perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id commit to user KLONING

perpustakaan.uns.ac.id
digilib.uns.ac.id
KLONING DAN ANALISIS MOLEKULER GEN PENYANDI PROTEIN NS4B
VIRUS HEPATITIS C 1a (HCV 1a) ISOLAT JAWA TENGAH
SKRIPSI
Untuk Memenuhi Persyaratan
Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran
FAQIHUDDIN AHMAD
NIM. G0007068
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS
SEBELAS
commit
to userMARET
SURAKARTA
2010
perpustakaan.uns.ac.id
digilib.uns.ac.id
PENGESAHAN SKRIPSI
Skripsi dengan judul : Kloning dan Analisis Molekuler Gen Penyandi Protein
NS4B Virus Hepatitis C 1a (HCV 1a) Isolat Jawa Tengah
Faqihuddin Ahmad, G0007068, Tahun 2010
Telah diuji dan sudah disahkan di hadapan Dewan Penguji Skripsi
Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret
Pada Hari Kamis, Tanggal 23 Desember 2010
Pembimbing Utama
Nama : Afiono Agung Prasetyo, dr., Ph.D
NIP : 19770907 200212 1 002
(
)
(
)
(
)
(
)
Pembimbing Pendamping
Nama : Yulia Sari, S.Si., M.Si.
NIP : 19800715 200812 2 001
Penguji Utama
Nama : Betty Suryawati, dr., M.Biomed.Sci.
NIP : 19760525 200112 2 001
Anggota Penguji
Nama : Isdaryanto, dr., MARS
NIP : 19500312 197610 1 001
Surakarta, 23 Desember 2010
Ketua Tim Skripsi
Dekan FK UNS
Muthmainah, dr., M.Kes.
Prof. Dr. AA Subijanto, dr., MS.
NIP. 19660702 19980 2 2001
NIP. 19481107 197310 1 003
commit to user
ii
perpustakaan.uns.ac.id
digilib.uns.ac.id
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT karena limpahan
nikmat, rahmat, hidayah, serta ridho-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan
skripsi dengan judul “Kloning dan Analisis Molekuler Gen Penyandi Protein
NS4B Virus Hepatitis C 1a (HCV 1a) Isolat Jawa Tengah”.
Dengan selesainya penulisan skripsi ini, perkenankanlah dengan setulus
hati penulis menyampaikan penghargaan dan ucapan terima kasih kepada:
1. Prof. Dr. AA Subijanto, dr., MS, selaku Dekan Fakultas Kedokteran
Universitas Sebelas Maret Surakarta.
2. Afiono Agung Prasetyo, dr., Ph.D selaku pembimbing utama yang telah
berkenan memberikan waktu, bimbingan, saran, dan motivasi bagi penulis.
3. Yulia Sari, S.Si., M.Si. selaku pembimbing pendamping yang telah
memberikan waktu, bimbingan, saran, dan motivasi bagi penulis.
4. Betty Suryawati, dr., M.Biomed.Sci. selaku penguji utama yang telah
memberikan koreksi dan saran untuk menyempurnakan penyusunan skripsi.
5. Isdaryanto, dr., MARS selaku anggota penguji yang telah memberikan
koreksi dan saran untuk menyempurnakan penyusunan skripsi.
6. Muthmainah, dr., M.Kes selaku Ketua Tim skripsi Fakultas Kedokteran
Universitas Sebelas Maret.
7. Bapak dan ibu tercinta Sugeng Indardi, drs., MBA dan Linda Suyati, dra.,
M.Si atas segala do’a restu yang tiada habisnya, bimbingan serta support baik
moril maupun materiil.
8. Teman-teman seperjuangan di Kastrat de Geneeskunde, semoga selalu tetap
semangat dalam mengobarkan suasana ilmiah di kampus tercinta dan jangan
lupa, sifat nekat harus tetap terpelihara.
9. Semua pihak yang telah memberi bantuan secara langsung maupun tidak
langsung sehingga terselesainya skripsi ini.
Penulis menyadari sepenuhnya bahwa dalam penyusunan skripsi ini tidak
lepas dari kekurangan karena keterbatasan waktu, tenaga, dan pengetahuan
penulis. Oleh karena itu, dibutuhkan saran dan masukan untuk menyempurnakan
skripsi ini. Semoga skripsi ini bermanfaat bagi kita semua. Amin.
Surakarta, 23 Desember 2010
Faqihuddin Ahmad
commit to user
vi
1
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah
Hepatitis C virus (HCV) dikenal sebagai salah satu virus yang
menyebabkan problem mendasar dalam dunia kesehatan. Angka kejadian
infeksi HCV pada populasi penduduk dunia mencapai 3 % yang berarti 170
juta orang kini terinfeksi HCV (Alter, 2007; Holmberg, 2009). Di Indonesia
sendiri diperkirakan hingga tujuh juta penduduk kini mengalami infeksi aktif
HCV (Kementrian Kesehatan RI, 2009). Selain itu beberapa laporan
menunjukkan bahwa 70 – 85 % infeksi HCV berlangsung persisten. Hanya 20
– 25 % pasien infeksi HCV yang dapat sembuh sempurna, sementara yang lain
berisiko tinggi untuk mencapai kondisi terminal (Lemon et al., 2007).
Dalam usaha mengeradikasi HCV, dibutuhkan pengetahuan mengenai
strategi replikasi virus maupun proses patofisiologi HCV yang hingga kini
masih belum begitu banyak diketahui. Penelitian lanjutan HCV membutuhkan
plasmid yang mengandung sebagian atau seluruh gen HCV untuk diketahui
aktivitas maupun fungsinya. Selain itu, penelitian lanjutan HCV juga
memerlukan suatu model replikasi yang disebut dengan replikon maupun
sistem infeksius. Proses pembuatan replikon maupun sistem infeksius dapat
secara langsung dikloning dari keseluruhan genom HCV, namun akan lebih
bermanfaat ketika replikon maupun sistem infeksius tersebut dibuat melalui
kloning secara terpisah dari masing-masing gen. Plasmid rekombinan yang
commit to user
perpustakaan.uns.ac.id
2
digilib.uns.ac.id
dibentuk dari masing-masing gen HCV dapat langsung dimanfaatkan untuk
penelitian lanjutan di bidang HCV.
Di Indonesia sendiri penelitian mengenai HCV hingga kini hanya
sampai pada tahap seroprevalensi dan epidemiologi molekuler. Sejauh yang
peneliti tahu, Indonesia masih belum memiliki plasmid, replikon maupun
sistem infeksius HCV. Oleh karena itu, Laboratorium Mikrobiologi dan
Biomedik FK UNS mengadakan penelitian pembuatan plasmid rekombinan
gen HCV, replikon dan sistem infeksius untuk menunjang penelitian HCV
berbasis molekuler di Indonesia. Penelitian epidemiologi molekuler HCV yang
dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Biomedik FK UNS dengan
mengambil sampel dari beberapa daerah di Jawa Tengah mendapatkan isolat
HCV dengan serotipe terbanyak adalah 1a. Oleh karena itu Laboratorium
Mikrobiologi dan Biomedik FK UNS sejak tahun 2010 ini memutuskan untuk
mengkloning HCV 1a terlebih dahulu. Isolat HCV 1a yang ada telah diseleksi
dan diputuskan isolat dengan kode 09IDSKAC-20 yang akan dikloning untuk
pembuatan plasmid gen HCV.
Secara umum gen pengkode protein yang terdapat pada HCV terbagi
menjadi dua yaitu gen pengkode protein struktural dan non-struktural, yang
diketahui salah satunya adalah gen NS4B. Beberapa penelitian yang telah
dilakukan mengarahkan pada teori bahwa NS4B memiliki fungsi penting
dalam siklus HCV dan hal tersebut menarik perhatian peneliti HCV dalam
pengembangan vaksin maupun obat antivirus dengan NS4B sebagai target
utamanya (Lemon et al., 2010). Pembuatan plasmid yang menyandi NS4B
commit to user
3
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
menjadi sangat penting dalam menunjang penelitian lanjutan mengenai NS4B
tersebut. Gen NS4B akan disubkloning ke dalam vektor pETBlue-1 (Novagen,
Darmstadt, Jerman) sehingga menghasilkan plasmid pET-HCV NS4B. Setelah
gen NS4B tersebut berhasil dikloning, maka diperlukan analisis molekuler.
