenic fungi is using endophytic bacteria from soybean plant as biological control agent. The research aimed to know the ability of endophytic bacteria and metabolites compound to inhibit growth of fungal seedborne in soya seed. The research was conducted at the Laboratory of Balai Proteksi Tanaman Pangan dan Hortikultura Medan, North Sumatera and Laboratory of Mikologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian of Institut Pertanian Bogor. The Isolation procedure of these endophytic bacteria from soybean plant was done using surface sterilization method.The isolation procedure of pathogenic fungi was done using blotter test method. The screening of the potencial bacteria was done by hypersensitive response test and inhibitory test toward pathogenic fungi Fusarium oxysporum.Extraction of the metabolites compound was done from the three potencial isolates of bacteia. The metabolite compoundwas tested toward the pathogenic fungi by in vitro and in vivo to knowing the most metabolite able to suppressed growth of F. oxysporum. Result of test showed that from forty eight of the nonpathogenic isolates endophytic bacteria. There are three potential isolates from in vitro test that able inhibit the growth of Fusarium oxysporum which is EDA 3 (Listeria sp.), EBA 6 (Pseudomonas sp.), and EBA 7 (Xenorhabdus sp.) with 60.14%, 57.69%, and 57.08% respectively. The metabolites compound also able to inhibited colony of F. oxysporum by in vitro and in vivo test are Xenorhabdus sp. and Listeria sp. The metabolites from three isolates showed that Xenorhabdus sp. and Listeria sp. are isolates that can inhibit F. oxysporumof 34.88% and 25.53% by in vitro respectively. Seedtreatment with the metabolites compound of Xenorhabdus sp. and Listeria sp. also can reduce the pathogenic fungi infection. Xenorhabdus sp.able to suppress infection of pathogenic fungi of 76.67-89.47% on blotter test and growing on test method.Listeria sp.able to suppress infection of pathogenic fungi of 63.16-78.24% on blotter test and growing on test method. The potential of endophytic bacteria from soybean plant are Listeria sp., Pseudomonas sp. and Xenorhabdus sp. to inhibit F. oxysporum by in vitro. The potential of metabolite compound are Xenorhabdus sp. and Listeria sp. to inhibit F. oxysporum by in vitro and in vivo. The research was expected can be orientation in development of controlling the seedborne pathogenic fungi caused plant disease. Keywords: blotter test, Fusarium oxysporum, hypersensitive response © Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB PEMANFAATAN SENYAWA METABOLIT BAKTERI ENDOFIT UNTUK MENEKAN CENDAWAN PATOGEN TERBAWA BENIH KEDELAI NOVI MALINDA Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Fitopatologi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Elis Nina Herliyana, MSi Judul Tesis : Pemanfaatan Senyawa Metabolit Bakteri Endofit untuk Menekan Cendawan Patogen Terbawa Benih Kedelai Nama : Novi Malinda NIM : A352130091 Disetujui oleh Komisi Pembimbing Dr Ir Bonny PW Soekarno, MS Ketua Dr Ir Titiek Siti Yuliani, SU Anggota Diketahui oleh Ketua Program Studi Fitopatologi Dekan Sekolah Pascasarjana Prof Dr Ir Sri Hendrastuti Hidayat, MSc Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr Tanggal Ujian:08 Oktober 2015 Tanggal Lulus: PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan September 2014 ini ialah cendawan patogen terbawa benih penyebab penyakit tanaman, dengan judul Pemanfaatan Senyawa Metabolit Bakteri Endofit untuk Menekan Cendawan Patogen Terbawa Benih Kedelai. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Ir Bonny Poernomo Wahyu Soekarno, MS dan Dr Ir Titiek Siti Yuliani, SU selaku pembimbing yang telah banyak memberi arahan dan saran selama penulis melaksanakan penelitian hingga menjadi suatu bentuk karya ilmiah serta Dr Ir Elis Nina Herliyana, MSi selaku dosen penguji luar komisi yang telah banyak memberi saran yang membangun dalam penulisan karya tulis ilmiah ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada orangtua tercinta, ayahanda Tasman dan ibunda Suryati, SH atas segala doa dan kasih sayang yang tulus dan tak ternilai harganya kepada penulis. Ungkapan terima kasih penulis sampaikan pula kepada yang terhormat, Bapak Saidin Piliang dan Ibu Jamilah atas dukungan dan perhatiannya kepada penulis. Ungkapan terima kasih juga penulis ungkapkan kepada keluarga besar ayah dan ibu yang telah bersedia memberikan semangat kepada penulis.Terima kasih kepada staf Balai Proteksi Tanaman Pangan dan Hortikultura Sumatera Utara atas bantuan dan dukungannya, serta kepada Ditjen Dikti atas pemberian beasiswa selama menjalankan studi di Institut Pertanian Bogor.Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada laboran dan anggota Laboratorium Mikologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman Fakultas Pertanian IPB.Teman-teman Fitopatologi SPs IPB angkatan 2013 Juwi, kak Novi, kak Jabal, mbak Putze, Mbak Mei, Nisa, Irwanto, Wafa, Ipul, Diana, Pandu, Kak Tika, Kak Cica, Kak Ria, Bulan, Hamda, Mbak Santi, dan Maman atas kebersamaannya. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada teman-teman di kost Bu Roma atas segala perhatian yang tulus layaknya keluarga bagi penulis.Ungkapan terima kasih penulis sampaikan khusus kepada sahabat seperjuangan Andini Hanif, Arifda Ayu, dan Dewi Novina.Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada temanteman yang telah membantu selama penyelesaian tugas akhir ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, November 2015 Novi Malinda DAFTAR ISI DAFTAR TABEL vi DAFTAR GAMBAR vi DAFTAR LAMPIRAN vi 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian Ruang Lingkup Penelitian 1 1 2 2 2 3 2 TINJAUAN PUSTAKA Sejarah dan Manfaat Kedelai (Glycine max L. Merril) Mutu Benih dan Cendawan Patogen Terbawa Benih Kedelai Bakteri Endofit Tanaman Pengendalian Patogen Terbawa Benih Penyebab Penyakit Tanaman 4 4 5 7 8 3 METODE Waktu dan Tempat Penelitian Bahan Uji Perendaman Benih Isolasi Bakteri Endofit dari Kedelai Isolasi Cendawan Patogen Terbawa Benih Kedelai Uji Daya Hambat Bakteri Endofit terhadap Cendawan Patogen secara in Vitro Pengukuran Kurva Pertumbuhan Bakteri Endofit Ekstraksi dan Uji Daya Senyawa Metabolit Bakteri Endofit terhadap Cendawan Patogen secara in Vitro Uji Perlakuan Benih dengan Senyawa Metabolit Bakteri Endofit Analisis KomponenSenyawa Metabolit Bakteri Endofit Analisis Data 10 10 10 10 10 11 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Perendaman Benih Isolat Bakteri Endofit dari Kedelai Isolat Cendawan Patogen Terbawa Benih Kedelai Daya Hambat Bakteri Endofit terhadap Fusarium oxysporum secara in Vitro Kurva Pertumbuhan Bakteri Endofit Daya Hambat SenyawaMetabolit Bakteri Endofit terhadap Fusarium oxysporum secara in Vitro Perlakuan Benih dengan Senyawa Metabolit Bakteri Endofit Karakterisasi dan Identifikaasi Isolat Bakteri Endofit Analisis Komponen Senyawa Metabolit Isolat Bakteri Endofit 11 12 12 13 14 14 15 15 15 16 19 21 22 23 27 29 5 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran 32 32 32 DAFTAR PUSTAKA 33 LAMPIRAN 37 RIWAYAT HIDUP 42 DAFTAR TABEL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Waktu perendaman benih kedelai di dalam cairan Isolat bakteri endofit dari tanaman kedelai Jenis cendawan patogen Daya hambat bakteri endofit terhadap F. oxysporum secara in vitro Daya hambat senyawa metabolit bakteri endofit terhadap F. oxysporum secara in vitro Tingkat infeksi dan penekanan infeksi cendawan patogen terbawa benih kedelai Pengaruh senyawa metabolit bakteri endofit terhadap pertumbuhan tanaman kedelai Karakteristik isolat bakteri endofit (Sumber ICBB) Hasil Py-GCMS senyawa metabolit isolat bakteri EBA 7 Hasil Py-GCMS senyawa metabolit isolat bakteri EDA 3 15 16 17 19 23 24 25 27 29 30 DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Bagan alir ruang lingkup penelitian Metode pengukuran daya hambat bakteri terhadap koloni cendawan Isolat bakteri endofit asal tanaman kedelai Jenis cendawan patogen terbawa benih kedelai Fusarium oxysporum Penghambatan koloniF. oxysporum oleh bakteri endofit Pertumbuhan isolat bakteri endofit Penghambatan koloniF. oxysporumoleh senyawa metabolit bakteri EBA 7 Penghambatan koloniF. oxysporum oleh senyawa metabolit bakteri EDA 3 Tingkat infeksi F. oxysporum pada benih kedelai Penekanan tingkat infeksi cendawan patogen terbawa benih kedelai Daya berkecambah kedelai Tinggi tanaman kedelai Pertumbuhan tanaman kedelai 3 12 15 17 18 19 21 22 22 24 24 26 26 26 DAFTAR LAMPIRAN 1 Respons hipersensitifpada daun tembakau oleh bakteri endofit 2 Analisis komponen senyawa metabolit isolat bakteri EBA 7 3 Analisis komponen senyawa metabolit isolat bakteri EDA 3 37 40 41 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Kedelai (Glycine max(Linneous) Merril) merupakan salah satu tanaman sumber protein yang penting di Indonesia.Berdasarkan luas panen, kedelai menempati urutan ketiga sebagai tanaman palawija setelah jagung dan ubi kayu di Indonesia. Menurut Badan Pusat Stastistik atau BPS (2013),produksi kedelai tahun 2013 (ARAM II) diperkirakan sebesar 807.57 ribu ton biji kering, menurun sebanyak 35.58 ribu ton (4.22%) dibandingkan tahun 2012. Penurunan produksi kedelai tahun 2013 tersebut diperkirakan terjadi di Jawa sebesar 61.71 ribu ton.Penurunan produksi kedelai diperkirakan terjadi karena turunnya luas panen seluas 13.49 ribu hektar (2.38%) dan produktivitas sebesar 0.28 kuintal/ha (1.89%). Kedelai mempunyai banyak manfaat, sehingga merupakan tanaman penting bagi masyarakat di Indonesia.Sebagai bahan makanan, kedelai banyak mengandung protein, lemak, dan karbohidrat, sehingga baik untuk memenuhi kebutuhan gizi masyarakat. Kebutuhan kedelai setiap tahun meningkat, sedang peningkatan produksi rendah bila dibandingkan dengan peningkatan kebutuhan yang mencapai 18% tiap tahun (Ratulangi 2004). Kebutuhan kedelai nasional sangat tinggi, sehingga sebagian harus mengimpor dari Amerika, oleh karena itu perlu upaya untuk peningkatan produktivitas kedelai nasional.Berkaitan dengan hal tersebut, maka dibutuhkan benih kedelai yang berkualitas serta mempunyai daya kecambah yang baik.Peningkatan produksi kedelai dalam negeri harus ditingkatkan sebagai upaya untuk mengurangi impor kedelai (Indartono 2011). Salah satu kendala dalam penyediaan benih kedelai yang bermutu adalah kesehatan benih. Berbagai penyakit tanaman di lapang disebabkan oleh patogen terbawa benih. Cendawan merupakan salah satu kelompok patogen terbawa benih yang penting. Cendawan patogen terbawa benih kedelai antara lain Phomopsis sp., Penicillium sp.,Aspergillus sp., Cercospora sp., Alternaria sp., dan Fusarium sp. Colletotrichum dematium var. trucata (Schwein) Arx.