1 BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Kanker

BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kanker dikenal sebagai penyakit yang mematikan karena sel kanker
memiliki kemampuan proliferasi yang tinggi dan kemampuan untuk menghindari
program bunuh diri sel (apoptosis). Menurut American Cancer Society (2014),
kanker berada di urutan ke dua penyebab kematian terbanyak di dunia setelah
penyakit jantung. Terdapat lebih dari 1,2 juta kasus kanker kolon baru pada tahun
2012, menempatkan kanker ini pada urutan ketiga jenis kanker yang paling sering
terjadi di dunia (American Cancer Society, 2014). Angka insidensi kanker kolon
terus meningkat seiring dengan pertambahan penduduk baik di negara
berkembang maupun negara maju (Siegel et al., 2014).
First line therapy pada kanker kolon adalah menggunakan agen kemoterapi
5-fluorourasil (5-FU). Namun penggunaan agen kemoterapi 5-FU memiliki efek
samping yang tidak menyenangkan seperti neutropenia, penurunan sistem
imunitas tubuh, somatitis, diare, hand foot syndrom dan yang paling parah adalah
kardiotoksisitas bahkan terjadi resistensi obat (Meyerhardt and Mayer, 2005;
Thomas et al., 2004). Semakin besarnya efek samping dari penggunaan obatobatan sintesis menyebabkan masyarakat beralih ke pengobatan berbasis bahan
alam. Hal ini dikarenakan bahan alam mudah diperoleh dan telah digunakan
secara turun temurun serta dipercaya memiliki efek samping yang kecil.
1
2
Pendekatan yang menarik untuk dikembangkan adalah penggunaan
kombinasi kemoterapi atau sering disebut sebagai ko-kemoterapi. Ko-kemoterapi
merupakan strategi terapi kanker dengan mengkombinasikan suatu senyawa
kemopreventif yang bersifat tidak toksik dengan agen kemoterapi. Hal ini dapat
meningkatkan efikasi agen kemoterapi karena adanya kombinasi yang sinergis
dan memperkecil kemungkinan efek samping karena mengurangi dosis agen
kemoterapi (Alison, 2004). Aplikasi ko-kemoterapi ini diharapkan dapat
menurunkan toksisitas terhadap jaringan normal.
Salah satu bahan alam yang potensial dikembangkan sebagai agen kokemoterapi adalah rumput mutiara (Hedyotis corymbosa L.). Rumput mutiara
awalnya digunakan untuk terapi apendisitis dan peritonitis di Cina, kemudian
sekarang dikembangkan sebagai anti kanker (Dharmananda, 2004). Penelitian
sebelumnya menunjukkan bahwa rumput mutiara memiliki aktivitas sitotoksik
pada beberapa sel kanker. Suparman (2008) menunjukkan bahwa ekstrak etanolik
rumput mutiara (ERM) mampu menghambat proliferasi sel kanker kolon WiDr
melalui pemacuan apoptosis dan cell cycle arrest. Lee et al. (2011) melaporkan
ERM memiliki aktivitas penghambatan peroliferasi melalui induksi apoptosis
padal sel kanker kolon COLO 205, kanker hepar Hep3B, dan kanker paru-paru
H460.
Rumput mutiara diketahui mengandung asam ursolat dalam jumlah cukup
banyak yakni sekitar 0,4 % dari bahan simplisia (Chen et al., 2005). Asam ursolat
merupakan senyawa triterpen yang telah banyak diteliti. Penelitian terdahulu
menunjukkan bahwa asam ursolat menunjukkan efek sitotoksik pada sel MDA-
3
MB231 dengan IC50 1,49 µg/ml (Chen et al., 2005). Selain itu, asam ursolat
dilaporkan memiliki sifat kemopreventif, anti mutagenik, antioksidan langsung
dan tidak langsung (Martin-Aragon et al., 2001; Ramos et al., 2008). Mekanisme
anti kanker asam ursolat yang lainnya adalah melalui induksi apoptosis yang
ditandai dengan penurunan ekspresi protein anti apoptosis Bcl-2 (Achiwa et al.,
2005; Harmand et al., 2005).