Analisis molekuler genom HCV pertama kali dilakukan oleh Choo et
al. pada tahun 1989. Hasil penelitian tersebut menunjukkan karakteristik
keseluruhan genom HCV untuk pertama kali. Hasil kloning tersebut menjadi
titik balik pemahaman bahwa produk protein genom HCV, yang dikenal saat
itu sebagai non-A non-B hepatitis virus, dapat diidentifikasi dan dikaji secara
intensif. Kini penelitian mengenai genom virus HCV sudah sangat berkembang
pesat, terlebih pada pengetahuan mengenai struktur topologisnya. Dalam
pembahasan penelitian skripsi, peneliti menitikberatkan pada analisis
molekuler hasil kloning HCV 1a NS4B.
B. Rumusan Masalah
Bagaimana kloning dan analisis molekuler klon gen penyandi protein
NS4B HCV 1a isolat Jawa tengah?
C. Tujuan Penelitan
Tujuan jangka pendek dari penelitian ini adalah mendapatkan plasmid
pET-HCV1a NS4B dan analisis molekuler gen penyandi NS4B virus hepatitis C
1a isolat Jawa Tengah. Sedangkan tujuan jangka panjang dari penelitian ini
adalah sebagai tahap awal dalam pengumpulan koleksi plasmid HCV 1a yang
selanjutnya dapat digunakan dalam pembuatan replikon maupun sistem
commit to user
4
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
infeksius HCV. Informasi molekuler yang didapatkan dari penelitian ini
berguna sebagai data awal dalam penelitian HCV lanjutan.
D. Manfaat Penelitian
1.
Manfaat Teoritis
Penelitian ini dapat memberikan informasi ilmiah mengenai analisis
molekuler gen penyandi protein NS4B virus hepatitis C 1a isolat Jawa
Tengah.
2.
Manfaat Praktis
Manfaat praktis penelitian ini adalah didapatkannya plasmid pET-HCV
NS4B isolat Jawa Tengah yang nantinya dapat digunakan sebagai koleksi
plasmid HCV Laboratorium Mikrobiologi dan Biomedik FK UNS.
Plasmid dan analisis molekularnya dapat digunakan langsung sebagai
bahan penelitian lanjutan HCV baik untuk mempelajari strategi replikasi,
patogenesis, diagnosis, terapi, maupun vaksin HCV. Selain itu, plasmid
tersebut dapat pula digunakan sebagai bahan dalam pembentukan replikon
maupun sistem infeksius HCV.
commit to user
5
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
BAB II
LANDASAN TEORI
A. Virus Hepatitis C (HCV)
HCV termasuk dalam famili Flaviviridae dan bergenus Hepacivirus
(ICTVdB Management, 2006). HCV adalah virus penyebab utama penyakit
hepatitis C akut maupun kronis. Pasien hepatitis C kronis sering ditemukan
dalam keadaan asimptomatik. Walaupun dalam keadaan asimptomatik,
proses viremia tetap berlanjut hingga terjadi kerusakan hepar. Kerusakan
hepar baru terlihat ketika dalam keadaan gagal fungsi hepar. Proses
patologis yang berlangsung menyebabkan perubahan susunan histologis
hepar antara lain steatosis, fibrosis, hingga karsinoma hepar (Lemon et al.,
2007).
HCV memiliki genom RNA positif sepanjang kurang lebih 9600
pasang basa. Virus tersebut memiliki Open Reading Frame (ORF) panjang
yang diapit oleh 5’-Untranslated Region (UTR) dan 3’-UTR. Poliprotein
virus yang dihasilkan secara fungsional dapat dibagi menjadi tiga daerah,
yaitu N-terminal, tengah, dan C-terminal. Daerah N-terminal diasosiasikan
dengan daerah penghasil protein struktural yakni protein inti (core/ C),
envelope glycoprotein 1 dan 2 (E1 dan E2). Daerah tengah terdiri dari
protein p7 dan NS2. Daerah C-terminal terdiri dari protein non-struktural
(NS3, NS4A, NS4B, NS5A, dan NS5B) yang dibutuhkan dalam replikasi
RNA (Chevaliez dan Pawlotsky, 2006; Lemon et al., 2007).
commit to user
6
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
Gambar 1. Struktur Genom Virus Hepatitis C
(Lemon et al., 2007)
Sesuai dengan susunan fungsionalnya, protein C membentuk
nukleokapsid virus yang membungkus materi genetik virus hepatitis C. E1
dan E2 berfungsi sebagai envelope yang dibutuhkan untuk perlekatan dan
tempat masuk virus, sementara protein p7 bertindak sebagai calsium ion
channel. Protein NS2 dikenal sebagai autoprotease di daerah NS2–3. Protein
NS3 memiliki beberapa fungsi antara lain sebagai komponen protease NS2–
3, NS3–4A dan NTPase (helikase). Protein NS4A bertindak sebagai
kofaktor proteinase NS3-4A. Protein NS4B memiliki fungsi menyediakan
daerah perlekatan membran untuk kompleks replikasi virus dan memodulasi
aktivitas RNA-dependent RNA-polymerase (RdRP) dari protein NS5B.
Protein NS5B memiliki aktivitas polimerase RdRP yang penting kaitannya
dalam replikasi virus hepatitis C (Sharma, 2010).
commit to user
7
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
B. Gen NS4B
Gen penyandi protein non-struktural 4B (NS4B) memiliki berat
molekul sebesar 27 kDa dan merupakan penyandi protein yang sangat
hidrofobik (Aligo et al., 2009; Gouttenoire et al., 2010). Secara topologis,
NS4B terdiri dari tiga bagian yakni C-terminal, tengah, dan N-terminal.
Bagian C-terminal dan N-terminal diyakini terorientasi mengarah pada
bagian sitosol sementara bagian tengah berada di dalam membran retikulum
endoplasma (ER) dan memiliki empat segmen transmembran (Gouttenoire
et al. 2009b, 2010). Secara struktural protein NS4B terbagi menjadi
beberapa domain yakni N-Terminal Domain (NTD) yang berada di daerah
aa 1-69, Transmembran Domain (TMD) yang berada di daerah aa 70-190
dan C-Terminal Domain (CTD) yang berada di daerah aa 191-261
(Gouttenoire et al., 2010). Masing-masing domain memiliki struktur
sekunder dan fungsi spesifik (Lundin et al., 2003).
Gambar 2. Gambaran Skematis Topologi Protein NS4B dalam
Membran Retikulum Endoplasma
commit to user
(Lemon et al., 2010)
8
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
Fungsi spesifik protein NS4B sejauh ini belum diketahui, namun
beberapa penelitian mengasumsikan bahwa protein NS4B memiliki fungsi
penting dalam mediasi aktivitas virus, antara lain: membentuk kompleks
replikasi HCV yang dinamakan dengan membranous web; bertanggung
jawab dalam modulasi fungsi protein NS5B sebagai RNA-dependent RNApolymerase dan berbagai jalur transduksi sinyal sel inang; kemungkinan
berpengaruh dalam proses karsinogenesis; dan lain sebagainya (Gouttenoire
et al., 2010).
NS4B memiliki kemampuan untuk berinteraksi dengan protein HCV
yang lain. Kemampuan tersebut berhubungan dengan fungsi NS4B yang
telah
dipostulatkan
yakni
kemampuan
dalam
membentuk
struktur
membranous web. Hingga kini struktur formasi membranous web tersebut
dipercaya sebagai tempat replikasi RNA HCV. NS4B sendiri merupakan
protein integral yang terdapat dalam membran retikulum endoplasma.
Dalam visualisasi melalui mikroskop elektron, gambaran fusi dari tempat
replikasi HCV berbentuk dot like pattern dan gambaran tersebut terintegrasi
dalam membran retikulum endoplasma sehingga terlihat seperti jejaring
(web). Oleh karena itu, perubahan membran retikulum endoplasma yang
sedemikian rupa dinamakan dengan membranous web (Gouttenoire et al.,
2010).