(McGee & Nyvall 2008; Wain-Tassi et al. 2011). Berbagai upaya telah dilakukan untuk mengendalikan patogen terbawa benih secara fisik, kimia dan biologi. Secara fisik, benih dikeringkan baik secara alami maupun dengan bantuan alat pengering untuk menurunkan kadar air benih. Selain itu, perlakuan fisik lainnya adalah dengan menyimpan benih pada suhu rendah untuk meminimalkan tumbuhnya patogen terbawa benih.Walaupun demikian, perlakuan tersebut kurang efektif karena tidak berlaku untuk benihbenih tertentu karena akan mengurangi vigor dan viabilitas benih serta beberapa patogen tertentu masih mampu tumbuh atau dorman saat penyimpanan. Secara kimia, benih diberi perlakuan dengan penambahan bahan kimia yaitu fungisida. Penggunaan bahan kimia yang berlebih tentunya akan berdampak pada kesehatan konsumen maupun lingkungan, sehingga dicari alternatif yaitu pengendalian secara biologi. Salah satu cara pengendalian hayati yang sedang banyak dikembangkan untuk mengendalikan penyakit tanaman adalah pemanfaatan potensi bakteri endofit. Bakteri endofit merupakan bakteri yang bersimbiosis dengan tanaman 2 tanpa menimbulkan gejala penyakit. Bakteri endofit memberikan keuntungan bagi tanaman inangnya seperti menstimulasi zat pengatur tumbuh, fiksasi nitrogen, dan induksi ketahanan terhadap patogen tumbuhan. Pemanfaatan bakteri endofit asal tanaman kedelai diharapkan dapat digunakan sebagai agens pengendali cendawan patogen terbawa benih kedelai. Isolasi bakteri endofit dapat diambil dari akar, nodul (bintil akar), batang dan daun tanaman kedelai yang sehat. Menurut penelitian yang dilakukan Shu-Mei et al. (2008), bakteri endofit Bacillus amyloquafaciens (Priest) asal tanaman kedelai mampu menghambat pertumbuhan cendawan patogen Fusarium oxysporum (Schlecht) Synder & Hansen sebesar 80.2%-96.7% secara in vitro. Bagian nodul dari tanaman kedelai lebih banyak mengandung bakteri endofit. Bakteri endofit yang terdapat pada nodul tanaman kedelai adalah Deinococcus radiophilus (Lewis) Brooks & Muray, Staphylococcus lentus (Kloose), B. fastidiosus (den Dooren Jong), dan Tsukamurella inchonensis (Yassin) (Hung & Annapurna 2004). Perlakuan benih dapat dilakukan dengan perendaman menggunakan metabolit sekunder dari bakteri endofit.B. endoradicis juga ditemukan berada pada akar tanaman kedelai (Zhang et al. 2012). Perumusan Masalah Pengendalian pasca panen benih kedelai masih menjadi kendala dalam produktivitas dan kualitas benih.Banyak patogen terbawa benih kedelai yang dapat menurunkan produktivitas dan kualitas benih saat ditanam.Untuk itu perlu dilakukan penelitian dalam mengendalikan cendawan patogen terbawa benih.Salah satunya dengan menggunakan senyawa metabolit bakteri endofit asal tanaman kedelai untuk perlakuan benih sebelum benih ditanam di lapangan. Pengendalian dengan senyawa metabolit tersebut diharapkan lebih efisien dan efektifdibanding dengan pengendalian fisik dan penggunaan fungisida. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk menemukan bakteri endofit yang mampu menghambat pertumbuhan cendawan patogen terbawa benih kedelai dan mengetahui potensi senyawa metabolit yang dihasilkan oleh bakteri endofit yang mempunyai potensi mengendalikan cendawan patogen terbawa benih. Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi kepada masyarakat, khususnya tentang kemampuan bakteri endofit asal tanaman kedelai.Bakteri endofit dengan senyawa metabolitnya dapat mengendalikan cendawan patogen terbawa benih sehingga mampu meningkatkan kuantitas dan kualitas produksi kedelai serta mengurangi biaya pengelolaan benih pascapanen serta berwawasan lingkungan. 3 Ruang Lingkup Penelitian Ruang lingkup penelitian ini adalah uji perendaman benih kedelai, isolasi bakteri endofit dari tanaman kedelai dan seleksi bakteri endofit, isolasi cendawan patogen terbawa benih kedelai, uji daya hambat bakteri endofit terhadap cendawan patogen terbawa benih kedelai, identifikasi isolat bakteri endofit, pengukuran kurva pertumbuhan, uji daya hambat senyawa metabolit bakteri endofit terhadap cendawan patogen, perlakuan benih dengan senyawa metabolit bakteri endofit, dan analisis senyawa metabolit bakteri endofit (Gambar 1). Uji perendaman benih Karakterisitik dan identifikasi bakteri endofit Isolasi bakteri endofit Isolasi cendawan patogen benih Uji respon hipersensitif Karakterisitik dan identifikasi cendawan endofit Uji kultur ganda Pengukuran kurva pertumbuhan Produksi senyawa metabolit bakteri endifit Analisis senyawa metabolit Uji daya hambat senyawa metabolit Uji perlakuan benih Gambar 1 Bagan alir ruang lingkup penelitian 4 2 TINJAUAN PUSTAKA Sejarah dan Manfaat Kedelai (Glycine max L. Merril) Kedelai awalnya dikenal dengan beberapa nama botani, yaituGlycine soja dan Soja max. Namun pada tahun 1948 telah disepakati bahwa nama botani yang dapat diterima dalam istilah ilmiah, yaitu Glycinemax (L.) Merril (Irwan 2006). Klasifikasi tanaman kedelai adalah kingdom Plantae, divisi Spermatophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Dicotyledoneae, ordo Rosales, famili Leguminoceae, genus Glycine, spesies Glycine max (L.) Merril. Kedelai (Glycine max(L.)Merril) merupakan salah satu bahan pangan yang banyak digunakan di Indonesia. Menurut Sudantha (2010), tanaman kedelai merupakan salah satu jenis palawija yang penting di Indonesia, karena biji kedelai banyakdibutuhkan oleh masyarakat sebagai bahanpembuat tahu, tempe, oncom dan kecap. Kedelai berkulit kuning lebih banyak manfaatnya misalnya untuk kebutuhan industri tempe, tahu, susu, dan minuman sari kedelai (Purwanti 2004). Kacang kedelai yang diolah menjadi tepung kedelai secara garis besar dapat dibagimenjadi dua kelompok manfaat utama, yaitu olahan dalam bentuk protein kedelai danminyak kedelai. Kedelai dalam bentuk protein dapat digunakan sebagai bahan industri makanan seperti susu, vetsin, kue-kue, permen dan daging nabati serta sebagai bahan industri bukan makanan seperti kertas, cat cair, tintacetak dan tekstil.Sedangkan kedelaidalam bentuk minyak kedelai digunakan sebagai bahan industri makanan dan non makanan. Industri makanan dari minyak kedelai yang digunakansebagai bahan industri makanan berbentuk gliserida untuk bahan pembuatan minyak goreng, margarin dan bahan lemak lainnya sedangkan untuk industri non makanan minyak kedelai digunakan sebagai bahan baku tinta, kosmetik, insektisida, danfarmasi (Prihatman 2000). Kedelai merupakan tanaman asli daratan Cina dan telahdibudidayakan oleh manusia sejak 2500 SM. Sejalan dengan makinberkembangnya perdagangan antarnegara yang terjadi pada awal abadke-19, menyebabkan tanaman kedelai juga ikut tersebar ke berbagainegara tujuan perdagangan tersebut, yaitu Jepang, Korea, Indonesia,India, Australia, dan Amerika Serikat. Kedelai mulai dikenal di Indonesia sejakabad ke-16.Awal mula penyebaran dan pembudidayaan kedelai yaitu diPulau Jawa, kemudian berkembang ke Bali, Nusa Tenggara, dan pulaupulau lainnya (Irwan 2006). Di Indonesia kedelai ditanam pada lahan sawah (setelah panen padi)dan pada lahan kering (terutama pada lahan kering yang tidak masam).Di Sulawesi, Kalimantan, dan Sumatera ada juga kedelai ditanam pada lahan pasang surut/lebak yaitu pada musim kemarau. Penyebaran kedelai diIndonesia terluas masih di pulau Jawa sampai saat ini. Kedelai ditanam sebagian besar dilahan sawah di Jawa.Lahan yang sesuai untuk tanaman kedelai adalah tidak lahan dengan pH >5.0, tekstur lempung dan kandungan bahan organik tinggisampai sedang. Kandungan hara tanah (N, P, K, Ca, Mg) yangcocok atau sesuai adalah tinggi sampai sedang.Curah hujan 1 000 –2 500 mm/tahun dan temperatur 20 – 35°C (Kementerian Pertanian 2013). 5 Pencapaian peningkatan produksi kedelai dilakukan melalui strategi sebagai berikut: (1) peningkatan kualitas dan kuantitas sistem perbenihan kedelai, perbaikan teknikbudidaya kedelai di tingkat petani, memperlancar modal dan teknologi, sosialisasi, pemantauan, pendampingan dan koordinasi, (2) perluasan areal dan pengelolaan lahan yang dilaksanakan dengan menarik minat petani dan investor dalam pengembangan kedelai, optimalisasi lahan, danteknologi, perluasan wilayah baru, untuk mengembangkan pusat pertumbuhan, pengembangan kerjasama investor dengan petanidan kooperasi, pengembangan produksi kedelai skala besar untuk bahan baku industri, dan pengembangan budidaya tumpang sari dengan ubi kayu, dan (3) pengamanan produksi yang dilakukan melalui pengendalian OPT (Organisme Pengganggu Tanaman) danantisipasi dampak fenomena iklim serta pengurangan kehilanganhasil dengan menerapkan gerakan manajemen pasca panen,teknologi panen melalui mobilisasi peralatan (Kementrian Pertanian 2013). Mutu Benih dan Cendawan Patogen Terbawa Benih Kedelai Pengelolaan pasca panen menjadi salah satu faktor penting dalam produksi kedelai dan dapat menentukan kualitas dan kuantitas produksi selanjutnya. Penyakit tanaman tidak terlepas kaitannya dengan benih. Benih atau biji kedelai berkeping dua yang dibungkus oleh kulit biji. Embrio terletak di antara keping biji. Warna kulit biji bermacam-macam yaitu kuning, hitam, hijau dan coklat.Bentuk biji kedelai umumnya bulat lonjong, bundar atau bulat pipih. Ukuran biji bervariasi, tergantung varietas. Di Indonesia ukuran biji bervariasi dari 6 – 30 g (Suprapto 2001). Menurut SNI 01-3922-1995, syarat mutu kedelai secaraumum adalah (1) bebas hama penyakit, (2) bebas bau busuk, bau asam, bau apek, dan bau asing lainnya, (3) bebas dari bahan kimia seperti insektisida dan fungisida, dan (4) memiliki suhu normal (Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian 2010). Benih kedelai yang digunakan pada dasarnya harus benih yang baik dan bermutu tinggi. Benih kedelai yang baik dan bermutu tinggi akan menjamin pertanaman yangbagus dan hasil panen yang tinggi, dan ini dicerminkan oleh tingginya tingkatkeseragaman biji,daya tumbuh dan tingkat kemurnian. Benih yang bermutu adalah benih yang memenuhi persyaratan sebagai berikut: (1) murni dan diketahui nama varietasnya, (2) daya tumbuhnya tinggi (minimal 80%), serta vigornya baik, (3) biji sehat, bernas, mengkilat, tidak keriput dan dipanen dari tanaman yang telah matang dan sehat, tidak terkena penyakit virus, tidak terinfeksi cendawan, bakteri atau virus, dan (4) bersih, tidak tercampur biji tanaman lain atau biji rerumputan (Sunantora 2000). Patogen terbawa benih penyebab penyakit merupakan suatu aspek yang umum dalam penyakit tumbuhan yang menghubungkan antara patogen tumbuhan dengan bagian perbanyakan tumbuhan baik benih maupun umbi. Oleh karena itu, penyakit benih adalah hasil interaksi antara inang yang rentan, patogen, lingkungan, dan agen penular (Agarwal & Sinclair 1997). Dengan demikian, benih yang digunakan untuk pertanian harus mempunyai mutu yang baik.Mutu benih merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan dalam pertanaman untuk mendapatkan hasil yang optimal.Benih bermutu ditandai dengan daya berkecambah yang tinggi, tumbuh cepat, serempak, dan seragam, serta 6 mempunyai akar primer yang panjang dan akar sekunder paling sedikit tiga. Pengujian mutu fisiologis benih dilakukan dengan mengukur vigor benih. Indikator untuk menentukan vigor benih antara lain melalui indikasi biokimia dan fisiologisnya. Ukuran benih memberikan pengaruh terhadap pertumbuhan tanaman di lapangan.Benih yang berukuran besar umumnya memberikan penampilan tanaman yang lebihvigor dibanding tanaman yang berasal dari benih berukuran kecil (Rahmawati 2009). Mutu benih mencakup mutu genetis, mutu fisiologis, mutu fisik dan patologis. Aspek patologis benih