Hingga saat ini belum terdapat penelitian mengenai pengaruh pemberian
ERM terhadap peningkatan aktivitas sitotoksik agen kemoterapi 5-FU pada sel
WiDr sebagai model kanker kolon. Beberapa hal yang penting diketahui dalam
aplikasi kombinasi ini adalah pengamatan aktivitas sitotoksik kombinasi dan
kemampuan dalam menginduksi apoptosis. Uji kombinasi ERM dengan 5-FU
dilakukan untuk mengetahui apakah kombinasi ini dapat meningkatkan aktivitas
sitotoksik 5-FU terhadap sel WiDr. Pengujian sitotoksisitas dilakukan dengan
menggunakan MTT assay. Pemacuan apoptosis akibat penggunaan kombinasi ini
dilihat melalui pewarnaan Annexin V-PI dengan pembacaan menggunakan
flowcytometry. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan alternatif
pengobatan yang lebih efektif, spesifik, dan tertarget dalam menghambat
pertumbuhan sel kanker kolon.
B. Perumusan Masalah
1. Apakah kombinasi ERM dan 5-FU memiliki efek sinergis dalam menghambat
proliferasi sel kanker kolon WiDr?
4
2. Apakah kombinasi ERM dan 5-FU mampu menginduksi apoptosis pada sel
kanker kolon WiDr?
C. Tujuan
1. Tujuan Umum
Mengeksplorasi bahan alam khususnya yang berpotensi sebagai agen kokemoterapi kanker kolon dalam meningkatkan efektivitas obat anti kanker.
2. Tujuan Khusus
a. Mengetahui efek sitotoksik kombinasi ERM dan 5-FU pada proliferasi
kanker kolon WiDr
b. Mengetahui pengaruh pemberian kombinasi ERM dan 5-FU terhadap
induksi apoptosis pada sel kanker kolon WiDr.
D. Urgensi Penelitian
Penelitian ini dilakukan untuk mengeksplorasi bahan alam yang berpotensi
dalam usaha penanganan kanker, terutama terkait dengan permasalahan resistensi
dan efek samping agen kemoterapi lini pertama pada penanganan kanker kolon
yakni 5-FU. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan rumput mutiara
sebagai agen pendamping dalam meningkatkan efek sitotoksik agen kemoterapi 5FU terhadap sel kanker kolon WiDr dan melacak mekanisme molekuler yang
memperantarai efek tersebut. Hasil penelitian ini akan sangat bermanfaat untuk
menambah data ilmiah yang valid mengenai aktivitas sitotoksik rumput nutiara
pada aplikasi kombinasi dengan 5-FU terhadap sel kanker kolon sehingga dapat
5
dipublikasikan menjadi sebuah artikel dalam jurnal ilmiah serta menjadi sumber
data yang bermanfaat bagi pengembangan penelitian selanjutnya. Hasil penelitian
ini juga diharapkan dapat menjadi informasi tambahan bagi masyarakat mengenai
tanaman yang memiliki aktivitas.
E. Tinjauan Pustaka
1. Kanker Kolon
Kanker adalah pertumbuhan sel yang tidak normal yang disebabkan oleh
perubahan ekspresi gen sehingga keseimbangan proliferasi dan apoptosis sel
terganggu (Hanahan and Weinberg, 2011; Ruddon, 2007). Kanker terjadi karena
adanya mutasi pada gen regulator proliferasi sel, baik regulator positif
(oncogene) maupun regulator negatif (tumor supressor gene). Gen regulator
positif diantaranya cyclin dan ras dapat termutasi dan mengalami peningkatan
ekspresi, protein fungsionalnya menjadi memiliki kestabilan tinggi, atau
aktivitasnya meningkat sehingga dapat memacu proliferasi sel. Di sisi lain, gen
regulator negatif seperti p53 dapat mengalami mutasi yang mengakibatkan
penurunan level ekspresi, protein fungsional menjadi inaktif, atau kestabilannya
rendah yang kesemuanya dapat menyebabkan sel kehilangan kontrol untuk
menghentikan aktivitas proliferasi sel yang abnormal. Aktivitas proliferasi sel
yang berlebih pada sel yang telah termutasi akan meningkatkan laju kerusakan
gen sehingga tingkat mutasi akan terus bertambah dan sel akan bertansformasi
menjadi sel kanker seiring dengan berjalannya waktu (King, 2000).