Mekanisme yang mendasari pembentukan membranous web hingga
kini belum diketahui namun diduga struktur sekunder amphiphatic helix
yang terdapat pada N-terminal maupun C-terminal serta keempat segmen
commit to user
perpustakaan.uns.ac.id
9
digilib.uns.ac.id
transmembran yang terdapat di bagian tengah memiliki peranan yang
signifikan dalam proses pembentukan kompleks replikasi tersebut (Aligo et
al., 2009; Lemon et al., 2010; Gouttenoire et al., 2010).
. Salah satu manifestasi adanya pembentukan kompleks replikasi oleh
protein NS4B adalah terjadinya respons stres pada membran ER. Respons
stres tersebut mengakifkan jalur transduksi sinyal inang yang pada akhirnya
memperparah terjadinya stres pada membran ER. Respon berlebihan pada
membran ER yang disebut dengan EOR (ER overload response)
menyebabkan pelepasan ion kalsium (Ca2+) dari ER ke dalam sitosol.
Perubahan konsentrasi ion Ca2+ di dalam sitosol direspons oleh mitokondria
dengan menangkap ion tersebut sehingga menstimulasi pembentukan
Reactive Oxygen Species (ROS). ROS adalah oksidan potensial penyebab
kanker melalui mekanisme kerusakan oksidatif pada tingkat DNA sehingga
menyebabkan mutagenesis. Penimbunan reaksi mutasi pada sel hepar dapat
menyebabkan keadaan hepatocellular carcinoma (HCC) (Li et al., 2009)
Peranan protein NS4B dalam proses replikasi virus salah satunya
adalah kemampuan protein tersebut dalam memodulasi aktivitas protein
NS5B. Diketahui protein NS5B memiliki aktivitas polimerase yang penting
kaitannya dalam replikasi HCV. Selain NS4B, NS3 juga ditemukan
memiliki fungsi modulasi yang bekerja secara bersamaan dengan NS4B,
namun dalam jalur yang berbeda. NS3 memiliki fungsi helikase yang
memfasilitasi aktivitas NS5B sebagai protein polimerase (Lemon et al.,
2007). Fungsi NS3 tersebut diperkirakan bekerja berlawanan dengan NS4B,
commit to user
10
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
sehingga dapat dikatakan NS4B merupakan regulator negatif dari aktivitas
NS5B (Sklan dan Glen, 2006; Murayama et al., 2010).
C.
Peta Plasmid pETBlue-1
pETBlue-1 merupakan salah satu vektor plasmid ekspresor E. coli
yang dikembangkan oleh Novagen. pETBlue-1 merupakan plasmid sirkuler
yang memiliki panjang 3476 pasang basa. Penomoran sekuens plasmid
pETBlue-1 dimulai dari basa pertama dari sekuens promoter T7. Pada
pETBlue-1 terdapat multiple cloning region di daerah 267-297 diantaranya
oleh enzim EcoR V (278), EcoR I (282) Ava I (291), Sma I (293), dan Srf I
(293). Tempat kloning blunt-end pETBlue-1 tepat berada di belakang daerah
pemotongan enzim EcoR V (Backer et al., 2003; Gaynutdinov et al., 2003).
commit to user
11
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
Gambar 3. Peta dan Sekuens Vektor Plasmid pETBlue-1
(Backer et al., 2003; Gaynutdinov et al., 2003)
commit to user
12
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Penelitian ini bersifat eksploratif analitik.
B. Lokasi Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran
Universitas Sebelas Maret.
C. Subjek Penelitian
Isolat yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat HCV 1a
09IDSKAC-20 hasil penelitian epidemiologi molekuler yang dilakukan
oleh Prasetyo et al. (dalam proses publikasi).
D. Desain penelitian
Pembuatan
primer
Purifikasi produk
PCR
Isolasi RNA
Ligasi dengan plasmid
ekspresor
Isolasi plasmid
Sekuensing
Sintesis
cDNA
Transformasi ke sel
kompeten E. coli
Kloning gen
dengan PCR
Kultur sel E. coli
commit to user
Analisis molekuler
perpustakaan.uns.ac.id
13
digilib.uns.ac.id
E. Instrumentasi Penelitian
1. Alat penelitian
a. centrifuge (Eppendorf, Hamburg, Jerman)
b. thermocycler (Eppendorf, Hamburg, Jerman)
c. micropipet (P1000, P200, P10) (Gilson, Wisconsin, USA)
d. vortex (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)
e. incubator (Memmert, Schwabach, Jerman)
f. bacterial incubator (Memmert, Schwabach, Jerman)
g. incubator shaker (Heidolph, Schwabach, Jerman)
h. waterbath (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)
i. microwave (Panasonic, Osaka, Jepang)
j. deepfreezer (New Brunswick Scientific, New Jersey, USA )
k. tube rack
l. autoclave (Hirayama, Saitama, Jepang)
m. refrigerator (Sharp, Osaka, Jepang)
n. class II safety cabinet (ESCO, Oregon, USA)
o. digital scale (Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland)
p. spreader
2. Bahan penelitian
a.
aliquot sampel 09IDSKAC-20
b.
filter tips (10 ml, 200 ml dan 1000 ml)
c.
microcentrifuge tube
d.
PCR tube dan PCR cap
commit to user
14
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
e.
polypropylene (PP) tube 15 ml, 50 ml
f.
disposable petri Ø 10 cm
g.
glove
h.
masker
i.
tissue
j.
bufer Tris-EDTA (TE)
k.
Media Luria Bertani (LB) agar dan cair
l.
Glukosa 50 mM
m. Tris-HCl pH 8.0, 25 mM
n.
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 10 mM
o.
NaOH 0,2 N
p.
SDS 1 %
q.
CH3COOH 5 M
r.
CH3COOK 5 M
s.
phenol-chloroform-isoamylalcohol (25:24:1)
t.
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)
u.
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)
v.
karbenisilin
w. isopropanol
x.
etanol 70 %
y.
RNAse free away
z.
kit Trizol LS (Invitrogen, California, USA)
commit to user
15
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
aa. kit SuperScriptTM IIIFirst-StrandSynthesis System for RT-PCR
(Invitrogen, California, USA)
bb. kit AccuPrimeTM Pfx DNA polymerase (Invitrogen, California,
USA)
cc. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden, Jerman).
dd. pETBlue-1 Perfectly Blunt Cloning Kit (Novagen, Darmstadt,
Jerman)
F. Cara Kerja
1. Desain primer
Desain primer forward dan reverse NS4B yang digunakan
dalam sintesis cDNA menggunakan program FastPCR (Kalendar et al,
2009).
2. Isolasi RNA
Aliquot sampel 09DSKAC-20 dipurifikasi dengan menggunakan
reagen TrizolLS (Invitrogen) dengan protokol sebagai berikut:
a. Menambahkan 0,75 ml reagen Trizol LS ke masing-masing 0,25 ml
sampel, kemudian menginkubasi selama 5 menit dalam suhu
kamar.
b. Menambahkan 0,2 ml chloroform per 0,75 ml reagen Trizol LS.
c. Menutup tube dengan sempurna dan bolak-balik selama kurang
lebih 15 detik, kemudian menginkubasikan selama 2 – 15 menit
dalam suhu kamar. Setelah itu, dilakukan pemusingan dengan
commit to user
16
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
kecepatan tidak lebih dari 12.000 g selama 15 menit pada suhu 4
O
C.
d. Memindahkan fase aqueous ke dalam tube steril, kemudian
mempresipitasi RNA dengan penambahan 0,5 ml isopropyl alcohol
per 0,75 ml reagen Trizol LS yang digunakan.
e. Menginkubasi dalam suhu kamar selama 10 menit kemudian
memusingkan dengan kecepatan 12.000 g selama 10 menit dalam
suhu 4 OC.
f. Membuang supernatan dengan hati-hati, kemudian membilas pelet
RNA dengan menggunakan etanol 70 % dingin sebanyak 1 ml per
0,75 ml reagen Trizol LS yang digunakan.
g. Mencampur
sampel
dengan
vortex,
kemudian
melakukan
pemusingan dengan kecepatan tidak lebih dari 7.500 g selama 5
menit pada suhu 4 OC.
h. Membuang supernatan dengan hati-hati, lalu mengeringkan dengan
metode air dry.