bermutu yaitu terbebas dari serangan penyakit (Ilyas 2012). Menurut Copeland dan Donald (1985), faktor lain yang mempengaruhi beberapa benih yang terserang atau bergejala penyakit yaitu kadar air benih dan suhu lingkungan. Kadar air benih yang mengalami peningkatan dapat terjadi apabila suhu dan kelembaban tempat penyimpanan tinggi. Kondisi tempat penyimpanan benih yang umumnya tertutup rapat dan kurang baiknya sirkulasi udara mengakibatkan kelembaban menjadi semakin meningkat. Akibatnya dapat memicu munculnya aktivitas mikroorganisme terutama cendawan terbawa benih. Cendawan patogen terbawa benih akan mempengaruhi timbulnya penyakit ketika benih ditanam lalu berkecambah hingga tumbuh sampai tanaman dewasa. Cendawan patogen terbawa benih yang utama pada benih kedelai adalah dari genus Fusarium (Wu et al. 1964), Peronospora manshurica (Naumov) Syd. (Medic-pap et al. 2007) serta Phomopsis dan C. truncatum (Wain-Tassi et al. 2011). Menurut Wu et al. (1964), cendawan yang berhasil diisolasi dari benih kedelai adalah dari genus Alternaria, Cephalothecium, Cercospora, Cladosporium, Corynespora, Fusarium, Nigrospora, Penicillium, Pestalozia, dan Stemphylum. Berdasarkan 10 genus tersebut, cendawan yang bersifat patogen adalah Alternaria, Cercospora, dan Fusarium. Infeksi cendawan tersebut dapat menurunkan kapasitas vigor benih dan perkecambahan benih di lapangan (Medic-pap et al. 2007; Alves & Pozza 2012). Cendawan dari genus Fusarium yang diketahui sebagai cendawan patogen yang dapat terbawa oleh benih adalah F. oxysporum (Schlecht) dan F. solani (Mart) (Agarwal & Sinclair 1997). Cendawan terebut memiliki kisaran tanaman inang yang luas yaitu tanaman pangan dan hortikultura di Indonesia. Salah satu wilayah, seperti provinsi Sumatera Utara, tercatat bahwa cendawan patogen terbawa benih kedelai adalah C. dematium (Pers) Grove, C. kikuchi (Matsumoto & Tomoy), Macrophomia sp., C. casiicola, P. sojae (Lehm & Wolf), Botryodiplodiasp., Peronosporasp., Rhizoctonia solani (Kuhn), Phoma sp., F. oxysporum, F. moniliforme (Sheld), F. equisetii, F. semitectum(Berk. & Ravenel) Matsush, Fusarium spp. (UPT BPSB SUMUT 2013). Hal ini menjadi salah satu faktor penyebab rendahnya produktivitas benih kedelai di Sumatera Utara. Penyakit pada tanaman kedelai yang disebabkan cendawan patogen terbawa benih kedelai antara lain rebah kecambah, layu Fusarium, hawar dan karat daun. Penyakit yang umumnya menyerang adalah layu Fusarium yang disebabkan oleh Fusarium spp. Cendawan dari genus Fusarium merupakan cendawan patogen yang sering menyerang kedelai mulai masa persemaian. Penyakit yang disebabkan oleh Fusarium spp. menunjukkan gejala layu pada tanaman. Hal ini sesuai dengan laporan Sudantha (2010) bahwa F. oxysporum f. sp. glycine menyebabkan penyakit rebah kecambah dan layu. Begitu juga dengan 7 laporan Li et al. (2008), F. solani juga dapat menyebabkan rebah kecambah pada kedelai.F. solani mulai menginfeksi dari akar tanaman kedelai. F. oxysporum adalah salah satu patogen utama karena strain patogen dari cendawan ini dapat dorman selama 30 tahun sebelum melanjutkan virulensi dan menginfeksi tanaman. Menurut Jasnicet al.(2005), kerugian akibatinfeksi F. oxysporummenyebabkan pengurangan hasil produksi mencapai 59%.Pada saat tanaman menunjukkan tanda-tanda gejala penyakit dari infeksi patogen, maka untuk pengendaliannya sudah terlambat, dan tanaman akan mati. Selain itu, F. oxysporum bersifat broad spectrum karena dapat menyebabkan penyakit di hampir setiap tanaman pertanian penting. F. oxysporum terbukti sangat sulit dikendalikan karena konidia F. oxysporum juga dapat bertahan di tanah untuk jangka waktu yang lama, sehingga rotasi tanaman bukan merupakan metode kontrol yang tepat (Djaenuddin 2011). Menurut Li et al. (2008), F. solani f.sp. glycines menyebabkan gejala mati tiba-tiba (sudden death syndrome/SDS) pada tanaman kedelai. Infeksi dimulai dari akar tanaman dan jarang menyerang dari daun. Namun, kedelai yang terinfeksi oleh F. solani menunjukkan gejala pada daun yaitu daun menjadi klorosis, nekrotik, dan defoliasi, lama-kelamaan tanaman akan layu secara keseluruhan. F. solani f.sp.glycines dapat menimbulkan kehilangan hasil mencapai 100% . Kegiatan yang perlu dilakukan untuk mengurangi kejadian penyakit pada kedelai adalah pengamanan produksi dari gangguan Organisme Pengganggu Tumbuhan (OPT), pengurangan kehilangan hasil melalui pengelolaan pascapanen, perbenihan dan kegiatan lainnya seperti pembinaan, supervisi, monitoring, evaluasi dan pelaporan. Kegiatan pendukung tersebut agar dapat dilakukan secara terencana dan terkoordinasi (Kementrian Pertanian 2013). Bakteri Endofit Tanaman Bakteri endofit tumbuhan adalah bakteri yang berada dalam jaringan tumbuhan dan tidak patogenik sehingga tidak menimbulkan gejala penyakit pada tanaman inang serta dapat diisolasi dengan teknik sterilisasi permukaan.Hampir seluruh tumbuhan bersimbiosis dengan mikroorganisme yang bersifat endofit.Salah satu tumbuhan yang banyak mengandung mikroba endofit adalah dari kelompok kacang-kacangan.Sejumlah endofit bakteri dan cendawan dilaporkan ada di dalam jaringan tumbuhan seperti akar, nodul, daun, bunga, dan kecambah kacang-kacangan.Endofit pada tanaman kacang-kacangan dapat mempercepat perkecambahan, memicu pertahanan tanaman, dan mempengaruhi pertumbuhan tanaman (Dudeja et al. 2012). Bakteri endofit berada di dalam tanaman yang sehat sehingga tidak mudah dipengaruhi oleh lingkungan.Beberapa bakteri endofit menguntungkan bagi tanaman seperti pemicu pertumbuhan, fiksasi nitrogen, dan pencegahan penyakit yang disebabkan oleh patogen.Penelitian sebelumnya telah dilakukan dengan tujuan memperoleh isolat bakteri endofit yang mampu mengendalikan penyakit yang disebabkan oleh bakteri dan cendawan patogen.Bakteri endofit dapat menghambat pertumbuhan cendawan patogen F. oxysporum f. soybean (Shu-Mei et al. 2008). Bakteri endofit juga pernah dilaporkan dapat menghambat bakteri 8 patogen Xanthomonas axonopodis f.sp glicine penyebab pustul bakteri dan meningkatkan pertumbuhan serta hasil kedelai (Habazar et al. 2012). Keberadaan bakteri endofit pada tanaman kedelai telah diketahui dari hasil penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya. Menurut Dalal dan Kulkarni (2013), beberapa bakteri endofit dapat diisolasi dari tanaman kedelai antara lain genus Bacillus, Pseudomonas, Xanthomonas, Enterobacter, Rhizobium, Klebsiella, Acetobacter, dan Burkholderia. Berdasarkan penelitian yang dilakukan Hung dan Annapurna (2004), bakteri endofit dari genus Staphylococcus, Leuconostoc, Tsukamurella, Deinococcus dan Clavibacter juga ditemukan di dalam jaringan tanaman kedelai. Populasi bakteri endofit di dalam jaringan tanaman tergantung pada beberapa faktor seperti umur (tahap) perkembangan tanaman, lokasi geografi tanaman, dan lokasi bakteri di dalam jaringan tanaman.Tahap perkembangan tanaman kedelai mempengaruhi jumlah bakteri.Semakin tua suatu tanaman, semakin berkurang jumlah bakteri endofit.Fase vegetatif lebih sedikit mengandung bakteri dibandingkan dengan fase generatif tanaman kedelai.Bakteri endofit pada kedelai lebih banyak berada di akar daripada di batang dan daun (Dalal & Kulkarni 2013). Lokasi jaringan yang banyak dihuni oleh bakteri endofit pada tanaman kedelai adalah daerah nodul (bintil akar). Nodul lebih banyak mengandung bakteri endofit daripada batang dan akar tanaman (Hung & Annapurna 2004). Berbagai mikroba mensekresi metabolit yang dapat mempengaruhi aktivitas dan pertumbuhan patogen tanaman (Pal & Gardener 2006).Mikroba endofit menghasilkan metabolit sekunder yang penting bagi tanaman dan mengaktifkan sistem respon cekamanlebih cepat dan lebih kuat pada tanaman sehingga tanaman lebih resisten dalam melawan patogen.Endofit juga mampu membantu menghilangkan kontaminan, melarutkan fosfat atau membantu asimilasi nitrogen untuk tanaman.Sebagai tambahan, bakteri endofit menyalurkan vitamin esensial bagi tanaman.Produksi senyawa seperti auksin meningkatkan produksi benih dan perkecambahan sepanjang peningkatan titik tumbuh. Dampak lain dari keberadaan endofit di dalam jaringan tanaman adalah penambahan osmotik, regulasi stomata, modifikasi morfologi akar, meningkatkan pengambilan mineral dan mengubah nitrogen (Dudeja et al. 2012). Pengendalian Patogen Terbawa Benih Penyebab Penyakit Tanaman Pengendalian penyakit tanaman sejak dari benih akan mengurangi kejadian penyakit di lapangan. Pengendalian patogen terbawa benih secara hayati dengan memanfaatkan bakteri endofit merupakan salah satu upaya dalam mengendalikan penyakit yang disebabkan oleh patogen terbawa benih.Hal ini disebabkan karena salah satu kemampuan endofit dapat memberikan ketahanan bagi tanaman. Bakteri endofit yang berasal dari kacang-kacangan yang lain belum banyak dipelajari. Penelitian pada tanaman kacang kapri dan kedelai membuktikan bahwa bakteri endofit dapat menginduksi ketahanan tanaman terhadap cendawan patogen atau meningkatkan pertumbuhan kedelai (Dudeja et al. 2012). Pengendalian cendawan patogen terbawa benih kedelai dengan memanfaatkan bakteri endofit dilakukan untuk mengurangi penggunaan bahan 9 kimia sintetik (fungisida) dalam pengelolaan pascapanen. Salah satu cara penggunaan bakteri endofit adalah dengan memanfaatkan metabolit yang dihasilkan oleh bakteri. Menurut Ramarathnam et al. (2007), bakteri endofit yaitu Bacillus spp. yang diisolasi dari tanaman kedelai menghasilkan senyawa fengisin dan basilomisin. Kedua senyawa tersebut dapat menghambat pertumbuhan F. graminearum. Perlakuan benih dengan menggunakan metabolit sekunder tersebut memliki kemampuan untuk melindungi benih dari serangan patogen terbawa benih maupun kontaminan selama penyimpanan. Bakteri endofit yang sering diisolasi adalah dari genus Bacillus. Senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan oleh Bacillus spp. anatara lain basilomisin, subtilin, iturin, surfaktin, dan lisenisin. Senyawa-senyawa tersebut bersifat antimikrobia dan anticendawan (Athukorala et al. 2009). Dengan demikian, pemanfaatan senyawa metabolit sekunder dari bakteri endofit dapat dijadikan sebagai agens pengendali hayati dalam menekan pertumbuhan cendawan patogen terbawa benih. 