6
Kanker kolon merupakan kanker yang terjadi pada usus besar. Kanker ini
dimulai dari sel yang berbentuk kelenjar pada bagian dalam usus besar yang
kemudian menyebar ke bagian dinding kolon (Heriady, 2002). Kanker kolon
terjadi seperti karsinogenesis pada umumnya. Gen yang terlibat dalam
karsinogenesis kanker kolon dapat digolongkan menjadi 2 tipe. Tipe pertama
mencakup gen penyandi APC, DCC, dan K-ras yang berperan dalam transduksi
sinyal saat replikasi sel. Gen tipe kedua mencakup p53, hMSH2, hMLH1,
hPMS1, dan hPMS2 yang merupakan tumor supressor gene, berperan dalam
perbaikan DNA saat terjadi kesalahan dalam replikasi (Calvert and Frucht,
2002). Pada saat sintesis DNA, hMSH2, hMLH1, hPMS1, dan hPMS2 memiliki
peran penting dalam mekanisme proof reading sehingga akan menekan proses
terjadinya mutasi. Protein p53 berfungsi dalam menghentikan siklus sel ketika
terjadi kerusakan DNA sehingga mekanisme repair DNA dapat berjalan optimal.
Selain itu, jika perbaikan tidak berhasil diatasi, p53 akan memacu apoptosis
(Zekri et al., 2005).
2. Sel WiDr
Sel WiDr (Gambar 1) merupakan continuous cell line yang diisolasi dari
kanker kolon seorang wanita berusia 78 tahun. Sel WiDr merupakan turunan sel
kanker
kolon
yang
lain
yakni sel
HT-29
(Chen
et
al.,
1987). Sel
WiDr memproduksi antigen karsinoembrionik dan memerlukan rentang waktu
sekitar 15 jam untuk dapat menyelesaikan 1 siklus sel. Salah satu karakteristik
dari sel WiDr ini adalah ekspresi siklooksigenase-2 (COX-2) yang tinggi yang
7
memacu proliferasi sel WiDr (Palozza et al., 2005). Pada sel WiDr, terjadi mutasi
p53 pada posisi 273 sehingga terjadi perubahan residu arginin menjadi histidin
(Noguchi et al., 1979). Dengan adanya mutasi pada p53 akan mengakibatkan
terhambatnya mekanisme apoptosis yang diregulasi oleh protein tersebut. Akan
tetapi, p21 pada sel WiDr yang masih normal memungkinkan untuk terjadinya
penghentian daur sel (Liu et al., 2006).
Gambar 1. Sel WiDr sehari setelah thawing (A) dan setelah mencapai konfluen (B) (ATCC,
2014).
Sel WiDr merupakan salah satu sel yang memiliki sensitivitas yang
rendah terhadap perlakuan dengan 5-FU. Tansfeksi p53 normal terhadap WiDr
tidak menyebabkan peningkatan sensitivitasnya terhadap 5-FU (Giovannetti et al.,
2007). Resistensi sel WiDr terhadap 5-FU salah satunya diperantarai dengan
terjadinya peningkatan ekspresi enzim TS yang merupakan target penghambatan
utama dari 5-FU (Sigmond et al., 2003). P-glikoprotein (Pgp) pada sel WiDr tidak
diekspresikan tinggi sehingga kemungkinan terdapat mekanisme lain yang
memperantarai resistensi WiDr terhadap 5-FU yang masih perlu ditelusuri lebih
lanjut (Jansen, 1999). Secara keseluruhan, sel WiDr merupakan sel yang sesuai
untuk digunakan sebagai model dalam skrining senyawa baru sebagai agen kokemoterapi dengan 5-FU. Karakteristik sel WiDr yang mengalami mutasi p53
8
menyebabkan sel ini cocok sebagai pemodelan penelitian apoptosis melalui jalur
p53-independent.
3. Agen Sitotoksik 5-Fluorourasil
Senyawa 5-Fluorourasil (5-FU) (Gambar 2) merupakan agen kemoterapi
utama yang digunakan untuk terapi kanker kolon (Meyerhardt and Mayer, 2005).