i. Meresuspensi pelet RNA dengan RNase free water atau larutan
0,5 % SDS dan campurkan dengan perlahan dengan pipetting.
j. Menginkubasi selama 10 menit pada suhu 55 – 60 OC.
commit to user
17
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
3. Sintesis cDNA
Proses sintesis DNA menggunakan SuperScriptTM III FirstStrand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) dengan protokol
sebagai berikut:
a. masing-masing reagen di-spin down sebelum digunakan.
b. Menambahkan komponen berikut ke dalam PCR tube:
Komponen
Jumlah
hingga 5 mg total RNA
0,04 ml
primer
1 ml
dNTP mix 10 mM
1 ml
DEPC-treated water
hingga 10 ml
c. Menginkubasi dalam suhu 65
O
C selama 5 menit, kemudian
menempatkan ke dalam es sekurang-kurangnya selama 1 menit.
d. Menyiapkan cDNA Synthesis Mix berikut ini ke dalam PCR tube
yang berbeda:
Komponen
Jumlah
10X RT buffer
2 ml
MgCl2 25 mM
4 ml
DTT 0,1 M
2 ml
RNaseOUTTM (40 U/ml)
1 ml
SuperScriptTM III RT (200 U/ml)
1 ml
e. Menambahkan 10 ml cDNA Synthesis Mix ke dalam masing-masing
PCR tube yang mengandung RNA, kemudian melakukan pipetting
dengan perlahan untuk mencampur rekasi.
commit to user
18
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
f. Menginkubasi pada suhu 25
O
C selama 10 menit, setelah itu
dilanjutkan dengan suhu 50 OC selama 50 menit.
g. Menghentikan reaksi pada suhu 85 OC selama 5 menit, kemudian
mendinginkan ke dalam bak berisi es.
h. Menambahkan 1 ml RNase H pada tiap-tiap tube dan menginkubasi
pada suhu 37 OC selama 20 menit.
i. Hasil sintesis cDNA disimpan dalam suhu – 20 OC.
4. Kloning gen NS4B dengan PCR
Proses kloning DNA menggunakan kit AccuPrimeTM Pfx DNA
polymerase (Invitrogen) dengan protokol sebagai berikut:
a. Menambahkan komponen berikut ke dalam PCR tube dalam suhu
ruangan:
Komponen
Jumlah
AccuPrimeTM Pfx Reaction Mix
5 ml
Primer mix (10 mM)
15 ml
Template DNA (44ng)
1 ml
AccuprimeTM Pfx DNA polymerase
1 ml
ddH2O
hingga 50 ml
b. Kemudian memasukkan PCR tube tersebut ke dalam thermocycler.
c. Melakukan proses denaturasi pada suhu 95 OC selama 2 menit,
kemudian melakukan 16 siklus PCR sebagai berikut:
Denaturasi: 95 OC selama 15 detik
Annealing: 55 – 64 OC selama 30 detik
Ekstensi: 68 OC selama 1 menit per kilobasa
commit to user
19
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
d. Mengatur suhu 4
O
C setelah siklus selesai. Produk PCR dapat
disimpan pada suhu – 20 OC hingga digunakan.
5. Purifikasi produk PCR
Produk reaksi PCR yang dihasilkan dipurifikasi kembali
sehingga produk PCR terbebas dari sisa reaksi PCR. Proses purifikasi
menggunakan QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) dengan
protokol sebagai berikut:
a. Menambahkan 5 volume bufer PB dengan 1 volume produk PCR,
kemudian mencampurkan dengan pipetting.
b. Menempatkan QIAquick spin column pada collection tube 2 ml.
c. Memindah produk PCR ke dalam QIAquick spin column dan
melakukan pemusingan selama 30 – 60 detik pada kecepatan
13.000 rpm.
d. Membuang cairan yang terdapat dalam collection tube dan
menempatkan kembali collection tube ke QIAquick spin column.
e. Menambahkan 0,75 ml bufer PE ke dalam QIA quick spin collumn
dan melakukan pemusingan selama 30 – 60 detik pada kecepatan
13.000 rpm.
f. Membuang cairan yang yang terdapat dalam collection tube dan
menempatkan kembali collection tube ke QIAquick spin collumn.
g. Melakukan pemusingan kembali selama 1 menit pada kecepatan
13.000 rpm kemudian membuang collection tube.
commit to user
20
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
h. Menempatkan QIAquick spin column pada microcentrifuge tube 1,5
ml steril.
i. Untuk melarutkan DNA, tambahkan 50 ml bufer EB (TrisCl, pH
8.5, 10 mM) ke dalam QIAquick spin column dan melakukan
pemusingan selama 1 menit pada kecepatan 13.000 rpm.
j. DNA telah terpurifikasi dan siap untuk dielektroforesis.
6. Ligasi cDNA dengan plasmid ekspresor
Produk PCR diligasi dengan pETBlue-1 blunt vector (Novagen)
sehingga membentuk DNA rekombinan dengan protokol sebagai
berikut:
a. Menambahkan ke dalam produk PCR yang telah terpurifikasi 1 ml
blunt vector dan 1 ml T4 DNA Ligase, kemudian mencampur
dengan pipetting secara perlahan dan hati-hati.
b. Menginkubasi pada suhu 22 OC selama 15 menit.
7. Transformasi DNA rekombinan ke sel kompeten
DNA rekombinan kemudian ditransformasikan ke dalam sel
kompeten E. coli (NovaBlue competent cells) dengan metode heat
shock:
a. Memindahkan tube sel kompeten E. coli dari freezer sesegera
mungkin ke dalam es dan memastikan seluruh tube masuk ke dalam
es kecuali tutup tube. Biarkan sel tersebut mencair di dalam es
selama 2 – 5 menit.
commit to user
21
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
b. Setelah sel mencair, tapping 1 – 2 kali secara manual dengan lembut
untuk meresuspensi sel kompeten.
c. Meletakkan beberapa microcentrifuge tube 1,5 ml yang dibutuhkan
ke dalam es, kemudian membuat aliquot sel sebanyak 20 ml pada
masing-masing tube.
d. Melakukan tapping dengan lembut untuk mencampurkan dan
mengembalikan tube ke dalam es.
e. Menambahkan 1 ml hasil reaksi ligasi atau plasmid DNA yang telah
dipurifikasi secara langsung ke dalam sel kompeten, kemudian
melakukan tapping secara perlahan dan mengembalikan tube ke
dalam es. Pastikan seluruh bagian tube tertutupi oleh es kecuali pada
bagian tutup tube.
f. Menginkubasi tube tersebut di dalam es selama 5 menit.
g. Memanaskan tube secara cepat di dalam waterbath dengan suhu
42 OC selama 30 detik tanpa dikocok.
h. Kembali menempatkan tube di es selama 2 menit.
i. Menambahkan 250 ml medium SOC suhu kamar ke dalam setiap
tube. Pertahankan tube di dalam es hingga seluruhnya mendapatkan
SOC.
8. Kultur Sel
Kultur sel dilakukan dalam media LB agar (yang mengandung
50 mg/ml karbenisilin, 70 µg/ml X-gal dan 80 µM IPTG) untuk
commit to user
22
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
menyeleksi sel kompeten yang memiliki insert DNA rekombinan,
kemudian dilanjutkan dengan kultur dalam media LB cair:
a. Mempersiapkan beberapa plate media agar LB.
b. Menempatkan 1, 2, 5, 10, 50, 250 ml sel kompeten pada setiap plate.
c. Menggunakan spreader steril untuk meratakan sel kompeten hingga
terdistribusi secara merata di seluruh permukaan plate. Lalu
menempatkan plate menghadap ke atas di dalam suhu ruangan
selama 15 menit.
d. Menginkubasi plate di dalam inkubator dengan cover plate
menghadap ke bawah dan mengatur suhu temperatur inkubator 37
O
C dalam waktu 15–18 jam.
e. Mengambil koloni berwarna putih dan langsung menempatkan ke
dalam media LB cair 2 ml pada PP tube 15 ml.
f. Menginkubasi pada suhu 37 OC dalam waktu 15–18 jam.