10 3 METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan September 2014 sampai dengan Agustus 2015 di Laboratorium Balai Proteksi Tanaman Pangan dan Hortikultura Medan Sumatera Utara dan Laboratorium Mikologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Jawa Barat. Bahan Bahan penelitian yang digunakanantara lain terdiri atas kertas saring cakram ukuran 0,6 cm (Oxoid), media potato dextrose agar (PDA), tripton soya agar/broth (TSA/TSB), mueller hinton broth/MHB (beef extract 2 g; acid hydrolysate of casein 17.5 g; starch 1.5 g; aquades 1 L), luria bertani /LB (tryptone 12.5 g; NaCl 6.25 g; yeast extract 6.25 g; aquades 1 L), dan fungisida sintetik (bahan aktif Mankozeb 80%). Isolat bakteri endofit dan cendawan patogen diperoleh dari tanaman dan benih kedelai varietas Buluh (lokal) asal Kecamatan Medan Labuhan dan varietas Anjasmoro asal Kecamatan Tanjung Selamat, Sumatera Utara. Uji Perendaman Benih Kedelai Benih kedelai sebanyak 100 biji (≈11.22 g) direndam dalam 100 mL air selama 15, 30, dan 45 menit.Hal ini dilakukan untuk melihat sifat benih saat direndam dalam cairan sehingga dapat diketahui selang waktu yang efektif untuk perendaman kedelai di dalam cairan.Kedelai kemudian dikeringanginkan dan ditimbang dengan timbangan analitik.Pengukuran dilakukan dengan menghitung selisih berat awal dengan berat akhir. Hal ini dilakukan untuk mengetahui apakah cairan meresap pada selang waktu yang diuji. Selang waktu yang paling baik dalam menjaga sifat benih dan mampu menyerap cairan akan digunakan sebagai dasar pada saat perlakuan perendaman benih dalam metabolit dan fungisida. Isolasi Bakteri Endofit dari Kedelai Isolasi bakteri endofit dilakukan dari benih dan tanaman kedelai yang paling sehat. Bagian tanaman kedelai yang diisolasi adalah akar, batang, daun.Masing-masing bagian tersebut disterilisasi permukaan dengan alkohol 70%, lalu NaOCl 3%. Benih disterilisasi permukaan dengan NaOCl 1%.Bagian-bagian tersebut dicuci dengan air steril sebanyak tiga kali. Masing-masing bagian tanaman dan benih diletakkan pada media TSA 20 % sebelum dimaserasi dengan pistil dan mortar, lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Hal ini dilakukan sebagai indikator keberhasilan sterilisasi permukaan. Sterilisasi permukaan berhasil apabila media tidak ditumbuhi oleh bakteri kontaminan. Setelah dilakukan indikator sterilisasi, bagian tanaman yang telah steril dimaserasi menggunakan pistil dan mortar.Hasil maserasi dibuat pengenceran berseri sampai 10-3 di dalam tabung reaksi. Sebanyak 0.1 mL diambil dari masing-masing tingkat pengenceran dengan menggunakan mikropipet dan dituang pada media TSA lalu 11 diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Bakteri yang tumbuh diamati warna, bentuk, tepi, elevasi koloni.Lalu dibuat biakan murni untuk setiap bakteri yang diperoleh (Munif et al. 2012). Isolat yang diperoleh diuji dengan pengujian HR (Hypersensitive Response). Pengujian menggunakan tanaman tembakau untuk mengetahui bakteri tersebut patogen atau nonpatogen. Masing-masing isolat ditumbuhkan pada media TSB 5 mL. Media diinkubasi selama 24 jam dengan diletakkan pada shaker. Selanjutnya diambil sebanyak 2 mL dengan menggunakan alat injeksi, kemudian suspensi tersebut diinokulasikan pada daun tembakau.Tanaman tembakau diinkubasi selama 24 jam.Jika tidak terjadi nekrotik menandakan bahwa isolat bakteri bersifat nonpatogenik. Isolasi Cendawan Patogen Terbawa Benih Kedelai Isolasi cendawan patogen terbawa benih kedelai dilakukan dengan metode inkubasi berdasarkan standar ISTA (2014) yaitu metode blotter test.Metode blotter test menggunakan kertas hisap steril di dalam cawan petri.Benih kedelai disterilisasi permukaan dengan menggunakan NaOCl 1% selama 1 menit dan dicuci dengan air steril sebanyak 3 kali lalu dikeringanginkan. Sebanyak 10 benih ditanam pada cawan petri yang berisi kertas hisap steril dengan ulangan sebanyak 40 kali. Benih diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam dengan penyinaran NUV 12 jam terang dan 12 jam gelap. Inkubasi dilanjutkan dengan meletakkan benih pada ruang dengan suhu -20°C selama 24 jam. Benih diinkubasi kembali pada suhu ruang dengan penyinaran 12 jam terang dan 12 jam gelap sampai hari ke-8 dan ke-14. Gejala dan cendawan patogen yang muncul diamati dengan mikroskop.Cendawan patogen dideteksi dan identifikasi langsung.Parameter yang diamati adalah tingkat infeksi cendawan terbawa benih yang muncul. Cendawan yang paling dominan tumbuh pada benih dimurnikan pada media PDAdan diinkubasi selama 5-7 hari pada suhu ruang, kemudian dikarakterisasi dan diidentifikasi secara makroskopis dan mikroskopis. Identifikasi patogen menggunakan buku identifikasi cendawan Barnett dan Hunter (1999) dan Dugan (2006). Uji Daya Hambat Bakteri Endofit terhadap Cendawan Patogen secarain Vitro Isolat bakteri endofit yang bersifat nonpatogenik (tidak menimbulkan nekrosa) pada uji HR digunakan untuk uji daya hambat terhadap cendawan patogen benih kedelai. Uji daya hambat dilakukan dengan mengadopsi metode Suryanto et al. (2011) yang telah dimodifikasi yaitu menggunakan metode kultur ganda pada media PDA. Cendawan patogen ditumbuhkan di tengah media. Kemudian dibuat suspensi bakteri endofit (108 sel/mL). Kertas cakram direndam di dalam suspensi selama 30 menit. Kemudian kertas cakram diletakkan pada kedua tepi media dan diinkubasi 6-7 hari pada suhu ruang. Diamati dan diukur daya hambat bakteri endofit terhadap cendawan patogen (Gambar 2). 12 Gambar 2 Metode pengukuran daya hambat bakteri terhadap koloni cendawan; A. koloni cendawan; B. zona hambat bakteri endofit; C. titik tengah cendawan diletakkan; D. koloni bakteri endofit; X. diameter koloni cendawan yang terhambat pertumbuhannya; Y. diameter koloni cendawan normal (Suryanto et al. 2011) Rumus perhitungan penghambatan pertumbuhan cendawan patogen yaitu: Daya hambat : Keterangan : Y = diameter koloni cendawan patogen normal (cm) X = diameter koloni cendawan patogen yang terhambat pertumbuhannya (cm) Sebanyak tiga isolat bakteri yang menunjukkan daya penghambatan tertinggi (di atas 50%) digunakan untuk percobaan lebih lanjut.Tiga bakteri yang berpotensi tersebut diidentifikasi secara morfologi, fisiologi dan biokimia dengan menggunakan jasa identifikasi di Laboratorium Bioteknologi Lingkungan Indonesian Center for Biodiversity and Biotechnology (ICBB) Bogor. Pengukuran Kurva Pertumbuhan Bakteri Endofit Pengukuran kurva pertumbuhan bakteri endofit dilakukan berdasarkan metode Sunatmo (2009) yang telah dimodifikasi. Isolat yang berumur 24-48 jam pada media TSA 20% diinokulasi ke dalam 20 mL LB dan diinkubasi pada shaker dengan kecepatan 150 rpm selama 24 jam. Dilakukan pengamatan dan pengukuran OD600 kultur tersebut tiap 1.5 jam dengan menggunakan spektrofotometer. Hasil pengukuran dibuat dalam bentuk kurva pertumbuhan. Umumnya bakteri menghasilkan metabolit dalam fase statis. Ekstraksidan Uji Daya Hambat SenyawaMetabolit Bakteri Endofit terhadap Cendawan Patogen secara in Vitro Produksi senyawametabolit dilakukan mengikuti Elita et al. (2013) yang telah dimodifikasi yaitu isolat ditumbuhkan pada 100 mL media MHBdalam Erlenmeyer dan digoyang dengan shaker pada kecepatan 150 rpm suhu ruang dengan selang waktu berdasarkan kurva pertumbuhan sampai menghasilkan metabolit sekunder. Kultur bakteri disentrifugasi pada kecepatan 3800 rpm selama 13 20 menit untuk memisahkan supernatan dari massa selnya. Supernatan disaring dengan millipore syringe filter 0.2µm yang kemudian digunakan sebagai ekstrak kasar untuk pengujian selanjutanya. Pembuatan konsentrasi senyawametabolit di dalam media PDA mengikuti metode Faturrahman (2001) yang telah dimodifikasi.Sebanyak 20 mL senyawametabolit dicampur dengan 80 mL media PDA (untuk pengenceran 20%), selanjutnya dilakukan pengenceran 10% dan 5%, kemudian campuran media dan senyawa metabolit dituang pada cawan petri. Cendawan patogen diletakkan di tengah media dengan lima ulangan. Cendawan patogen yang ditumbuhkan pada media PDA ditambah dengan fungisida sintetik dengan konsentrasi yang dianjurkan sebagai kontrol positif dan cendawan patogen yang ditumbuhkan pada media PDA saja dijadikan sebagai kontrol negatif. Cendawan patogen yang ditumbuhkan pada media tumbuh dari masing-masing perlakuan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 hari. Parameter yang diamati adalah pertumbuhan koloni cendawan patogen pada masing-masing perlakuan dan dibandingkan dengan pertumbuhan koloni cendawan patogen pada kontrol. Selanjutnya dihitung daya hambat masing-masing perlakuan dengan rumus: Keterangan : D1 = diameter koloni cendawan patogen kontrol negatif (cm) D2 = diameter koloni cendawan patogen perlakuan (cm) Uji Perlakuan Benih dengan SenyawaMetabolit Bakteri Endofit Perlakuan perendaman benih dilakukan mengikuti metode Dewi et al. (2013) yang telah dimodifikasi. Benih kedelai direndam di dalam senyawa metabolit bakteri endofit dengan konsentrasi yang paling baik dalam menekan pertumbuhan cendawan diatas 50%.Selanjutnya, benih dikeringanginkan di dalam Laminar Air Flow dan dilakukan pengujian benih dengan metode blotter test dan growing on test pada media agar air dan tanah steril. Pertama, pada pengujian blotter test sebanyak 10 butir benih kedelai ditanam pada kertas saring lembab di dalam cawan petri, masing-masing perlakuan diulang 10 kali, kemudian benih tersebut diinkubasi seperti pada percobaan isolasi cendawan patogen terbawa benih kedelai. Kedua, pada pengujian growing on test pada media agar air, benih ditanam pada media agar air dengan 10 kali ulangan masing-masing 10 benih dan inkubasi selama 8 hari. Ketiga, benih ditanam pada campuran tanah dan kompos steril di dalam pot plastik dengan 10 kali ulangan masing-masing 5 benih dan diinkubasi selama 14 hari dengan penyiraman teratur. Benih yang direndam di dalam air steril dijadikan sebagai kontrol negatif. Benih yang direndam dalam fungisida sintetik dijadikan sebagai kontrol positif. Parameter yang diamati adalah gejala nekrotik (tingkat infeksi), daya berkecambah, dan tinggi tanaman. 14 Keterangan: I1 = jumlah tanaman terinfeksi I2 = jumlah tanaman yang tumbuh Keterangan: k1 = jumlah benih berkecambah k2 = jumlah benih yang ditanam Analisis KomponenSenyawaMetabolit dengan Py-GCMS Isolat ditumbuhkan pada 100 mL media MHB (Mueller Hinton Broth) dalam Erlenmeyer dan digoyang dengan shaker pada kecepatan 150 rpm suhu ruang dengan selang waktu berdasarkan kurva pertumbuhan sampai menghasilkan metabolit sekunder. Kultur bakteri disentrifugasi pada kecepatan 3800 rpm selama 20 menit. Supernatan disaring dengan millipore syringe filter 0.2 µm yang kemudian digunakan untuk selanjutnya dianalisis dengan Pyrolisis Gas Chromatrography Mass Spectrometry (Py-GCMS), di Laboratorium Litbang Kehutanan, Gunung Batu, Bogor. Analisis Data Pengujian penghambatan pertumbuhan cendawan oleh metabolit sekunder disusun dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL). Data yang diperoleh kemudian diolah menggunakan program SAS 9.1. Perlakuan yang menunjukkan beda nyata diuji lanjut dengan uji Duncan pada taraf 5%. 