Senyawa 5-FU adalah analog pirimidin yang bekerja secara antagonis dengan
deoxyuridine monophosphate (dUMP) terhadap aktivitas enzim timidilat sintetase
(TS).
Gambar 2. Struktur kimia 5-fluorourasil (King and Perry, 2001)
Metabolisme 5-FU (Gambar 3) dimulai setelah memasuki sel. Agen
kemoterapi 5-FU akan dikonversi menjadi 5-fluoro-uridin (5-FudR) oleh timidin
fosforilase yang selanjutnya akan difosforilasi menjadi 5-fluoro-deoksiuridin
monofosfat (5-FdUMP) oleh timidin kinase. Senyawa 5-FdUMP yang menyerupai
dUMP akan menghambat aktivitas TS (Shah and Schwartz, 2001). Hal ini akan
mengakibatkan induksi apoptosis karena penghambatan sintesis DNA yang
disebabkan kekurangan deoksitimidin trifosfat (dTTP). Peningkatan ekspresi TS
pada sel kanker merupakan respon sel yang dapat mengakibatkan resistensi
terhadap 5-FU (Giovanetti et al., 2007).
9
Mekanisme kerja 5-FU pada kanker kolon melalui penggabungan
beberapa bentuk metabolit aktifnya ke dalam rantai materi genetik (RNA atau
DNA) (Longley et al., 2007). Penghambatan sintesis RNA diakibatkan adanya
penyisipan fluorouridine triphosphat (FUTP) sehingga menyebabkan kegagalan
penggabungan untai RNA. Adanya kegagalan ini mengakibatkan terhambatnya
pendewasaan rRNA (Kanamaru et al., 1986; Goshal et al., 1994), proses splicing
pre-mRNA (Doong et al., 1988; Patton et al., 1983), serta mengganggu proses
modifikasi pada post-translasi tRNAs (Santi et al., 1987; Randerath et al., 1983).
Penghambatan sintesis DNA sendiri dapat melalui dua mekanisme. Pertama,
melalui penghambatan TS oleh metabolit aktif FdUMP yang dapat menghambat
reaksi perubahan dUMP menjadi deoxythymidine monophosphate (dTMP) yang
menjadi komponen pada replikasi dan perbaikan DNA. Kedua, melalui
penggabungan fluorodeoxyuridine triphosphate (FdUTP) sehingga terjadi
kegagalan pembentukan untai DNA yang diinginkan (Longley et al., 2003).
10
Gambar 3. Metabolisme agen kemoterapi 5-fluorourasil (5-FU). Agen kemoterapi 5-FU
dikonversi menjadi 3 metabolit fluorodeoxyuridine monophosphate (FdUMP), fluorodeoxyuridine
triphosphate (FdUTP), fluorouridine triphosphate (FUTP). Jalur aktivasi utama 5-FU adalah
konversi menjadi fluorouridine monophosphate (FUMP) secara langsung oleh orotate
phosphoribosyltransferase (OPRT) dengan phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) sebagai
kofaktor, atau secara tidak langsung menjadi fluorouridine (FUR) oleh uridine phosphorylase
(UP) dan uridine kinase (UK). FUMP kemudian difosforilasi menjadi fluorouridine diphosphate
(FUDP) yang kemudian difosforilasi menjadi metabolit aktif fluorouridine triphosphate (FUTP),
atau diubah menjadi fluorodeoxyuridine diphosphate (FdUDP) oleh ribonucleotide reductase
(RR). Sebaliknya, FdUDP dapat mengalami fosforilasi atau defosforilasi untuk menghasilkan
metabolit aktif FdUTP dan FdUMP. Jalur aktivasi alternatif lainnya melibatkan thymidine
phosphorylase yang mengkatalisis perubahan 5-FU menjadi fluorodeoxyuridine (FUDR) yang
kemudian difosforilasi oleh thymidine kinase (TK) menjadi FdUMP. Dyhydropyrimidine
dehydrogenase (DPD) mengubah 5-FU menjadi dyhydrofluorouracil (DHFU) yang merupakan
rate limiting step dari katabolisme 5-FU di dalam sel normal dan sel kanker. Sekitar 80%
pemberian 5-FU dipecah oleh DPD di dalam hati (Longley et al., 2007).