9. Isolasi plasmid
Isolasi plasmid menggunakan teknik minipreparasi metode
Chen-Okayama yang telah dimodifikasi oleh Prasetyo (2008).
a. Memindahkan sel kompeten dalam media cair tersebut ke
microcentrifuge tube (1,5 ml), melakukan pemusingan 14.000 rpm
selama 1 menit, lalu membuang supernatan.
b. Menambahkan 0,1 ml larutan I (glukosa 50 mM, Tris-HCl pH 8.0
25 mM, EDTA 10 mM), kemudian mencampur dengan vortex
selama 1 menit sampai sel kompeten teresuspensi sempurna.
commit to user
23
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
c. Menambahkan 0,2 ml larutan II (NaOH 0,2 N, SDS 1 %), tanpa
melakukan vortex.
d. Menambahkan 0,15 ml larutan III (2 bagian CH3COOH 5 M + 3
bagian CH3COOK 5 M), kemudian mencampur dengan vortex
selama 1 menit.
e. Menambahkan 0,1 ml phenol-chloroform-isoamylalcohol (25:24:1),
kemudian mencampur dengan vortex selama 1 menit.
f. Melakukan pemusingan dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3
menit hingga didapatkan dua lapisan cairan.
g. Memindah 0,42 ml cairan di lapisan atas (warna jernih) ke
microcentrifuge tube yang baru. Sisa cairan jernih dan lapisan
dibawahnya dapat dibuang.
h. Menambahkan 0,5 ml isopropanol ke dalam 0,42 ml cairan di atas,
kemudian
mencampur
dengan
cara
membolak-balikkan
microcentrifuge tube tersebut.
i. Melakukan pemusingan dengan kecepatan 14.000 rpm selama 10
menit, kemudian membuang supernatan.
j. Mencuci dengan etanol 70 % dingin.
k. Melakukan pemusingan dengan kecepatan 14.000 rpm selama 5
menit, kemudian membuang supernatan.
l. Mengeringkan dengan alat vakum atau membalik microcentrifuge
tube tersebut sampai semua etanol terbuang dan menguap.
commit to user
24
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
m. Melarutkan DNA dengan 0,1 ml TE (Tris-HCl pH 7.5 10 mM,
EDTA 1 mM) yang sudah ditambahkan RNaseA, kemudian
memasukkan ke inkubator dengan suhu 37 OC selama 30 menit.
n. Plasmid DNA siap dianalisis dengan menggunakan enzim restriksi
dan atau sekuensing.
10. Sekuensing
Sekuensing plasmid menggunakan primer pETBlue UP primer
dan pETBlue DOWN primer (Novagen).
G. Analisis Data
Data sekuens yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan
aplikasi MEGA4 (Tamura et al., 2007) dan ClustalW (Thompson et al.,
1994).
commit to user
25
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
BAB IV
HASIL PENELITIAN
Isolat yang digunakan dalam penelitian kloning ini adalah isolat hasil
penelitian epidemiologi blood borne virus yang dilakukan oleh Prasetyo et al.
(dalam proses publikasi). Sebanyak 513 sampel terkumpul dalam penelitian
tersebut dan 140 sampel diantaranya memiliki anti-HCV (+). Dari 140 sampel
dengan anti-HCV (+) kemudian dilakukan deteksi molekuler melalui RTPCR untuk mengamplifikasi sebagian daerah E1-E2 dan NS5B dengan
menggunakan teknik PCR nested. Produk PCR tersebut kemudian
disekuensing dan didapatkan hasil subtipe isolat terbanyak adalah 1a. Oleh
karena itu, kloning keseluruhan genom dimulai dari subtipe 1a. Pemilihan
kandidat isolat kloning dilakukan dengan skreening isolat subtipe 1a yang
memiliki kriteria tidak terdapat koinfeksi dengan virus lain, titer RNA HCV
lebih dari 105 kopi/ml, hasil sekuensing isolat tersebut ‘relatif bersih’ dan
tidak terdapat beda interpretasi hasil sekuensing di antara regio E1-E2 dengan
NS5B. Sesuai dengan kriteria tersebut didapatkan kandidat isolat terbaik
adalah isolat 09IDSKAC-20.
A. Desain Primer
Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi regio spesifik NS4B
didesain dengan program FastPCR. Desain primer dimulai dengan
mengumpulkan seluruh data complete coding sequence HCV 1a untuk gen
to userSeluruh sekuens tersebut diunduh
pengkode protein NS4B daricommit
GenBank.
26
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
dari GenBank dengan keywords “Hepatitis C virus 1a complete coding
sequence”. Melalui keywords tersebut didapatkan 395 sekuens. Kemudian
gen NS4B secara spesifik dilakukan penyejajaran dengan program ClustalW.
Hasil penyejajaran tersebut lebih dispesifikkan pada 30 nukleotida awal dan
30 nukleotida akhir untuk diketahui konsensus nukleotida awal dan akhir
(lampiran 1). Konsensus tersebut kemudian dimasukkan ke dalam program
FastPCR untuk dianalisis.
Hasil analisis konsensus FastPCR didapatkan pasangan primer terbaik
yakni primer forward NS4B HCV 1a 5’-ATG TCB CAR CAC YTA CCR
TAC ATC G.-3’ dan primer reverse NS4B HCV 1a 5’-TTA GCA CAH GGR
GTR GHR BWM TCC G-3’. Pada primer tersebut ditambahkan initial codon
pada primer forward NS4B HCV 1a dan stop codon pada primer reverse
NS4B HCV 1a agar klon gen NS4B dapat diekspresikan oleh plasmid vektor
pETBlue-1. Dari analisis program FastPCR (lampiran 2), tidak didapatkan
adanya primer dimer yang berarti tidak terdapat daerah yang saling
berkomplementari pada sepasang primer tersebut di atas. Daerah yang saling
berkomplementari
sangat
mengganggu
proses
annealing
dan
dapat
menurunkan efisiensi PCR.
B. Purifikasi RNA HCV
RNA isolat 09IDSKAC-20 dipurifikasi kembali dari aliquot plasma
menggunakan kit TrizolLS® (Invitrogen). Proses isolasi RNA dilakukan
sesuai
dengan
protokol.
Hasil
analisis
spektrofotometri
didapatkan
to user sebesar 76 ng/µl dalam volume
konsentrasi RNA HCV yangcommit
terpurifikasi
perpustakaan.uns.ac.id
27
digilib.uns.ac.id
total 50 µl. RNA HCV tersebut memiliki nilai absorbansi 260/280 nm sebesar
1,91 yang berarti hasil purifikasi RNA sudah baik dari segi kualitas maupun
kuantitas dan dapat dilakukan manipulasi molekuler selanjutnya.
C. Sintesis cDNA HCV
Setelah RNA HCV 09IDSKAC-20 terpurifikasi, cDNA isolat
09IDSKAC-20 disintesis menggunakan kit SuperScriptsTM III First-Strand
Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) sesuai protokol. Hasil analisis
spektrofotometri didapatkan konsentrasi cDNA HCV 09IDSKAC-20 sebesar
44 ng/µl dalam volume total 20 µl. Produk RT-PCR tersebut memiliki nilai
absorbansi 260/280 nm sebesar 1,87. Interpretasi hasil spektrofotometri
tersebut menunjukkan bahwa produk RT-PCR tersebut memiliki kualitas dan
kuantitas yang baik.
D. Kloning Gen NS4B dan Purifikasi Produk PCR
Produk RT-PCR kemudian diamplifikasi lebih lanjut menggunakan kit
AccuPrimeTM Pfx DNA polymerase (Invitrogen). AccuPrimeTM Pfx DNA
polymerase digunakan dengan tujuan agar produk PCR memiliki ujung
tumpul, oleh karena produk PCR tersebut akan diligasikan dengan vektor
plasmid pETBlue-1 yang menghendaki insert berujung tumpul. Primer yang
digunakan dalam kloning gen melalui proses PCR tersebut adalah primer
forward dan reverse HCV 1a hasil analisis FastPCR. Kondisi PCR yang telah
dianalisis dengan FastPCR telah diuji secara empirik. PCR dilakukan dengan
kondisi paling optimum pada:
commit to user
28
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
denaturasi awal 95 OC selama 2 menit
denaturasi
95 OC selama 15 detik
annealing
55 OC selama 30 detik
elongasi
68 OC selama 10 menit
Proses PCR tersebut dilakukan selama 16 siklus dan pada akhir siklus
ditambahkan proses elongasi akhir pada 72 OC selama 10 menit.