15 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Perendaman Benih Kedelai Tabel 1 menunjukkan bahwa perendaman benih kedelai paling baik pada selang waktu 30 menit.Hal ini disebabkan oleh sifat fisik benih masih terlihat baik dan bobot benih bertambah sebesar 2.44 g. Benih yang memiliki sifat fisik baik dapat mempengaruhi viabilitias dan pertumbuhan. Tabel 1 Waktu perendaman benih kedelai Waktu (menit) 15 30 45 Bobot benih (g) Awal Akhir 11.22 12.82 11.22 13.66 11.22 15.53 Selisih bobot benih (g) 1.60 2.44 4.31 Sifat fisik benih Baik baik kulit benih rusak Kedelai memiliki benih dengan kulit benih yang tipis sehingga sangat rentan terhadap kerusakan secara fisik yang akhirnya akan mempengaruhi daya perkecambahan. Oleh karena itu perlakuan yang diberikan pada benih sebelum ditanam di lahan dapat mempengaruhi daya berkecambah benih.Salah satu perlakuan yang dilakukan untuk memaksimalkan perkecambahan dan pertumbuhan benih adalah dengan merendam benih di dalam suspensi. Pemilihan lama waktu perendaman menjadi hal yang penting. Perendaman sebaiknya tidak terlalu lama karena perendaman yang terlalu lama akan merusak kulit benih kedelai. Menurut Sofia (2007), lama perendaman benih kedelai yang optimum adalah 30 menit. Perendaman benih selama 30 menit dalam senyawa kimia kolkhisin menunjukkan bahwa pertumbuhan tanaman lebih baik bila dibandingkan dengan perendaman 45 menit. Menurut Angggraeni dan Suwarno (2014), perendaman benih akan mempengaruhi viabilitas benih. Benih kedelai dengan tingkat viabilitas 80% dapat diperoleh dengan merendam benih di dalam larutan etanolselama 22 menit 31.8 detik. Isolat Bakteri Endofit dari Kedelai Hasil isolasi bakteri endofit dari tanaman kedelai diperoleh 102 isolat (Gambar 3). Jumlah isolat bakteri endofit lebih banyak diperoleh dari tanaman kedelai varietas Anjasmoro daripada varietas Buluh. Jumlah isolat yang berasal dari varietas Anjasmoro adalah sebanyak 73 isolat yang terdiri dari 18 isolat dari bagian akar, 28 isolat dari bagian batang, 17 isolat dari bagian daun dan 10 isolat dari bagian benih. Jumlah isolat yang berasal dari varietas Buluh adalah sebanyak 29 isolat yang terdiri atas 9 isolat dari bagian akar, 8 isolat dari bagian batang, 6 isolat dari bagian daun dan 6 isolat dari bagian benih (Tabel 2). Jumlah dan keragaman bakteri endofit yang diperoleh dari tanaman tergantung dari jenis tanaman, usia tanaman, faktor lingkungan dan musim. Faktor jenis tanaman berdasarkan varietas dan genetik dari tanaman tersebut. Faktor lingkungan yang mempengaruhi adalah suhu, tanah, dan kelembaban. Faktor musim juga dapat mempengaruhi keberadaaan bakteri endofit seperti musim 16 kemarau atau musim hujan. Faktor-faktor tersebut dapat mempengaruhi keberadaan bakteri endofit di dalam tanaman. Bakteri endofit yang berasal dari tanaman kedelai varietas Anjasmoro lebih banyak daripada bakteri endofit yang berasal dari varietas Buluh. Sampel tanaman kedelai varietas Anjasmoro diambil saat musim hujan sedangkan sampel tanaman kedelai varietas Buluh diambil saat musim kemarau. Hal ini dapat menyebabkan adanya perbedaan jumlah dan keragaman bakteri endofit yang diperoleh. Tabel 2 Waktu perendaman benih kedelai Varietas Buluh Anjasmoro Bagian Akar Batang Daun 9 8 6 18 28 17 Total Isolat Benih 6 10 Total 29 73 102 Uji Hipersensitif Patogenik Nonpatogenik 22 7 32 41 54 48 Gambar 3 Isolat bakteri edofit asal tanaman kedelai Jumlah dan keragaman bakteri endofit juga bergantung pada perkembangan tanaman kedelai.Pada penelitian ini, isolat bakteri endofit lebih banyak ditemukan pada tanaman kedelai varietas Anjasmoro berumur dua bulan yaitu pada saat fase reproduktif.Hal ini didukung oleh penelitian yang dilakukan oleh Dalal dan Kulkarini (2013), jumlah isolat bakteri endofit lebih tinggi terdapat dapat tahap reproduktif. Hasil uji hipersensitif pada tanaman tembakau menunjukkan bahwa dari 102 isolat diperoleh 54 isolat bersifat patogenik dan 48 isolat bersifat nonpatogenik. Bakteri endofit diketahui sebagai bakteri yang bersimbiosis mutualisme pada tanaman inangnya.Namun, dapat berpotensi patogenik pada tanaman tersebut suatu saat. Hasil uji hipersensitif pada tanaman tembakau menunjukkan bahwa sebagian isolat yang diperoleh bersifat patogenik.Hal ini dikarenakan adanya gejala nekrotik pada daun tembakau yang diinokulasi suspensi bakteri endofit. Isolat Cendawan Patogen Terbawa Benih Kedelai Hasil isolasi cendawan patogen terbawa benih kedelai dengan metode blotter test menunjukkan bahwa terdapat 8 jenis cendawan.Cendawan yang diperoleh adalah Fusarium oxysporum, Aspergillus spp., Penicillium sp., Curvularia sp., cendawan dengan hifa coklat keabuan (CP1) dan cendawan berhifa coklat (CP2) disajikan dalam Gambar 4.Cendawan yang paling dominan 17 menginfeksi benih kedelai pada kedua varietas adalah Fusarium oxysporum.Tingkat infeksi F. oxysporum pada varietas Buluh yaitu sebesar 15.25% dan pada varietas Anjasmoro yaitu sebesar 13.25% (Tabel 3). Oleh karena itu, F.oxysporum dijadikan sebagai cendawan model untuk pengujian selanjutnya. Tabel 3 Jenis cendawan patogen yang diperoleh dari blotter test No. 1 2 3 4 5 6 7 8 Tingkat infeksi (%) Varietas Buluh Varietas Anjasmoro 15.25 13.25 4.25 3.5 3.5 0 0.25 4.25 0.5 2 1.25 0 0.75 1 0 0.5 Cendawan Patogen Benih F. oxysporum Penicillium sp. Curvularia sp. Aspergillus sp. 1 A.flavus A.niger CP 1 CP 2 Gambar 4 a b c d e f g h Jenis cendawan patogen terbawa benih kedelai: (a) konidia F. oxysporum, (b) Penicillium sp., (c) konidia Curvularia sp., (d) Aspergillus sp. 1, (e) A.flavus, (f) A. niger, (g) CP 1, (h) CP 2 (Perbesaran 40x10) Cendawan-cendawan yang diperoleh dari benih kedelai berasal dari filum Ascomycota.F. oxysporum merupakan cendawan yang paling tinggi tingkat infeksi pada benih kedelai. Klasifikasi berdasarkan Webster dan Weber (2007) menyatakan oxysporum adalah berasal dari filum Ascomycota, kelas Pyrenomycetes, ordo Hypocreales, famili Nectriaceae, dan spesies Fusarium oxysporum(tahap anamorf). Ciri-ciri koloni F.oxysporum secara makroskopis yaitu hifa berwarna putih dan setelah hari ketujuh berubah menjadi ungu dan kemerahan pada media PDA.Ciri-ciri secara mikroskopis yaitu mikrokonidia berbentuk lonjong bersekat dan tidak bersekat, makrokonidia berbentuk bulan sabit bersekat (umumnya bersekat 3), hifa bersekat (Gambar 5). 18 a a cc Gambar 5 b b dd Fusarium oxysporum: (a) pada media PDA umur 7 hari, (b) makrokonidia, (c) mikrokonidia, (d) hifa (Perbesaran 40x10) Warna koloni Fusarium sp. dapat berubah warna sesuai dengan kondisi nutrisi media seperti penelitian yang telah dilakukan oleh Nugraheni (2010), yang berhasil mengisolasi beberapa Fusarium sp. dari tanaman cabai. Hasil isolasi menunjukkan bahwa Fusarium sp. memiliki jenis pigmen hifa yang berbedabedadiantaranya koloni berwarna krem, ungu, merah jambu, putih seperti kapas dan putih krem. Cendawan yang menyerang benih kedelai selain F. oxysporum adalah Penicillium sp. Menurut Webster dan Weber (2007), klasifikasi cendawan Penicillium sp. dan Aspergillus spp. adalah berasal dari filum Ascomycota, kelas Plectomycetes, ordo Eurotiales, famili Eurotiaceae. Klasifikasi cendawan Curvularia sp. adalah berasal dari filum Ascomycota, kelas Loculoascomycetes, ordo Pleosporales, genus Cochliobolus, spesies Curvularia sp. (tahap anamorf). Menurut Narayanasamy (2011), cendawan terbawa benih seperti Aspergillus sp., Penicillium sp., dan Fusarium sp. menghasilkan mikotoksin pada beberapa benih pangan seperti padi dan jagung. Mikotoksin dapat menyebabkan benih rusak dan dapat berdampak pada kesehatan manusia apabila benih dijadikan sebagai biji-bijian yang diolah untuk bahan dasar makanan.Mikotoksin yang dihasilkan dapat menyebabkan pemicu penyakit kanker pada manusia. Cendawan-cendawan patogen selain dapat menyebabkan kerusakan pada benih juga dapat menyebabkan penyakit pada tanamannya.Fusarium sp. merupakan salah satu cendawan patogen penting yang menyebabkan penyakit pada kedelai.Menurut Li dan Hartman (2003), Fusarium solani f.sp glycine yang dideteksi secara molekular pada bagian akar kedelai dan tanah sekitar kedelai menyebabkan penyakit Sudden Death Syndrome (SDS) pada tanaman tersebut.Penyakit ini menyebabkan kehilangan hasil yang cukup signifikan. Menurut Jasnic et al. (2005), Fusarium sp. dapat menyebabkan gejala layu dan nekrosis pada akar dan batang terendah dari tanaman kedelai, klorosis pada daun, layu pada bagian apical tanaman, polong tidak berkembang dan benih lebih kecil dan pucat. Kelompok Fusarium yang menyebabkan penyakit tersebut adalah F. avenaceum (Fr.) Sacc., F. equiseti (Corda.) Sacc., F. oxysporum, F. poae (Peck.) 19 Wollenw.Uji patogenesitas menunjukkan bahwa F. oxysporum merupakan cendawan yang paling patogenik pada kedelai. Daya Hambat Bakteri Endofit terhadap Fusarium oxysporum secara in Vitro Hasil uji antagonis bakteri endofit terhadap F. oxysporum pada hari ke-7 menunjukkan bahwa terdapat 9 isolat yang memiliki daya hambat di atas 50%. EDA 3 memiliki daya hambat tertinggi yaitu sebesar 60.14%, diikuti dengan EBA 6 dan EBA 7 yaitu sebesar 57.69% dan 57.08% secara berturut-turut (Gambar 6). EDA 3 merupakan isolat bakteri endofit yang diperoleh dari daun tanaman kedelai sedangkan EBA 6 dan EBA 7 merupakan isolat yang diperoleh dari batang tanaman kedelai. Ketiga isolat tersebut memiliki kemampuan antibiosis yang tinggi sehingga mampu menghambat pertumbuhan F. oxysporum (Tabel 4). b a Gambar 6 c d Penghambatan koloni F. oxysporum oleh bakteri endofit : (a) tanpa bakteri (kontrol), (b) EBA 6, (c) EBA 7 dan (d) EDA 3 pada media PDA umur 7 hari Tabel 4 Daya hambat bakteri endofit terhadap koloni Fusarium oxysporum Daya hambat pertumbuhan (%) No. Kode isolat Hari ke- … setelah inokulasi Varietas 2 3 4 5 6 7 1 EAB1 Buluh 7.26 7.23 22.63 17.50 22.57 20.87 2 EAB5 Buluh 4.77 15.82 29.93 42.12 48.85 51.25 3 EAB9 Buluh 5.52 11.64 27.68 32.28 35.30 40.43 4 EAA1 Anjasmoro 9.93 8.99 14.61 29.58 35.00 38.62 5 EAA2 Anjasmoro 1.29 6.83 20.48 34.22 37.65 39.69 6 EAA3 Anjasmoro 6.59 6.07 22.76 34.14 32.91 30.62 7 EAA6 Anjasmoro 17.20 19.69 26.96 30.76 26.48 28.72 8 EAA8 Anjasmoro 0.59 21.64 34.52 42.91 47.61 52.62 9 EAA9 Anjasmoro 6.14 19.45 30.94 42.10 45.25 45.10 10 EAA11 Anjasmoro 1.37 3.87 23.80 19.38 4.81 2.11 11 EAA12 Anjasmoro 4.40 16.04 32.45 41.24 49.36 55.99 12 EAA14 Anjasmoro 2.92 9.37 24.97 29.62 28.98 34.97 20 Lanjutan Tabel 4 Daya hambat pertumbuhan (%) No. Kode isolat Hari ke- … setelah inokulasi Varietas 2 3 4 5 6 7 0.77 8.57 25.40 38.20 46.06 51.19 13 EAA17 Anjasmoro 14 EBB3 Buluh 11.76 24.63 36.47 46.95 51.69 54.07 15 EBB8 Buluh 4.46 13.92 28.69 37.03 42.30 47.42 16 EBA1 Anjasmoro 8.53 5.63 11.87 26.55 21.58 12.79 17 EBA2 Anjasmoro 6.62 4.51 20.16 31.50 26.64 17.91 18 EBA 6 Anjasmoro 7.23 24.63 37.45 48.21 53.16 57.69 19 EBA 7 Anjasmoro 23.64 27.63 36.85 46.92 52.63 57.08 20 EBA9 Anjasmoro 2.07 13.52 30.52 37.69 44.02 37.43 21 EBA10 Anjasmoro 4.12 6.92 24.89 23.22 21.23 17.59 22 EBA11 Anjasmoro 4.13 6.08 23.50 37.27 41.63 46.01 23 EBA12 Anjasmoro 8.37 19.28 23.61 29.82 33.06 36.10 24 EBA15 Anjasmoro 6.90 16.15 20.35 30.66 30.21 31.65 25 EBA16 Anjasmoro 9.33 16.36 23.21 16.77 19.28 19.55 26 EBA18 Anjasmoro 5.12 6.18 17.68 7.67 6.38 5.54 27 EBA19 Anjasmoro 2.20 7.10 10.78 16.41 17.25 18.98 28 EBA21 Anjasmoro 7.88 12.08 13.37 22.20 19.50 25.04 29 EBA22 Anjasmoro 7.05 10.27 13.70 22.48 20.59 25.05 30 EBA23 Anjasmoro 10.93 13.03 17.67 24.79 27.23 28.48 31 EBA26 Anjasmoro 12.67 16.82 23.45 30.61 29.49 32.79 32 EBA27 Anjasmoro 13.69 16.70 19.84 27.28 31.21 33.33 33 EBA28 Anjasmoro 12.47 16.44 21.23 27.81 33.13 34.79 34 EDB1 Buluh 13.36 21.91 30.80 44.08 53.56 54.46 35 EDA1 Anjasmoro 6.14 10.55 17.66 20.52 24.67 22.10 36 EDA 3 Anjasmoro 5.20 24.61 38.05 49.94 56.51 60.14 37 EDA8 Anjasmoro 2.37 11.22 24.83 34.50 35.20 37.06 38 EDA10 Anjasmoro 1.54 8.57 24.08 36.69 25.75 23.53 39 EDA11 Anjasmoro 0.80 0 19.19 25.74 29.38 30.30 40 EDA13 Anjasmoro 0 2.93 18.58 23.67 31.38 33.08 41 EDA14 Anjasmoro 1.60 4.64 22.09 18.92 14.48 13.67 42 EDA15 Anjasmoro 0 5.20 18.20 15.08 10.49 4.46 43 EDA16 Anjasmoro 0 6.67 18.00 18.04 19.63 18.75 44 