Mekanisme resistensi sel kanker terhadap 5-FU melibatkan modulasi
pada ekspresi gen regulator yang terlibat dalam jalur transduksi sinyal NF-κB,
siklus sel, maupun metabolisme pirimidin (Wang et al., 2004). Pada kaitannya
dengan siklus sel, 5-FU tidak dapat bekerja pada sel yang berada di luar siklus sel
11
(G0). Agen kemoterapi 5-FU hanya bekerja pada sel yang aktif menjalankan
siklus sel yang memerlukan aktivitas TS untuk sintesis basa penyusun DNA.
Enzim TS diekspresikan tinggi pada fase G1 melalui perantara aktivitas
transkripsi E2F (Peters et al., 2002). Senyawa 5-FU dapat menginduksi terjadinya
penghentian siklus sel dan pemacuan apoptosis tanpa melibatkan peran p53, tetapi
melibatkan peningkatan ekspresi p21 dan pRB (Vousden and Lu, 2002). Kedua
protein tersebut memiliki peran penting dalam sistem checkpoint pada fase G1.
Ekspresi pRB yang tinggi akan menghambat aktivitas E2F sehingga menyebabkan
penghambatan sel untuk melalui R (Lomazzi et al., 2002). Ekspresi p21 dapat
menghambat aktivitas cyclin E/CDK2 dan cyclin A/CDK 2 sehingga dapat
menyebabkan penghambatan siklus sel pada fase G1 dan S.
Efek samping penggunaan 5-FU yang ditemui pada pasien antara lain
neutropenia, stomatitis, diare, dan hand-foot syndrom. Masing-masing efek ini
terkait dengan metode pemberian yang diterapkan pada pasien (Meyerhardt and
Mayer, 2005). Pada kasus efek samping 5-FU yang paling parah adalah
kardiotoksisitas meskipun hal ini jarang ditemui (Thomas et al., 2004).
Dibandingkan dengan agen kemoterapi lainnya, 5-FU memiliki selektivitas yang
tinggi pada aktivitas TS dan efek samping yang ditimbulkan relatif lebih ringan.
Namun, efektivitas 5-FU sebagai agen kemoterapi baru mencapai 15% sehingga
diperlukan pengembangan agen ko-kemoterapi untuk meningkatkan efektivitas
terapi dengan 5-FU (Meyerhardt and Mayer, 2005).
12
4. Apoptosis dan Deteksinya dengan Flow cytometry Annexin V
Kematian sel merupakan suatu proses normal yang mempunyai dua fungsi
yaitu perbaikan jaringan dan pelepasan sel rusak yang mungkin membahayakan
tubuh (DeVita et al., 2011). Proses kematian sel terdiri dari dua macam yaitu
nekrosis dan apoptosis (Gambar 4). Apoptosis merupakan proses bunuh diri suatu
sel yang terprogram yang penting dalam pengaturan homeostasis sehingga terjadi
keseimbangan jumlah sel melalui eliminasi sel yang rusak (DeVita et al., 2011).
Dalam kematian yang terprogram ini diperlukan transduksi sinyal yang
mengaktivasi jalur apoptosis serta energi (ATP) yang cukup dari sel. Ketika sel
tidak memiliki cukup energi untuk melakukan eksekusi dirinya maka sel akan
kehilangan kontrol dan terjadi kematian sel melalui proses nekrosis (Jaeschke and
Bajt, 2006). Apoptosis diperlukan jika sel sudah tidak memungkinkan untuk
berkembang karena adanya kerusakan yang tidak dapat diperbaiki atau adanya
regenerasi sel muda (Alberts, 2008). Induksi apoptosis dipengaruhi oleh beberapa
faktor antara lain kerusakan DNA, kekurangan faktor pertumbuhan (FGF, EGF,
PDGF) dan penggunaan obat kemoterapi (King, 2000).