Produk PCR kemudian dipurifikasi kembali dengan menggunakan
QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) sesuai dengan protokol kit.
Purifikasi tersebut bertujuan untuk membersihkan produk PCR dari sisa
reagen PCR. Hasil analisis spektrofotometri didapatkan produk PCR yang
terpurifikasi tersebut memiliki konsentrasi sebesar 113 pg/µl dalam volume
total 20 µl. Nilai absorbansi 260/280 nm produk PCR yang telah terpurifikasi
adalah 1,83. Hal tersebut menunjukkan bahwa produk PCR telah terpurifikasi
dengan baik dari segi kualitas maupun kuantitasnya.
E. Ligasi dengan Plasmid Vektor pETBlue-1 dan Transformasi ke Sel
Kompeten E. coli
Produk PCR yang telah terpurifikasi kemudian diligasikan ke dalam
plasmid vektor pETBlue-1 (Novagen) dengan menggunakan enzim T4 ligase.
Setelah plasmid rekombinan pETBlue1-HCV1a NS4B terbentuk, plasmid
yang berbentuk sirkuler tersebut kemudian ditransformasikan ke dalam sel
kompeten E. coli (Novagen) dengan metode heat shock.
Bakteri hasil transfeksi kemudian dikultur di dalam media LB agar
commit to user
yang mengandung karbenisilin, X-Gal, dan IPTG. Kultur dalam media padat
perpustakaan.uns.ac.id
29
digilib.uns.ac.id
difungsikan untuk seleksi sel kompeten yang mengandung plasmid
rekombinan hasil transfeksi. Sel kompeten yang mengandung plasmid
rekombinan pETBlue1-HCV1a NS4B akan berwarna putih. Sel kompeten
yang mengandung plasmid rekombinan kemudian dikultur kembali dalam
media LB cair selama 18 jam.
F. Isolasi Plasmid
Setelah perbanyakan plasmid pETBlue1-HCV1a NS4B secara in vivo,
plasmid tersebut diisolasi kembali dengan metode Chen-Okayama yang telah
dimodifikasi oleh Prasetyo (2008). Hasil isolasi plasmid kemudian dianalisis
dengan spektrofotometri dan dihasilkan nilai absorbansi 260/280 nm sebesar
1,85 serta konsentrasi sebesar 94 ng/µl dalam volume total kurang lebih 100
µl. Hal ini menunjukkan bahwa plasmid DNA berhasil diekstrak dengan
kuantitas dan kualitas yang cukup baik.
G. Sekuensing dan Analisis Molekuler
Dalam usaha mendapatkan informasi molekuler dari plasmid yang
telah terpurifikasi, maka dilakukan proses sekuensing. Sekuensing plasmid
pETBlue1-HCV1a NS4B dilakukan oleh FirstBase (Singapura). Hasil
sekuensing tersebut kemudian dianalisis menggunakan program CLC
Sequence Viewer dan MEGA4. Sekuens nukleotida dan asam amino isolat
09IDSKAC-20 terdapat pada lampiran 3-5. Sekuens isolat tersebut
kemudian disejajarkan kembali dengan seluruh sekuens HCV 1a NS4B yang
telah dilaporkan di GenBank menggunakan ClustalW (lampiran 6-7).
commit to user
30
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
Analisis molekuler dilakukan di dua tempat, yakni dari sekuens isolat
09IDSKAC-20 dan dari hasil penyejajaran isolat 09IDSKAC-20 dengan
seluruh sekuens HCV 1a NS4B yang telah dilaporkan di GenBank (sebanyak
395 sekuens). Beberapa area residu asam amino hasil kloning HCV 1a NS4B
kemudian diidentifikasi sesuai dengan susunan topologi dari HCV NS4B
yang telah dilaporkan sebelumnya. Lebih jauh, peneliti juga melakukan
analisis motif dan mutasi titik pada susunan residu asam amino HCV 1a
NS4B yang diketahui terkonservasi dengan baik.
commit to user
31
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
BAB V
PEMBAHASAN
A. Daerah N-Terminal Domain (NTD) NS4B HCV
N-Terminal Domain (NTD) diketahui sebagai area yang memiliki
variasi paling tinggi di antara ketiga domain yang terdapat pada HCV NS4B.
NTD memiliki dua struktur sekunder yakni struktur amphiphatic α-helix 1 dan
2 (lampiran 8). Penelitian Gouttenoire et al. (2010) melaporkan bahwa NTD
amphiphatic α-helix 2 merupakan faktor penentu utama dalam proses
oligomerisasi. Area NTD amphiphatic α-helix 2 diketahui terkonservasi secara
baik sehingga apabila terjadi mutasi pada daerah tersebut, fungsi oligomerisasi
pada amphiphatic α-helix 2 akan terhambat. Gangguan fungsi oligomerisasi
ini akan menghambat pembentukan membranous web sebagai tempat replikasi
dari RNA HCV. Perubahan residu amino aromatik pada sisi amphiphatic αhelix 2 NTD (Trp43, Phe49, Trp50, Trp55, Phe57 dan Tyr63) yang menjadi asam
amino Alanine (A) dapat menghentikan proses pembentukan membran dan
mengganggu pembentukan kompleks replikasi fungsional HCV (Gouttenoire
et al., 2009a). Dalam sekuens isolat 09IDSKAC-20 tidak didapatkan mutasi
Alanine pada aa aromatik amphiphatic α-helix 2 NTD. Oleh karena itu, proses
pembentukan membranous web yang salah satunya diinduksi amphiphatic αhelix 2 NTD pada isolat 09IDSKAC-20 tidak terganggu. Hasil penyejajaran
seluruh isolat NS4B HCV 1a yang telah dilaporkan di GenBank didapatkan
Tyr43, Tyr50, Tyr55, Phe57 dan Tyr63 terkonservasi secara sempurna sedangkan
commit to user
perpustakaan.uns.ac.id
32
digilib.uns.ac.id
pada posisi aa 49 dapat terjadi variasi Phenylalanine atau atau Leucine. Hal
tersebut menunjukkan bahwa seluruh isolat NS4B HCV 1a yang telah
dilaporkan di GenBank kemungkinan memiliki kemampuan fungsional
integrasi membran yang memadai.
Dalam struktur amphiphatic α-helix NTD terdsapat suatu motif yang
diduga terkonservasi sempurna di seluruh genotipe HCV, yakni N-Terminal
basic Leucine Zipper (bZIP). Struktur tersebut dibentuk oleh formasi α-helix
di dalam struktur coiled-coil. Pada aa 22-49 ditemukan adanya daerah
pengulangan setiap tujuh residu selama empat kali. Residu tersebut
dikarakteristikkan sebagai motif bZIP. Tujuh residu tersebut kemudian diberi
identitas ‘a’ hingga ‘g’. Fungsi dari motif bZIP masih belum dimengerti
secara keseluruhan, namun diduga motif bZIP memiliki peran penting dalam
proses interaksi antar protein yang terdapat dalam HCV. Model struktural
bZIP yang dipublikasikan oleh Welsch et al. (2007) menunjukkan adanya inti
hidrofobik Leu yang terkonservasi sempurna di aa 25 dan 46 (lampiran 9).
Sementara itu, residu pada posisi a dan d bersifat non-polar. Posisi a dan d
tersebut diketahui berfungsi membantu pembentukan inti struktur hidrofobik
bZIP.
Pada isolat 09IDSKAC-20 didapatkan inti fungsional motif bZIP adalah
Leu25 dan Leu46. Oleh karena itu, inti fungsional bZIP pada isolat tersebut
baik. Sementara pada hasil penyejajaran seluruh sekuens isolat HCV 1a NS4B
yang telah dilaporkan di GenBank didapatkan adanya kemungkinan variasi
pada inti fungsional bZIP tersebut, yakni L25M dan L46(I/F/V). Hal tersebut
commit to user
33
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
menarik, mengingat inti struktural bZIP merupakan suatu titik aa yang secara
teoritis seharusnya terkonservasi sempurna sesuai dengan peran pentingnya
dalam proses interaksi antar protein HCV. Perlu adanya pembuktian
laboratorium lebih lanjut mengenai implikasi yang ditimbulkan dari variasi
tersebut.