BNB1 Buluh 4.29 27.31 39.17 38.81 36.52 31.97 45 BNA2 Anjasmoro 2.86 11.11 28.87 31.67 21.18 15.36 46 BNA3 Anjasmoro 1.38 7.99 9.98 11.38 12.23 7.47 47 BNA4 Anjasmoro 5.71 23.80 34.62 33.36 36.36 31.19 48 BNA7 Anjasmoro 1.55 8.25 25.63 18.66 13.15 9.57 Keterangan : EAB = Endofit Akar Buluh, EAA= Endofit Akar Anjasmoro, EBB = Endofit Batang Buluh, EBA = Endofit Batang Anjasmoro, EDB = Endofit Daun Buluh, EDA = Endofit Daun Anjasmoro, BNB = Endofit Benih Buluh, BNA = Endofit Benih Anjasmoro 21 Bakteri yang memiliki kemampuan antibiosis biasanya memiliki senyawa yang dapat mengganggu pertumbuhan morfologis maupun fisologis cendawan.Menurut Purwantisari et al. (2005), ada bebarapa cara penghambatan serangan cendawan patogen oleh bakteri. Pertama, bakteri menghasilkan senyawa bioaktif yang dapat mendegradasi komponen struktural cendawan. Senyawa tersebut mendegradasi dinding sel cendawan. Kedua, senyawa bioaktif juga mempengaruhi permeabilitas membran sel cendawan sehingga mengganggu transportasi zat-zat yang diperlukan untuk metabolisme. Hal ini mengakibatkan metabolisme cendawan terganggu. Ketiga, senyawa yang dihasilkan bakteri dapat berfungsi sebagai inhibitor terhadap suatu enzim yang dihasilkan oleh cendawan. Apabila enzim jamur tersebut berperan penting dalam metabolisme cendawan, maka aktivitas enzimatik sel akan terganggu. Akibatnya akan menekan pertumbuhan cendawan. Mekanisme keempat, yaitu senyawa yang dihasilkan oleh bakteri mampu menekan sintesis protein pada cendawan. Apabila sintesis protein terganggu menyebabkan cendawan kekurangan protein tertentu sehingga menyebabkan pertumbuhan cendawan terganggu. Kurva Pertumbuhan Bakteri Endofit Kerapatan populasi (sel/ml) Hasil pengukuran kurva pertumbuhan menunjukkan bahwa EBA 7 memiliki kecepatan pertumbuhan tertinggi karena mampu mencapai fase stasioner dengan selang waktu 10.5 jam inkubasi. Selanjutnya diikuti dengan isolat EDA 3 dengan kecepatan pertumbuhan mencapai fase stasioner dalam selang waktu 15 jam inkubasi dan EBA 6 dalam selang waktu 16.5 jam inkubasi (Gambar 7). 2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 EBA 6 EBA 7 EDA 3 1,5 3 4,5 6 7,5 9 10,5 12 13,5 15 16,5 18 Waktu inkubasi (jam) Gambar 7 Pertumbuhan isolat bakteri endofit Pertumbuhan bakteri pada media berbeda-beda sesuai dengan fisiologis bakteri itu sendiri. Fase-fase pertumbuhan bakteri terdiri dari fase lag, fase log, fase stasioner (fase statis) dan fase kematian. Metabolit sekunder paling banyak dihasilkan pada saat fase akhir log dan awal stasioner. Meryandini et al (2009), menyatakan bahwa aktivitas enzim-enzim seperti selulase akan meningkat seiring dengan pertumbuhan selnya. Menurut Akhdiya (2003), pengukuran biomasa dan aktivitas enzim menunjukkan puncak produksi enzim protease alkalin dan selulase paling tinggi pada fase stasioner. Namun ketika sel mencapai akhir fase stasioner, aktivitas 22 selulase menurun. EBA 7 memiliki pertumbuhan yang cepat yaitu 10.5 jam sudah memasuki fase stasioner. Berdasarkan hal itu, waktu optimum untuk ekstraksi metabolit EBA 7 adalah 10.5 jam setelah inokulasi. Waktu optimum untuk ekstraksi metabolit EDA 3 dan EBA 6 adalah 13.5 jam dan 16.5 setelah inokulasi, secara berturut-turut. Daya Hambat Senyawa Metabolit Bakteri Endofit terhadap Fusarium oxysporum secara in Vitro Hasil uji senyawa metabolit terhadap F. oxysporum pada media PDA menunjukkan bahwa adanya daya penghambatan pertumbuhan cendawan sampai hari terakhir pengamatan.Senyawa metabolit dari bakteri endofit EBA 6, EBA 7 dan EDA 3 memiliki kemampuan daya hambat yang berbeda-beda setiap tingkat konsentrasi 5%, 10% dan 20%. EBA 7 memiliki daya hambat tertinggi yaitu sebesar 34.88% pada konsentrasi 20% (Gambar 8). EDA 3 memiliki daya hambat tertinggi kedua setelah EBA 7 yaitu sebesar 25.53% pada konsentrasi 20% (Gambar 9). a Gambar 8 c d e Penghambatan koloni F. oxysporum oleh senyawa metabolit bakteri EBA 7 dengan konsentrasi: (a) 5%, (b) 10%, dan (c) 20%, (d) kontrol negatif dan (e) kontrol positif pada media PDA umur 10 hari a Gambar 9 b b c d e Penghambatan koloni F. oxysporum oleh senyawa metabolit bakteri EDA 3 dengan konsentrasi: (a) 5%, (b) 10%, dan (c) 20%, (d) kontrol negatif dan (e) kontrol positif pada media PDA umur 10 hari EBA 7 memiliki daya hambat yang lebih tinggi dibanding dengan yang isolat yang lain dapat disebabkan oleh kandungan senyawa metabolit yang dihasilkannya lebih kompleks dibandingkan dengan senyawa metabolit yang dikandung oleh EDA 3 dan EBA 6. Selain itu, media yang digunakan selama fermentasi metabolit juga dapat mempengaruhi pembentukan senyawa metabolit sekunder bakteri. Media dengan komposisi karbon yang kompleks merupakan kondisi yang kritis bagi pertumbuhan bakteri endofit sehingga bakteri endofit akan menghasilkan senyawa metabolit untuk mepertahankan kehidupannya (Kumala et al. 2006). 23 Senyawa metabolit EBA 7 lebih baik dalam menghambat pertumbuhan cendawan daripada metabolit EDA 3 dan EBA 6. Hal ini berbeda dengan uji daya hambat sebelumnya, dimana pada uji kultur ganda EDA 3 merupakan isolat yang paling tinggi dalam menghambat pertumbuhan F. oxysporum. Dua isolat bakteri ini yang akan digunakan untuk pengujian selanjutnya (Tabel 5). Mekanisme kerja metabolit bakteri endofit terhadap cendawan patogen dapat bersifat racun bagi organisme lain dalam hal ini cendawan patogen F. oxysporum.Mekanisme yang terjadi yaitu berupa antibiotik.Senyawa antibiotik ini adalah senyawa yang bersifat anticendawan.Seperti yang dilaporkan Widowati 2013, bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman Taxus sumatrana menghasilkan senyawa metabolit bersifat anticendawan.Hal ini ditunjukan oleh senyawa antifungal dari B. amyloliquefaciens dalam menghambat pertumbuhan Candida albicans. Tabel 5 Daya hambat senyawa metabolit bakteri endofit terhadap F. oxysporum Daya hambat pertumbuhan koloni cendawan (%)a Hari ke-…. setelah inokulasi Perlakuan 2 3 4 5 6 7 8 9 10 EBA 65 % 10.44d 4.81d 1.85d 8.88bc 5.29b 5.52c 2.85c 5.11c 7.39c EBA 6 10 % 15.30bcd 7.98d 7.31bc 11.63bc 8.76b 11.77c 6.97c 11.42c 10.42c EBA 6 20 % 23.07abc 24.15bc 11.32bc 12.40bc 13.60b 15.28bc 15.61bc 15.93bc 17.11bc EBA 75 % 5.67d 6.06d 2.95c 2.30c 4.35b 3.04c 3.50c 3.81c 8.17c EBA 7 10 % 13.44cd 8.51d 8.24bc 12.33bc 12.10b 9.30c 9.42c 9.60c 14.32c EBA 7 20 % 30.70a 31.71ab 30.07a 30.80a 30.94a 31.90a 32.06a 33.35a 34.88a EDA 35 % 24.67ab 15.04cd 8.27bc 11.17bc 9.80b 9.05c 5.90c 5.47c 8.95c EDA 3 10 % 30.09a 28.73ab 17.13b 16.60b 12.20b 10.26c 9.69c 10.37c 15.33bc EDA 3 20 % 31.04a 39.79a 35.01a 34.51a 30.34a 24.97ab 23.08ab 24.46ab 25.53ab a Angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji selang berganda Duncan). Perlakuan Benih dengan SenyawaMetabolit Bakteri Endofit Senyawa metabolit EBA 7 dan EDA 3 mempengaruhi tingkat infeksi cendawan patogen terbawa benih.Benih yang direndam dalam senyawametabolit bakteri endofit dapat menurunkan tingkat infeksi cendawan patogen terbawa benih. Tabel 6 menunjukkan bahwasenyawae metabolit EBA 7 dan EDA 3mampu menekan infeksi cendawan pada benih kedelai dibandingkan dengan kontrol (-), baik pada metode blotter test maupun growing on test. Hasil perlakuan perendaman benih menunjukkan persentase infeksi tertinggi terjadi pada air steril atau kontrol (-) yaitu sebesar 19% pada metode blotter test dan pada metode growing on test pada media agar air dan media tanah steril sebesar 44% dan 37.71% secara berturut-turut. Persentase infeksi terendah terjadi pada perlakuan perendaman benih didalam senyawametabolit yang dihasilkan isolat EBA 7 yaitu sebesar 2% (blotter test), 5.21% (growing on test pada media agar air) dan 8.33% (growing on test pada media tanah steril). Selanjutnya diikuti oleh perlakuan perendaman benih di dalam fungisida atau kontrol (+). 24 Perendaman benih di dalam senyawa metabolit yang dihasilkan oleh EDA 3 menunjukkan persentase infeksi sebesar sebesar 7% (blotter test), 9.57% (growing on test pada media agar air) dan 10.87% (growing on test pada media tanah steril). Hal ini dapat dilihat pada Gambar 10. Tabel 6 Tingkat infeksi dan penekanan tingkat infeksi cendawan patogen terbawa benih kedelai Blotter test Perlakuan Tingkat infeksi (%) Penekanan tingkat infeksi (%) 19 6 2 7 68.42 89.47 63.16 Kontrol (-) Kontrol (+) EBA 7 EDA 3 Growing on test Media agar air Media Tanah steril Penekanan Tingkat Penekanan Tingkat tingkat infeksi tingkat infeksi infeksi (%) infeksi (%) (%) (%) 44 35.71 12.36 71.91 6.67 81.33 5.21 88.16 8.33 76.67 9.57 78.24 10.87 69.60 Tingkat infeksi (%) 50 40 Kontrol (-) 30 Kontrol (+) 20 EBA 7 10 EDA 3 0 Blotter test Blotter test Gambar 10 Agar air Tanah steril Tingkat infeksi benih kedelai oleh F.oxysporum pada media blotter test, agar air dan tanah steril Penekanan tingkat infeksi (%) 100 80 60 Kontrol (+) 40 EBA 7 EDA 3 20 0 Blotter test Blotter test Gambar 11 Agar air Tanah steril Penekanan tingkat infeksi cendawan patogen terbawa benih kedelai pada media blotter test, agar air dan tanah steril 25 Gambar 11 menunjukkan bahwa senyawa metabolit EBA 7 dan EDA 3 mampu menekan infeksi cendawan pada benih yang ditanam dengan metode blotter test yaitu sebesar 89.47% dan 63.16% secara berturut-turut. Metabolit EBA 7 dan EDA 3juga mampu menekan infeksi cendawan pada benih yang ditanam dengan metode growing on test pada media agar air yaitu sebesar 88.16% dan 78.24% secara berturut-turut. Senyawa metabolit EBA 7 dan EDA 3juga mampu menekan infeksi cendawan pada benih yang ditanam dengan metode growing on test pada media tanah steril yaitu sebesar 76.67% dan 69.60% secara berturut-turut. Menurut Shu-Mei et al. (2008), senyawa anticendawan yang dihasilkan oleh isolat bakteri endofit yang berasal dari tanaman kedelai dapat mencegah penyakit yang disebabkan oleh Fusarium oxysporum f.sp glycine. Tabel 7 menunjukkan bahwa perlakuan perendaman benih di dalam senyawametabolit bakteri tidak mempengaruhi pertumbuhan benih kedelai.Hal ini dapat dilihat berdasarkan daya berkecambah dan tinggi tanaman.Bahkan, perendaman dengan senyawametabolit bakteri lebih meningkatkan daya berkecambah benih dibandingkan dengan perendaman di dalam air steril dan fungisida. Tabel 7 Pengaruh metabolit bakteri endofit terhadap pertumbuhan tanaman kedelai pada media agar air dan tanah steril Perlakuan Kontrol (-) Kontrol (+) EBA 7 EDA 3 Media agar air Daya Tinggi berkecambah tanaman (%) (cm) 75 9.24 89 10.46 96 11.63 94 10.60 Media tanah steril Daya Tinggi berkecambah tanaman (%) (cm) 84 24.79 90 30.30 96 31.38 92 30.55 Senyawa metabolit EBA 7 menunjukkan daya berkecambah tertinggi yaitu sebesar 96%.Selanjutnya diikuti oleh perlakuan dengan senyawametabolit EDA 3 yang menunjukkan daya berkecambah sebesar 92-94%.Perendaman benih di dalam air steril memiliki daya berkecambah sebesar 75-84% (Gambar 12).Hal ini dipengaruhi oleh adanya kemampuan senyawametabolit dalam melindungi benih dari infeksi cendawan F. oxysporum yang menyebabkan benih mati sebelum berkecambah. Perlakuan dengansenyawa metabolit bakteri tidak memberi pengaruh buruk pada pertumbuhan kedelai.Hal ini dapat dilihat berdasarkan tinggi tanaman kedelai (Gambar 13).Tinggi tanaman tertinggi terjadi pada perlakuan dengan senyawametabolit EBA 7 yaitu sebesar 11.63 cm pada media agar air dan 31.38 cm pada media tanah steril. Selanjutnya diikuti oleh EDA 3 yaitu sebesar 10.60 cm pada media agar air dan 30.55 cm pada media tanah steril. Hal ini menunjukkan bahwa pertumbuhan tanaman dengan perlakuan senyawa metabolit bakteri memiliki pertumbuhan yang lebih baik dibandingkan dengan kontrol negatif, seperti disajikan pada Gambar 14. 