13
Gambar 4. Perbedaan apoptosis dan nekrosis. Apoptosis dipengaruhi oleh kontrol dan
dipengaruhi oleh signal seluler. Nekrosis bukan merupakan program kematian sel dan tidak
terkontrol. Sel yang mengalami nekrosis akan pecah dan mengeluarkan komponen selulernya ke
area ekstraseluler (Van Cruchten et al., 2002).
Terdapat perbedaan morfologi antara apoptosis dan nekrosis (Tabel 1).
Perbedaan yang mendasar adalah terlihat dari morfologi plasma sel antara
apoptosis dan nekrosis. Pada nekrosis, sel kehilangan integritas membran plasma
sehingga mengakibatkan sel membengkak. Pada apoptosis, integritas membran sel
masih terjaga hingga proses berlangsung sampai akhir (Hotchkiss et al., 2009).
Sel yang mengalami nekrosis akan mengeluarkan seluruh isi sel termasuk
mediator-mediator inflamasi sehingga menyebabkan reaksi inflamasi. Inflamasi
yang berlebih akan menyebabkan respon nyeri dan dalam jangka panjang dapat
menimbulkan terjadinya autoimun sehingga kematian sel secara apoptosis dalam
terapi pengobatan kanker lebih diharapkan.
14
Tabel 1. Perbedaan Morfologi Sel Apoptosis dan Nekrosis (Hotchkiss et al., 2009)
Perubahan Morfologi
Apoptosis
Nekrosis
Kesatuan membran masih ada
Mengalami kerusakan
Membran sel
Kondensasi kromatin, DNA laddering, Degradasi DNA secara acak
Nukleus
fragmentasi inti
Membran berkondensasi, fragmentasi Terjadi
pembengkakan
Sitoplasma
sel, depolimerisasi sitoskeleton
organ sel
Protein yang berperan dalam regulasi apoptosis diantaranya p53, keluarga
protein Bcl-2, Apaf, Caspase, inhibitor protein pro apoptosis (inhibitor of
apoptosis protein, IAP) serta reseptor yang merespon sinyal kematian (death
receptor) (Shah and Schwartz, 2001). Apoptosis terjadi melalui dua jalur utama,
yaitu ekstrinsik dan intrinsik (Gambar 5). Jalur intrinsik menjadi target blokade
tumorigenesis (Hanahan and
Weinberg, 2011). Jalur ini disebut juga jalur
mitokondria dan aktivasinya bergantung pada keseimbangan aktivitas protein pro
dan anti apoptosis dari famili Bcl-2 (Vogler et al., 2009).
Pada aktivasi jalur intrinsik, protein p53 berperan sebagai detektor
terjadinya cellular stress. Peran ini dikontrol oleh MDM2 dan Arf. Pada saat tidak
terdapat sinyal apoptosis, p53 terikat pada MDM2 sehingga terinaktivasi dengan
ubiquitinasi dan dihantarkan menuju proteasom yang mengakibatkan proteolytic
cleavage. Adanya sinyal apoptosis menyebabkan induksi Arf yang kemudian akan
mengikat MDM2 sehingga p53 terlepas. Protein p53 menjadi bebas dan aktif.
Aktivasi protein p53 mampu menginisiasi apoptosis dengan aktivasi protein pro
apoptosis dari family Bcl-2 Puma dan Noxa (Kiaris, 2006). Saat ada sinyal
apoptosis (Gambar 5), Bax dan Bak yang ada di sitoplasma akan diaktivasi oleh
BH3-only protein seperti tBid menuju ke mitokondria (Tait and Green, 2010).
Family Bcl-2 meregulasi permeabilitas membran mitokondria dan menentukan
protein yang akan dilepaskan ke dalam sel (Mayer and Oberbauer, 2003).