Dalam isolat HCV 09IDSKAC-20, posisi a dan d pada motif bZIP
memiliki residu a1 Leu22, d1 Leu25, a2 Ser29, d2 Ala32, a3 Ala36, d3 Val39, a4
Trp43, dan d4 Leu46 (pola asam amino motif bZIP pada isolat 09IDSKAC-20
terdapat dalam lampiran 10). Keseluruhan residu a dan d pada motif tersebut
merupakan asam amino non-polar, kecuali pada susunan a2 didapatkan residu
polar yakni Ser29 (sifat polaritas beserta tata nama asam amino terdapat dalam
lampiran 11). Perubahan salah satu asam amino yang seharusnya non-polar
menjadi polar tersebut belum diketahui pengaruhnya dalam susunan struktural
maupun fungsional dari motif bZIP.
Salah satu asam amino penting yang terdapat dalam motif bZIP adalah
Gln26. Mutasi pada Gln26 dilaporkan dapat mempengaruhi fungsi NS4B secara
keseluruhan dan berkontribusi terhadap resistensi interferon-α (Namba et al.,
2004). Tidak terdapat perubahan pada Gln26 pada sekuens isolat 09IDSKAC20 yang berarti isolat tersebut masih berespons terhadap interferon-α dan tidak
memiliki perubahan fungsional protein NS4B. Namun pada hasil penyejajaran
seluruh isolat NS4B HCV 1a yang diperoleh dari GenBank, didapatkan
kemungkinan variasi berupa Q26(H/R). Mutasi pada beberapa isolat HCV 1a
commit to user
perpustakaan.uns.ac.id
34
digilib.uns.ac.id
tersebut kemungkinan memiliki konsekuensi adanya resistensi terhadap
respons pemberian interferon-α.
B. Daerah Transmembrane Domain (TMD) NS4B HCV
Kemampuan protein NS4B dalam membentuk struktur membranous
web didukung oleh segmen TMD. Hingga kini diyakini terdapat empat – lima
segmen transmembran (TM) dalam protein NS4B (Welsch et al., 2007).
Empat segmen TM tersebut terletak di aa 72-92, 101-121, 136-156 dan 172197 (Gouttenoire et al., 2010). Segmen kelima, Nucleotide-binding Motif
(NBM), terdapat di daerah antara segmen TM kedua dan ketiga, yakni pada
aa 129-135 dengan konsensus motif GXXXXGK. NBM tersebut diketahui
berfungsi mengikat dan menghidrolisis GTP dan terkonservasi sempurna
pada semua isolat HCV. Gangguan atau mutasi NBM menyebabkan
kerusakan fungsi pengikatan dan hidrolisis GTP sehingga pada akhirnya
menghambat proses replikasi RNA HCV (Einav et al., 2004). Einav et al.
(2004) memperkenalkan GSIGLGK sebagai konsensus NBM NS4B pada
HCV. Sementara itu, sekuens NBM pada isolat 09IDSKAC-20 memiliki
susunan motif GSVGLGK. Susunan G dan GK pada awal dan akhir motif
NBM tidak menunjukkan adanya mutasi sehingga fungsi dari NBM pada
isolat HCV tersebut tidak berubah. Namun perbedaan terhadap konsensus
NBM NS4B HCV pada I131V belum diketahui implikasinya terhadap
perubahan fungsi dari NBM. Pada hasil penyejajaran seluruh isolat HCV 1a
NS4B yang telah dilaporkan di GenBank didapatkan kemungkinan variasi
commit to user
sekuens motif NBM yakni (G/S)(S/G)(V/I)(G/T)L(G/R)K
sehingga memiliki
35
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
konsensus XXXLXK. Variasi konsensus motif tersebut masih belum
diketahui implikasinya dalam fungsional NBM sehingga memerlukan
penelitian lebih lanjut.
Residu Gly129 merupakan asam amino yang selalu terkonservasi,
bahkan pada protein NS4B virus Flaviviridae yang lain. Mutasi G129V
mengganggu fungsi pengikatan GTP NBM. Mutasi ganda pada G129V dan
I131N menurunkan ekspresi NBM pada protein NS4B (Einav et al., 2004).
Pada isolat 09IDSKAC-20 didapatkan aa 129 berupa Glycine yang berarti
tidak terjadi mutasi pada residu tersebut, namun pada posisi aa 131 ditempati
oleh asam amino Valine (I131V). Sementara itu, hasil penyejajaran pada
seluruh sekuens HCV 1a NS4B menunjukkan variasi berupa G129S dan
I131V. Mutasi pada I131V belum diketahui implikasinya terhadap fungsi dari
motif NBM, mengingat aa 131 pada hampir seluruh sekuens HCV 1a NS4B
yang telah terlaporkan di GenBank ditempati oleh asam amino Valine (hanya
satu isolat yang memiliki residu Isoleucine di aa 131). Implikasi dari mutasi
tersebut memerlukan studi lebih lanjut.
Mutasi lain dalam NBM adalah K135(S/R) (Einav et al., 2004).
Perubahan pada posisi tersebut meniadakan fungsi GTPase pada NBM.
Dalam isolat 09IDSKAC-20 pada posisi aa 135 didapatkan asam amino
Lysine (K) dan pada penyejajaran seluruh sekuens HCV 1a NS4B posisi
tersebut terkonservasi sempurna dengan asam amino Lysine. Hal ini
menambah bukti pentingnya residu Lys135 pada NBM.
commit to user
perpustakaan.uns.ac.id
36
digilib.uns.ac.id
C. Daerah C-Terminal Domain (CTD) NS4B HCV
Daerah C-Terminal Domain (CTD) merupakan daerah yang sangat
terkonservasi dan berada di aa 191-261. Daerah tersebut dilaporkan memiliki
sebuah struktur amphiphatic α-helix dan dua tempat palmitoylation
(perubahan lemak). Struktur amphiphatic α-helix pada CTD berfungsi
membantu segmen TMD dalam pembentukan struktur membranous web.
Struktur sekunder amphiphatic α-helix CTD berada di residu aa 229-253.
Dalam struktur tersebut didapatkan empat asam amino Leucine (L) yang
diduga terkonservasi sempurna yakni Leu237, Leu240, Leu246 dan Leu249.
Mutasi pada asam amino Leucine tersebut menyebabkan kerusakan sifat
hidrofobik pada keseluruhan struktur amphiphatic α-helix CTD. Mutasi
penuh dari keempat Leucine menyebabkan hilangnya kemampuan NS4B
dalam membentuk membranous web (Gouttenoire et al., 2009a). Pada
sekuens isolat 09IDSKAC-20, tidak ditemukan adanya mutasi pada keempat
residu leucine di Leu237, Leu240, Leu246 dan Leu249. Hal tersebut menunjukkan
tidak ada perubahan sifat hidrofobik dari struktur sekunder amphiphatic αhelix CTD sehingga fungsi struktur tersebut tidak terganggu. Sementara pada
hasil penyejajaran seluruh sekuens HCV 1a NS4B yang telah dilaporkan di
GenBank, didapatkan data bahwa Leu237 dan Leu240 terkonservasi secara
sempurna di seluruh isolat. Namun didapatkan variasi berupa L246M dan
L249I pada hasil penyejajaran tersebut. Mutasi parsial yang terjadi dari
keempat residu Leucine tersebut kemungkinan akan berdampak pada
penurunan efisiensi struktur sekunder amphiphatic α-helix CTD karena
commit to user
37
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
kemungkinan terdapat perubahan sifat hidrofobik dari struktur sekunder
tersebut (Gouttenoire et al., 2009a).