26 Daya berkecambah (%) 120 100 80 Kontrol (+) 60 Kontrol (-) 40 EBA 7 EDA 3 20 0 Agar air Tinggi tanaman (cm) Gambar 12 Tanah steril Daya berkecambah kedelai pada media agar air dan tanah steril 35 30 25 20 15 10 5 0 Kontrol (+) Kontrol (-) EBA 7 EDA 3 Agar air Gambar 13 Tanah steril Tinggi tanaman kedelai pada media agar air dan tanah steril a i ii iii iv v vi vii viii b Gambar 14 Pertumbuhan tanaman kedelai pada media: (a) agar air (perlakuan i. kontrol negatif, ii. kontrol positif, iii. EBA 7, iv. EDA 3) dan (b) tanah steril (perlakuan v. kontrol negatif, vi. kontrol positif, vii. EBA 7, viii. EDA 3) 27 Hal ini dapat disebabkan oleh senyawa yang terkandung di dalam metabolit yang memicu pertumbuhan dan mencegah perkembangan penyakit. Kontrol (-) memiliki pertumbuhan yang rendah dapat disebabkan oleh faktor lingkungan dan penyakit.Menurut Alcivar et al. (2007), tinggi dan hasil tanaman berkurang terjadi karena penyakit tanaman, defesiensi unsur hara dan air. Karakterisasi dan Identifikasi Isolat Bakteri Endofit Bakteri endofit EBA 6, EBA 7 dan EDA 3 merupakan bakteri endofit terpilih untuk dikarakterisasi dan diidentifikasi secara morfologi, fisiologi dan biokimia. Berdasarkan identifikasi yang dilakukan oleh ICBB Bogor (Tabel 8),ketiga isolat tersebut merupakan kelompok bakteri Xenorhabdus sp. (EBA 7), Listeria sp. (EDA 3) dan Pseudomonas sp. (EBA 6). Tabel 8 Karakteristik isolat bakteri endofit (Sumber ICBB) Kode isolat No. Pengamatan EBA 7 EDA 3 EBA 6 1 Ukuran koloni 0.5 mm 1-4 mm 1-2 mm 2 Bentuk koloni Irregular Circular Circular 3 Elevasi Flat Flat Flat 4 Tepi koloni Lobate Entire Entire 5 Warna Yellow Cream Bucam Yellowfish translucent 6 Permukaan Smooth Shiny Smooth (rather Shiny) Smooth shiny 7 Morfologi sel Bacill Cocobacilli/ oval Bacill 8 Gram Negatif Positif Negatif 9 Ukuran sel (p=0.5, l=o.25) µm (p=0.5-0.75, l=0.5) µm (p=0.75, l=0.5) µm 10 Penggunaan oksigen + + + 11 Penggunaan glukosa + + - 12 Endospora Tidak Tidak Tidak 13 Motil - + + 14 Nitrat - - + 15 Lisin + - + 16 Ornitin - - - 17 H2S - - - 18 Mannitol - + - 19 Xylose - + - 20 Indol - - - 28 Lanjutan Tabel 8 Kode isolat No. Pengamatan EBA 7 EDA 3 EBA 6 21 Urease - - - 22 Sitrat - - - 23 ONPG - + - 24 V-P - + - 25 TDA - - - 26 Gelatin - + + 27 Malonate - - - 28 Inositol - - - 29 Sorbitol - - - 30 Rhamnose - - - 31 Sukrose - - - 32 Lactose - - - 33 Arabinose - - - 34 Adonitol - - - 35 Raffinose - - - 36 Salisin - - - 37 Arginin + - + 38 Oksidase - - + 39 Hemolisis Negatif Negatif Negatif Xenorhabdus sp. Listeria sp. Pseudomonas sp. Bakteri Ketiga bakteri endofit yang berpotensi dalam menekan pertumbuhan cendawan patogen terbawa benih berasal dari kelompok bakteri gram negatif (Xenorhabdus sp. dan Pseudomonas sp.) dan kelompok gram positif (Listeria sp.). Bakteri endofit tersebut tidak bersifat patogen pada manusia karena menunjukkan hasil yang negatif pada pengujian hemolisis. Menurut Yang et al. (2012), Xenorhabdus sp. merupakan bakteri yang bersismbiosis dengan nematoda patogen serangga. Menurut Dayle et al. (2015), bakteri dari genus Listeria ada yang bersifat patogen dan nonpatogen. Umumnya bakteri Listeria diketahui sebagai bakteri kontaminan pada makanan seperti L. monocytogenes dan bakteri yang nonpatogen yaitu L. seeligeri dan L. innocua. Selain Xenorhabdus sp. dan Listeria sp., bakteri yang ditemukan adalah Pseudomonas sp. yang merupakan bakteri umum ditemukan sebagai bakteri endofit pada tumbuhan. Namun pada penelitian ini Xenorhabdus sp. dan Listeria sp. menunjukkan daya hambat yang lebih tinggi dibandingkan dengan Pseudomonas sp. Hal ini 29 dapat disebabkan oleh senyawa metabolit yang dihasilkan bakteri Xenorhabdus sp. (EBA 7) dan Listeria sp. (EDA 3) memiliki komponen yang lebih berpotensi dalam menekan cendawan patogen terbawa benih. Analisis Komponen SenyawaMetabolit Bakteri Endofit Komponen kimia senyawa EBA 7 dan EDA 3 dianalisis dengan menggunakan Pyrolysis Gass Chromatography Mass Spectrometry (Py-GCMS). Hasil analisis senyawa metabolit bakteri menunjukkan adanya perbedaan jumlah kandungan senyawa satu sama lain. Tabel 9Hasil Py-GCMS senyawa metabolit isolat bakteri EBA 7 No. Persentase (%) Nama Senyawa 1 3.24 Phenol 2 2.31 Phenol, 4-methyl- 3 2.52 Pentanal 4 4.20 4-methyloxazole 5 2.49 Oxirane, (1,1-dimethylbutyl)- 6 1.54 2,3-dihydro-benzofuran 7 1.69 Cyclohexanone, 2-methyl-, oxime 8 2.37 Piperidine, 1,2-dimethyl- 9 3.96 1,6-heptadiene-3-d, 5-methyl- 10 4.98 Piperidine, 1,2-dimethyl- 11 6.12 7-hydroxy-6-methyl-bicyclo 12 4.42 Propandinitril, cyclooctyliden- 13 5.62 Propandinitril, cyclooctyliden 14 11.21 3-(4-methyl-1-quinolinio)-1-propanesulfonate 15 4.71 L-Leucine 16 5.59 Cycloalanylleucine 17 5.70 N-(3-butenyl)-dipropylamine 18 3.04 1,4-diaza-2,5-dioxo-3-isobutyl bicyclo 19 5.24 1,4-diaza-2,5-dioxo-3-isobutyl bicyclo 20 4.87 1,4-diaza-2,5-dioxo-3-isobutyl bicyclo 21 5.62 1,4-diaza-2,5-dioxo-3-isobutyl bicyclo 22 0.86 6-Octadecenoic acid, methyl ester 23 1.70 1,4-diaza-2,5-dioxo-3-isobutyl bicycle 24 3.16 3-benzyl-1,4-diaza-2,5-dioxobicyclo 25 2.84 3-benzyl-1,4-diaza-2,5-dioxobicyclo 30 Tabel 10 Hasil Py-GCMS senyawa metabolit isolat bakteri EDA 3 No. Persentase (%) Nama senyawa 1 2.47 2-propynoic acid 2 5.11 Phenol 3 3.22 (z)-1-(1-butenyl)aziridine 4 2.31 2 –propen-1-amine 5 2.61 Cyclopropane, 2-chloro-1,1,3-trimethyl- 6 1.36 1,6-diimino-2,9-dioxocyclodecane 7 1.73 3a,7a-epoxy-3a,4,5,6,7,7a-hexahydro-4-indanone 8 1.76 2,3-dihydro-benzofuran 9 2.12 Spiro[3.4]octan-5-one 10 1.05 Cyclooctanone, 2-bromo- 11 1.50 1-tetradecanol 12 1.06 2,5-dibora-1,4-dioxan, 2,3,5-triethyl-6-propyl- 13 1.92 5-ethoxy-4-ethoxycarbonylmethyloxazole 14 1.16 Morpholine, 4-acetyl- 15 3.24 Cyclohexane, 1,2,3-trimethyl- 16 1.00 3-pyrrolidin-2-yl-propionic acid 17 4.88 Cycloalanylleucine 18 2.03 Cocaine 19 6.23 1,4-diaza-2,5-dioxobicyclo 20 3.97 Cycloglycylserine 21 4.30 1,4-diaza-2,5-dioxo-3-isobutyl bicyclo 22 2.14 Methyl-n 23 9.31 1,4-diaza-2,5-dioxo-3-isobutyl bicyclo 24 3.94 1,4-diaza-2,5-dioxo-3-isobutyl bicyclo 25 6.24 1,4-diaza-2,5-dioxo-3-isobutyl bicyclo 26 10.88 5,10-diethoxy-2,3,7,8-tetrahydro-1h,6h-dipyrrolo 27 0.78 9-octadecenoic acid, methyl ester 28 1.19 1,4-diaza-2,5-dioxo-3-isobutyl bicyclo 29 5.09 3-benzyl-1,4-diaza-2,5-dioxobicyclo 30 5.40 3-benzyl-1,4-diaza-2,5-dioxobicyclo 31 Hasil Py-GCMS manunjukkan bahwa ada beberapa senyawa dominan yang terdapat pada masing-masing senyawa EBA 7 (Xenorhabdus sp.) dan EDA 3 (Listeria sp.). EBA 7 memiliki 25 jenis komponen senyawa metabolit sedangkan EDA 3 memiliki 30 jenis komponen senyawa metabolit. Komponen kimia yang dominan terdapat pada isolat bakteri endofit EBA 7 adalah 3-(4-methyl-1quinolinio)-1-propanelsulfonate (11.21%) bersifat anticedawan, 7-hydroxy-6methyl-bicyclo (6.12%), propandinitril-cyclooctyliden (5.62%), dan 1,4-diaza-2,5dioxo-3-isobutyl bicyclo (5.62%)(Tabel 9). Komponen kimia yang dominan terdapat pada isolat bakteri endofit EDA 3 adalah 5,10-diethoxy-2,3,7,8tetrahydro-1H,6H-dipyrrolo (10.88%) bersifat anticendawan, 1,4-diaza-2,5dioxo-3-isobutyl bicyclo (9.31%), dan fenol (5.11%) bersifat anticendawan (Phenomenex 2015). Senyawa-senyawa kimia yang dominan dari senyawa kedua isolat bakteri belum tentu menjadi senyawa yang aktif dalam menghambat pertumbuhan koloni F. oxysporum. Oleh karena itu untuk mengetahui senyawa yang berperan penting dalam menghambat F. oxysporum perlu dilakukan fraksinasi dan pengujian masing-masing senyawa kimia tersebut terhadap cendawan. Penelitian tentang metabolit yang dihasilkan oleh Xenorhabdus sp. dan Listeria sp. belum banyak dilaporkan. Namun menurut Yang et al. (2012), Xenorhabdus sp. mengeluarkan senyawa metabolit sekunder berupa toksin yang dapat digunakan sebagai agen pengendali serangga pada tanaman.Hal ini disebabkan karena protein toksinnya yang bersifat insektisidal. Namun, pada penelitian ini, senyawa yang diketahui secara umum dapat bersifat antimikrobia adalah fenol. Fenol merupakan salah satu senyawa komponen yang terdapat pada kedua metabolit bakteri. Fenol ditemukan sebesar 3.24% pada senyawa metabolit bakteri Xenorhabdus sp. dan 5.11% pada senyawa metabolit bakteri Listeria sp. Menurut Oku (1994), fenol merupakan senyawa yang bersifat antimikrobia yang dapat menghambat pertumbuhan cendawan. 32 5 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Bakteri endofit asal tanaman kedelai yang memiliki potensi untuk menghambat pertumbuhan Fusarium oxysporum adalah Listeria sp., Pseudomonas sp. dan Xenorhabdus sp. secara in vitro. Senyawa metabolit yang berpotensi dalam menghambat pertumbuhan F. oxysporum adalah Xenorhabdus sp. dan Listeria sp. secara in vitro. Senyawa metabolit Xenorhabdus sp. dan Listeria sp. juga mampu menurunkan tingkat infeksi F. oxysporum pada metode blotter test dan growing on test. Saran Senyawa metabolit Xenorhabdus sp. dan Listeria sp. perlu difraksinasi untuk mengetahui senyawa yang paling penting dalam menekan serangan cendawan patogen terbawa benih kedelai. Aplikasi senyawametabolit Xenorhabdus sp. dan Listeria sp. secara in vivo dapat dilakukan dengan berbagai metode aplikasi sehingga diperoleh hasil yang utuh. Senyawa metabolit Xenorhabdus sp. dan Listeria sp. sebaiknya dapat diuji terhadap bakteri patogen terbawa benih. 33 DAFTAR PUSTAKA Agarwal VK, Sinclair JB. 1997. Principles of Seed Pathology. Second Edition. New York (US): Lewis Publishers. Akhdiya A. 2003. Isolasi bakteri penghasil enzim protease alkalin termostabil. Buletin Plasma Nutfah. 9(2): 38-44. Alcivar A, Jacobson J, Rainho J. 2007. Genetic analysis of soybean plant height, hypocotyl and internode lengths.Journal of Agricultural, Food, and Environmental Sciences.1(1): 1-20. Alves MDC, Pozza EA. 2012. Scanning electron microscopy detection of seed borne fungi in blotter test. Current Microscopy Contributions to Advances in Science and Technology.230-238. Anggraeni ND, Suwarno FC. 2014. Kemampuan benih kedelai (Glycine max L.) untuk mempertahankan viabilitasnya setelah didera dengan etanol. Bul Agrohorti. 1(4): 34-44. Athukorala SNP, Fernando WGD, Rashid KY. 2009. Identification of antifungal antibiotics of Bacillus species isolated from different microhabitats using polymerase chain reaction and MALDI-TOF mass spectrometry. Journal ofCanada Microbiology. 55: 1021-1032. Barnett HL, Hunter BB. 1999. Illustrated Genera of Imperfect Fungi. Fourth Edition. Minnesota (US): APS Pr. [BBPPP] Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian. 2010. Standar Mutu Fisik Biji Kedelai. Informasi Ringkas Bank Pengetahuan Tanaman Pangan Indonsesia. [BPS] Badan Pusat Statistik Republik Indonesia. 