15
Bax yang teraktivasi akan membentuk oligomer pada membran
mitokondria sehingga melepaskan sitokrom C yang segera membentuk kompleks
dengan Apaf-1 sehingga terbentuk trimer Apaf-1/sitokrom C/pro caspase 9 yang
disebut apoptosom. Apoptosom ini menginduksi aktivasi pro caspase 9 menjadi
caspase 9 yang disebut juga sebagai initiator caspase. Cysteine Aspartyl Specific
Protease-9 (Caspase 9) selanjutnya mengaktivasi caspase yang lain seperti
caspase 3 dan 7. Caspase 3 (effector caspase) kemudian akan menginisiasi
apoptosis melalui aktivasi caspase-activated DNAse (CAD, DNA fragmentation
factor) dengan jalan melepaskannya dari inhibitor CAD sehingga akan terjadi
fragmentasi DNA. Berbagai protein seluler seperti PARP, laminin, dan β-lactin
juga didegradasi oleh caspase (Jaeschke and Bajt, 2006).
Gambar 5. Jalur ekstrinsik dan intrinsik mekanisme apoptosis. Jalur intrinsik diinisiasi
dengan adanya cellular stress, kerusakan DNA, radiasi, atau signal lain yang dideteksi oleh protein
Bcl-2-homology 3 only (BH3-only) menyebabkan perubahan potensial dan permeabilitas
membran luar mitokondria. Jalur ekstrinsik diinisiasi melalui aktivasi reseptor kematian TNFR
superfamily oleh ligand-nya (Almagro and Vucic, 2012).
16
Jalur ekstrinsik terjadi karena adanya ikatan antara ligan penginduksi
kematian sel dengan reseptor kematian seperti TNF-R1, Fas, dan TRAIL (TNF
receptor apoptosis-inducing ligand). Aktivasi reseptor ini mengakibatkan domain
sitoplasmik dari reseptor kematian mengikat protein adaptor Fas-associated death
domain (FADD) (Almagro and Vucic, 2012). Ikatan antara death receptor
dengan ligannya mengakibatkan terbentuknya ikatan dengan protein adaptor yaitu
ligan-reseptor-protein adaptor yang dikenal dengan death-inducing signaling
complex (DISC). Kompleks DISC lalu menginisiasi pengaktifan pro caspase 8
yang mengaktifkan caspase 8 (initiator caspase). Cysteine Aspartyl Specific
Protease-8 (Caspase 8) selanjutnya mengaktivasi Bid dan berinteraksi dengan
jalur intrinsik. Aktivasi jalur intrinsik mitokondria terjadi karena cellular stress
sehingga memicu pelepasan sitokrom C dari mitokondria yang selanjutnya
bergabung dengan Apaf-1 dan caspase 9 untuk membentuk apoptosom dan
mengaktivasi caspase 3, 6, dan 7 sebagai efektor apoptosis (Almagro and Vucic,
2012; Reuter et al., 2008).
Flow cytometry merupakan teknologi yang secara simultan mampu
menghitung dan mengkarakterisasi berbagai macam sifat fisika dari partikel
tunggal (biasanya sel). Prinsip kerja flow cytometry adalah mengalirkan setiap sel
ke sistem fluida lalu ditembak dengan sinar laser yang kemudian disebarkan oleh
setiap sel. Selain itu, sinar laser tersebut juga dapat mengaktivasi senyawa
fluoresen yang terdapat di dalam sel. Setiap sinyal sinar yang disebarkan maupun
yang difluoresensikan akan diubah menjadi impuls elektrik sehingga dapat
terdeteksi dan tersimpan sebagai data di dalam komputer. Flow cytometry dapat
17
digunakan untuk deteksi adanya perubahan morfologi sel yang mengalami
apoptosis menggunakan nuclear staining dan mampu menghitung jumlah sel yang
mengalami apoptosis menggunakan flow cytometry Annexin V (Koopman et al.,
1994).
Apoptosis merupakan mekanisme kematian sel yang terprogram dan
terjadi secara alami pada sel yang abnormal atau mengalami pembelahan yang
berlebihan (Cohen, 1991). Pada tahap awal apoptosis (Gambar 6) terjadi
perubahan pada permukaan sel yaitu adanya translokasi phosphatidylserine (PS)
dari bagian dalam membran plasma menjadi berada dibagian luar membran
plasma sehingga melingkupi seluruh bagian permukaan sel (Vermes et al., 1995).