Struktur helix (H2) CTD diketahui berhimpitan dengan struktur
amphiphatic α-helix CTD di aa 236-253. Struktur tersebut sangat penting
kaitannya dengan kemampuan replikasi HCV karena mutasi pada struktur H2
dapat merusak kemampuan RNA HCV untuk bereplikasi (Guillen et al.,
2010). Konsensus sekuens H2 yang ditemukan oleh Guillen et al. (2010) pada
HCV 1a adalah ILSSLTVTQLLRRLHQWI. Pada isolat 09IDSKAC-20
daerah aa 236-253 berupa ILSSLTVTQLLRRLHQWI. Susunan asam amino
tersebut sesuai dengan konsensus sekuens H2 HCV 1a. Namun, pada
penyejajaran
seluruh
sekuens
HCV
1a
NS4B
didapatkan
adanya
kemungkinan variasi yakni S238(T/G), S239(N/G), V242M, L246M,
R247M, L249I, Q251(D/E/S) dan I235 (L/V). Hanya Ile236, leu237, Leu240,
Thr241, Thr243, Gln244, Leu245, Arg248, His250 dan Trp252 yang terkonservasi
sempurna sehingga mungkin konsensus sekuens H2 HCV 1a NS4B
seharusnya ILXXLTXTQLXXRXHXWX berbeda hasil konsensus H2 yang
telah dilaporkan sebelumnya.
Dua asam amino yang memiliki fungsi penting dan diduga
terkonservasi sempurna di daerah CTD yakni Val233 dan Leu237 (Aligo et al.,
2009). Dua asam amino tersebut merupakan salah satu faktor penentu
pembentukan formasi membranous web. Mutasi pada kedua asam amino
tersebut dapat mengubah distribusi subselular protein NS3 dan NS5A
sehingga proses pemotongan maupun ekspresi dari protein NS4B menjadi
commit to user
perpustakaan.uns.ac.id
38
digilib.uns.ac.id
terhambat. Pada sekuens isolat 09IDSKAC-20 posisi tersebut tetap ditempati
oleh Val233 dan Leu237. Sementara pada hasil penyejajaran dengan seluruh
sekuens HCV 1a NS4B dari GenBank juga didapatkan Val233 dan Leu237
terkonservasi secara sempurna. Hal tersebut menandakan bahwa kedua residu
Val233 dan Leu237 memiliki peran yang sangat penting dalam ekspresi protein
NS4B.
Protein NS4B memiliki kemampuan memodifikasi struktur lipid yang
dinamakan dengan palmitoylation. Selain itu, NS4B juga diketahui memiliki
kemampuan polimerisasi. Struktur penentu dari proses polimerisasi ini
terdapat di daerah NTD, namun proses palmitoylation yang terdapat di CTD
juga berpengaruh secara signifikan dalam proses polimerisasi. Modifikasi
lipid dan polimerisasi merupakan dua kemampuan utama dari NS4B untuk
menginduksi struktur membran yang digunakan sebagai tempat replikasi
RNA HCV (Yu et al, 2006). Tempat palmitoylation protein NS4B terletak
pada Cys257 dan Cys261 di CTD dengan Cys257 sebagai tempat palmitoylation
utama. Penelitian Yu et al. (2006) menunjukkan residu Cys257 dan Cys261
menyebabkan perubahan atau modifikasi lipid yang sangat penting kaitannya
dengan interaksi antar protein dalam pembentukan kompleks replikasi RNA
HCV. Cys261 terkonservasi dengan sangat baik oleh karena merupakan tempat
yang dikenal oleh protein NS3 protease sebagai tempat pemotongan. Cys257
yang merupakan tempat palmitoylation utama terkonservasi sempurna pada
HCV dengan genotipe 1, 2 dan 4. Konsensus sekuens tempat palmitoylation
pada HCV dengan subtipe 1a adalah CTTPC (Yu et al., 2006).
commit to user
perpustakaan.uns.ac.id
39
digilib.uns.ac.id
Sekuens isolat 09IDSKAC-20 menunjukkan pada aa 257 dan aa 261
berupa Cysteine sehingga mengindikasikan bahwa fungsi dari kedua tempat
palmitoylation tersebut tidak berubah. Sekuens isolat 09IDSKAC-20 juga
menunjukkan sekuens CTTPC pada aa 257-261 sesuai dengan konsensus
sekuens yang dilaporkan oleh Yu et al. (2006). Namun, pada penyejajaran
seluruh isolat HCV 1a NS4B didapatkan variasi C257(S/Y/T) sementara
Cys261 terkonservasi sempurna pada seluruh isolat. Mutasi Cys257 pada
beberapa isolat tersebut dapat merubah fungsi palmitoylation NS4B karena
Cys257 diketahui sebagai tempat palmitoylation utama protein NS4B. Cys261
yang terkonservasi secara sempurna pada seluruh isolat HCV 1a
menunjukkan bahwa tempat tersebut memiliki fungsi yang sangat penting
dalam kaitannya dengan pengenalan oleh protein NS3 protease sebagai
tempat pemotongan. Penyejajaran yang dilakukan pada seluruh sekuens HCV
1a NS4B dari GenBank didapatkan variasi berupa (C/S/Y/T)(T/A/D/V/S/M)
(T/A)PC sehingga memiliki konsensus XXXPC. Hanya dua tempat yang
terkonservasi sempurna yakni Pro260 dan Cys261 pada konsensus sekuens
tersebut. Hal ini tidak selaras dengan motif sekuens yang dilaporkan oleh Yu
et al. (2006) dan perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap variasi pada
residu-residu tersebut.
Jones et al. (2009) melaporkan bahwa mutasi N216A dapat
meningkatkan titer antibodi virus lima hingga enam kali pada strain JFH1.
Pada isolat 09IDSKAC-20 didapatkan residu Asn216 yang berarti tidak
terdapat adanya mutasi. Sementara itu, pada hasil penyejajaran seluruh
commit to user
40
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
sekuens HCV 1a NS4B yang telah dilaporkan di GenBank didapatkan residu
Asn216 terkonservasi sempurna pada seluruh isolat. Hal tersebut menandakan
pentingnya residu Asn216 tersebut dalam mekanisme replikasi HCV.
commit to user
41
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
BAB VI
SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Gen NS4B HCV isolat 09IDSKAC-20 telah berhasil dikloning dan
plasmid pETBlue1-HCV1a NS4B telah didapatkan. Hasil sekuensing gen
tersebut telah dianalisis bersama dengan seluruh gen NS4B isolat HCV 1a
yang dilaporkan di GenBank sejumlah 395 sekuens. Hasil analisis molekuler
adalah sebagai berikut:
1. Isolat 09IDSKAC-20 memiliki sekuens asam amino NS4B yang konsisten
dengan konsensus yang telah dikenal sebelumnya kecuali pada posisi
Ser29. Implikasi perubahan pada posisi tersebut masih belum diketahui.
2. Hasil penyejajaran gen NS4B isolat 09IDSKAC-20 bersama dengan gen
NS4B seluruh isolat yang telah dilaporkan di GenBank menunjukkan data
baru bahwa terdapat beberapa kemungkinan variasi pada:
a. Daerah N-terminal domain (NTD)
1) inti hidrofobik motif bZIP: L25M dan L46(I/F/V)
2) Q26(H/R)
b. Daerah Transmembrane domain (TMD)
1) Nucleotide Binding Motif HCV 1a: XXXXLXK.
c. Daerah C-terminal domain (CTD)
1) Terdapat variasi dua residu Leucine pada struktur amphiphatic αhelix 1: L246M dan L249I.
commit to user
42
digilib.uns.ac.id
perpustakaan.uns.ac.id
2) konsensus sekuens H2 pada NS4B HCV 1a: ILXXLTXTQLXXR
XHXWX.
3) variasi pada tempat palmitoylation utama NS4B: C257(S/Y/T).
4) motif tempat palmitoylation NS4B HCV 1a: XXXPC.
B. Saran
1. Perlu dilakukan induksi protein dilanjutkan dengan Western Blotting untuk
analisis ekspresi protein plasmid pETBlue1-HCV1a NS4B.
2. Perlu dilakukan penyejajaran sekuens HCV NS4B pada genotipe HCV
lainnya sehingga didapatkan informasi molekuler yang lebih luas.
3. Beberapa variasi asam amino yang didapatkan dalam penelitian ini perlu
dilakukan penelitian lebih lanjut dalam usaha mengetahui implikasi variasi
tersebut terhadap virulensi, patogenesis, replikasi, kekebalan terhadap
regimen obat tertentu dan lain sebagainya.
commit to user