2013.Berita Resmi Statistik: Produksi Padi, Jagung, dan Kedelai (Angka Ramalan II tahun 2013). [diunduh 2014 Des 19]. Tersedia pada: http://www.bps.go.id. [BPSB] Balai Pengawasan dan Sertifikasi Benih IV.2013. Evaluasi Pelaksanaan Kegiatan UPT.BPSB THP Satuan Kerja Dinas Pertanian Provinsi Sumatera Utara. Laporan Tahunan. Medan (ID): BPSB. Copeland LO, Mc Donald MB. 1985. Principles of Seed Science and Technology. New York (US): Burgess Publishing Company. Dailey RC, Welch LJ, Hitchins AD, Smiley RD. 2015. Effect of Listeria seeligeri or Listeria welshimeri on Listeria monocytogenes detection in and recovery from buffered Listeria enrichment broth.Food Microbiology. 46: 528-534. doi: 10.1016/j.fm.2014.09.008. Dalal J, Kulkarni N. 2013. Population dynamics and diversity of endophytic bacteria associated with soybean (Glycine max (L) Merril). Journal of British Microbiology Research. 3(1): 96-105. Dewi R, Sutrisno H, Nazirwan. 2013. Pemulihan detiorisasi benih kedelai (Glycine max L.) dengan aplikasi giberelin. Jurnal Penelitian Pertanian Terapan. 13 (2): 116-122 Djaenuddin N. 2011. Bioekologi Penyakit Layu Fusarium oxysporum.Seminar dan Pertemuan Tahunan XXI PEI, PFI Komda Sulawesi Selatan dan Dinas Perkebunan Pemerintah Provinsi Sulawesi Selatan tanggal 7 Juni 2011 di Makassar. 34 Dudeja SS, Giri R, Saini R, Suneja-Madan P, Kothe E. 2012.Interaction of endophytic microbes with legumes.Journal of Basic Microbiology. 52: 246-260. Dugan FM. 2006. The Identification of Fungi. Minnesota (US): APS Pr. Elita A, Saryono S, Christine J. 2013. Penentuan waktu optimum produksi antimikroba dan uji fitokimia ekstrak kasar fermentasi bakteri endofit Pseudomonas sp. dari umbi tanaman dahlia (Dahlia variabilis).Journal of Indonesian Chemistry Acta. 3(2): 56-62. Faturrahman.2001. Kemampuan Bacillus subtilis GB03 yang diberi sumber karbon alami yang berbeda dalam menghambat pertumbuhan Fusarium oxysporum.J Pen Unram. 2 (12). Habazar T, Resti Z, Yanti Y, Trisno J, Diana A. 2012. Penapisan bakteri endofit akar kedelai secara in planta untuk mengendalikan penyakit pustul bakteri. J Fitopatol Indones. 8 (4): 103-109. Hung PQ, Annapurna K. 2004. Isolation and characteristic of endophytic bacteria in soybean (Glycine sp.).Journal of Omonrice. 12: 92-101. Ilyas S. 2012. Ilmu dan Teknologi Benih: Teori dan Hasil-hasil Penelitian. Bogor (ID): IPB Pr. Indartono. 2011. Pengkajian suhu ruang penyimpanan dan teknik pengemasan terhadap kualitas benih kedelai. Jurnal Gema Teknologi. 16(3): 158163. Irwan AW. 2006. Budidaya Tanaman Kedelai (Glycine max (L.) Merill). Jatinangor (ID): Universitas Padjajaran. ISTA. 2014. International rules for seed testing. Seed Sci Technol. 24:39-42. Jasnic SM, Vidic MB, Bagi FF, Dordevic VB. 2005. Pathogenecity of Fusarium species in soybean.Proc Nat Sci. 109:113-121. Kumala S, Shanny F, Wahyudi P. 2006. Aktivitas antimikroba metabolit bioaktif mikroba endofitik tanaman trengguli (Cassi fistula L.).Jurnal farmasi Indonesia. 3(2): 97-102. [Kementrian Pertanian] Direktorat Jenderal Tanaman Pangan. 2013. Pedoman Teknis Pengelolaan Produksi Kedelai Tahun 2013. Jakarta (ID): Kementan. Li S, Hartman GL, Domier LL. 2008. Quantification of Fusarium solani f. sp. glycinesisolates in soybean roots by colony-forming unit assays and real-time quantitativePCR. Journal of Theory Application Genetic. 117: 343-352. doi:10.1007/s00122-008-0779-2. Li S, Hartman GL. 2003. Molecular detection of Fusarium solani f.sp.glycines in soybean roots and soil. Plant Pathology. 52: 74-83 McGee DC, Nyvall RF. 2008. Soybean Seed Health.Iowa State University. Medic-Pap S, Milosevic M, Jasnic S. 2007.Soybean seed-borne fungi in the vojvodina province.Journal of Phytopathology. 45:55-65. Meryandini A, Widosari W, Maranatha B, Sunarti TC, Rachmania N, Satria H. 2009. Isolasi bakteri selulolitik dan karakterisasinya.Makara sains. 13(1): 33-38. Munif A, Hallmann J, Asikora R. 2012. Isolation of endophytic bacteria from tomato and their activities against fungal diseases.Journal of Microbiology Indonesian. 6(4): 148-156. doi: 10.5454/mi.6.4.2. 35 Narayanasamy P. 2011.Microbial plant-pathogens, detection and disease diagnosis: fungal pathogens.Volume 1.Springer Science+business media. doi:10.1007/978-90-481-9735-4_2. Nugraheni ES. 2010. Karakterisasi biologi isolat-isolat Fusarium sp. pada tanaman cabai merah (Capsicum annum L.) asal Boyolali. [Skripsi]. Surakarta (ID): Universitas Sebelas Maret. Oku H. 1994. Plant Pathogenesis and Disease Control. New York (US): CRC Pr. Pal KK, Gardener BM. 2006. Biological Control of Plant Pathogens.The Plant Health Instructor.doi: 10.1094/PHI-A-2006-1117-02. [Phenomenex] Phenomemex product. 2015. [diunduh Okt 28]. Tersedia pada: http://www.phenomenex.com. Prihatman K. 2000. Sistem Informasi Manajemen Pembangunan di Perdesaan, ProyekPEMD, BAPPENAS tentang Budidaya Pertanian Kedelai (Glycine max).[diunduh 2014 Mei 4]. Tersedia pada:http://www.ristek.go.id. Purwantisari S, Pujiyanto S, Ferniah R. 2005. Uji Efektivitas Bakteri Kitinolitik sebagai Pengendali Pertumbuhan Kapang Patogen Penyebab Penyakit Utama Tanaman Sayuran dan Potensinya sebagai Bahan Biofungisida Ramah Lingkungan.[Laporan penelitian]. Semarang (ID): Universitas Diponogoro. Purwanti S. 2004. Kajian suhu ruang simpan terhadap kualitas benih kedelai hitam dan kedelai kuning.Ilmu Pertanian. 11(1): 22 31. Rahmawati. 2009. Mutu Fisiologis Benih Dari Berbagai Tingkat Bobot Biji Selama Periode Simpan. Prosiding Seminar Nasional Serealia 2009. Hlm: 273-282. Ramarathnam R, Bo S, Chen Y, Fernando WGD, Xuewen G, Kievit TD. 2007. Molecular and biochemical detection of fengycin and bacillomysin D producing Bacillus spp., antagonistic to fungal pathogens of canola and wheat. Can J Microbiol. 53: 901-911. Ratulangi MM. 2004. Control of Sclerotium wilt deaseas on soybean by soil solarization. Eugenia 10(1): 1-7. Shu-Mei Z, Chang-Qing S, Yu-Xia W, Jing L, Xiao-Yu Z, Xian-Cheng Z. 2008. Isolation and characteristic of antifungal endophytic bacteria from soybean.Institute of Microbiology. 35(10): 1593-1599. Sofia D. 2007. Pengaruh Konsentrasi dan Lama Waktu Pemberian Kolkhisin terhadap Pertumbuhan dan Poliploid pada Biji Muda Kedelai yang Dikultur secara in Vitro.[Karya tulis]. Medan (ID): Universitas Sumatera Utara. Sudantha I. 2010.Pengujian beberapa jenis jamur endofit dan saprofit Trichoderma Spp. terhadap penyakit layu Fusarium pada tanaman kedelai. Jurnal Agroteksos. 20(2-3): 90-102. Sunantora IMM. 2000. Teknik Produksi Benih Kedelai. Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan.Instalasi Penelitian dan Pengkajian Teknologi Pertanian Denpasar. Bali (ID). Sunatmo TI. 2009. Eksperimen Mikrobiologi Dalam Laboratorium. Jakarta (ID): Ardy Agency. Suprapto HS.2001. Bertanam Kedelai. Jakarta (ID): Penebar Swadaya. 36 Suryanto D, Irawati N, Munir E. 2011. Isolation and characterization of chitinolytic bacteria and their potential to inhibit plant pathogenic fungi. J Mikrobiol Indones.5(2): 144-148. Wain-Tassi AL, Dos Santos JF, Panizzi RDC, Vieira RD. 2011.Seed-borne pathogens and electrical conductivity of soybean seeds. Journal of Scientia Agricola. 69 (1): 19-25 Webster J, Weber RWS. 2007. Introduction to Fungi. Third Edition. New York (US): Cambrige University Pr Widowati T. 2013. Identifikasi senyawa Kimia Antifungal dari Bakteri Endofit Asal Taxus sumatrana. [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Wu LC, Lin YS, Chiu KY. 1964. Seed-borne diseases of soybean in taiwan II survey of the seed-borne pathogens from soybean seeds. Botanical Bulletin of Acedemia Sinica. 5: 105-112. Yang J, Zeng HM, Lin HF, Yang XF, Liu Z, Guo LH, Yuan JJ, Qiu DW. 2012. An insecticidal protein from Xenorhabdus budapestensis that result in prophenoloxidase activation in the wax moth, Galleria mellonella. Journal of Invertebrate Pathology. 110: 60-67. doi: 10.1016/j.jip.2012.02.06 Zhang YZ, Chen WF, Li M, Sui XH, Liu HC, Zhang XX, Chen WX. 2012. Bacillus endoradicis sp. nov., an endophytic bacterium isolated from soybean root. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62: 359–363. 37 LAMPIRAN Lampiran 1Respon hipersensitif pada daun tembakau oleh bakteri endofit No. Kode Isolat Asal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 EAB1 EAB2 EAB3 EAB4 EAB5 EAB6 EAB7 EAB8 EAB9 EBB1 EBB2 EBB3 EBB4 EBB5 EBB6 EBB7 EBB 8 EDB1 EDB2 EDB3 EDB4 EDB5 EDB6 EAA1 EAA2 EAA3 EAA4 EAA5 EAA6 EAA7 EAA8 EAA9 EAA10 EAA11 EAA12 EAA13 EAA14 EAA15 EAA16 EAA17 Akar Akar Akar Akar Akar Akar Akar Akar Akar Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Daun Daun Daun Daun Daun Daun Akar Akar Akar Akar Akar Akar Akar Akar Akar Akar Akar Akar Akar Akar Akar Akar Akar Varietas Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Hipersensitif (+) (-) √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ 38 Lanjutan Lampiran 1 No. 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 Kode Isolat Asal EAA 18 EBA 1 EBA 2 EBA3 EBA4 EBA5 EBA6 EBA7 EBA8 EBA9 EBA10 EBA11 EBA12 EBA13 EBA14 EBA15 EBA16 EBA17 EBA18 EBA19 EBA20 EBA21 EBA22 EBA23 EBA24 EBA25 EBA26 EBA27 EBA28 EDA1 EDA2 EDA3 EDA4 EDA5 EDA6 EDA7 EDA8 EDA9 EDA10 EDA11 EDA12 EDA13 EDA14 EDA15 Akar Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Batang Daun Daun Daun Daun Daun Daun Daun Daun Daun Daun Daun Daun Daun Daun Daun Varietas Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Hipersensitif (+) (-) √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ 39 Lanjutan Lampiran 1 No. Kode Isolat Asal Varietas 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 Total EDA16 EDA17 BNB1 BNB2 BNB3 BNB4 BNB5 BNB6 BNA1 BNA2 BNA3 BNA4 BNA5 BNA6 BNA7 BNA8 BNA9 BNA10 102 isolat Daun Daun Benih Benih Benih Benih Benih Benih Benih Benih Benih Benih Benih Benih Benih Benih Benih Benih Anjasmoro Anjasmoro Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Buluh Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Anjasmoro Hipersensitif (+) (-) √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ 54 isolat 48 isolat Keterangan : Hipersensitif positif (+) = bersifat patogenik, hipersensitif negatif (-) = bersifat nonpatogenik 40 Lampiran 2 Analisis komponen senyawa metabolit isolat bakteri EBA 7 41 Lampiran 3 Analisis komponen senyawa metabolit isolat bakteri EDA 3 42 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Medan pada tanggal 30 November 1989 sebagai anak tunggal dari pasangan Bapak Tasman dan Ibu Suryati, SH. Penulis lulus dari Sekolah Menengah Atas Negeri 3 Medan tahun 2008 dan pada tahun yang sama penulis diterima di Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara melalui program SNMPTN (Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri). Penulis lulus pendidikan sarjana pada tahun 2013. Pada tahun 2013, penulis diterima di Program Studi Fitopatologi pada Program Magister Pascasarjana Institut Pertanian Bogordengan perolehan bantuan biaya pendidikan daribeasiswa pendidikan pascasarjana program BPPDN-DIKTI (Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri-Direktorat Pendidikan Tinggi). Penulis menamatkanpendidikan magister pada tahun 2015. Sebagian dari tesis pernah dipresentasikan pada Kongres dan Seminar Persatuan Fitopatologi Indonesia (PFI) XXIII.