Gambar 6. Deteksi apoptosis dengan pewarnaan annexin V dan PI. Sel normal (a)
memiliki phospatidilserin yang terletak di memban bagian dalam sehingga tidak berikatan dengan
annexin V maupun PI. Ketika terjadi induksi apoptosis (b), phosphatidilserin akan berpindah ke
bagian luar membran sel sehingga dapat dideteksi oleh annexin V. Sedangkan ketika apoptosis
lebih lanjut terjadi (c), selain phosphatidilserin berpindah ke bagian luar, membran sel mulai
mengalami rupture sehingga PI dapat masuk ke dalam sel dan berinterkalasi dengan DNA
sedangkan annexin akan berikatan dengan PS (Vermes et al., 1995).
Annexin V adalah Ca2+-dependent phospolipid-binding protein dengan
ukuran 35-36 kDa yang mempunyai afinitas tinggi terhadap PS. Annexin V akan
berikatan dengan PS yang telah mengalami translokasi sehingga berada pada
permukaan sel yang mengalami apoptosis (Gambar 6) (Casciola-Rosen et al.,
1996; van Engeland et al., 1996; Vermes et al., 1995). Annexin V dapat
18
dikonjugasikan dengan fluorochromes dan berfungsi sebagai probe yang sensitif
untuk analisis sel yang mengalami apoptosis menggunakan flow cytometry.
Pewarnaan dengan Annexin V biasanya digunakan bersamaan dengan
pewarna propidium iodida (PI) yang dapat mewarnai sel dengan cara
berinterkalasi dengan DNA sehingga dapat digunakan untuk mengidentifikasi sel
yang mengalami apoptosis awal atau akhir. Sel hidup (viable cells) mempunyai
membran yang utuh dan PS masih berada di dalam sel sehingga PS tidak
terwarnai oleh Annexin V dan PI tidak dapat melewati membran sehingga tidak
mewarnai inti sel. Sel yang mengalami apoptosis awal mengalami eksternalisasi
PS sehingga akan terwarnai oleh Annexin, akan tetapi membran sel yang masih
utuh menyebabkan PI tidak dapat masuk untuk berinterkalasi dengan DNA. PI
dapat menembus membran dan berinterkalasi dengan DNA dan mewarnai sel
pada membran-membran sel yang mati dan rusak. Sel yang mengalami apoptosis
akhir, selain PS sudah mengalami eksternalisasi juga mengalami kerusakan
membran sehingga dapat terwanai oleh Annexin V dan PI. Oleh karena itu, sel
yang hidup bersifat Annexin V dan PI negatif, sedangkan sel yang mengalami
apoptosis awal bersifat Annexin V positif dan PI negatif, dan sel yang mengalami
apoptosis akhir atau yang sudah mati bersifat Annexin V dan PI positif (Hingorani
et al., 2011).
6. Rumput Mutiara
Rumput mutiara (Hedyotis corymbosa [L.] Lamk.) merupakan anggota
suku rubiaceae. Rumput mutiara (Gambar 7) tumbuh pada tanah lembab ditepi
jalan, pinggir selokan, atau di tanah telantar. Terna dengan dengan tinggi 15-50
19
cm ini memiliki daun yang terletak berhadapan bersilangan, helai daun bentuk
lanset dan berwarna hijau muda. Bunga majemuk 2-5, keluar dari ketiak daun,
berbentuk payung warna putih. Buah bulat dengan ujung pecah-pecah.
Bermanfaat untuk anti piretik, anti inflamasi, diuretik, dan melancarkan sirkulasi
darah (Hariana, 2006).
Gambar 7. Rumput Mutiara
Klasifikasi rumput mutiara adalah sebagai berikut :
Divisi
: Spermatophyta
Kelas
: Dicotyledonae
Ordo
: Rubiales
Famili
: Rubiaceae
Genus
: Hedyotis
Spesies
: Hedyotis corymbosa (L.) Lamk
Sinonim
: Oldenlandia corymbosa L.
(Backer, 1965)
Rumput
mutiara
memiliki
efek
penghambatan
pertumbuhan
Pseudomonas aerugynosa, Salmonella typhy, dan Proteus vulgaris. Herba ini juga
dimanfaatkan untuk mengatasi penyakit disentri, asma,
radang usus buntu,
beberapa jenis kanker, tonsilitis, bronkitis, pneumonia, hepatitis, diuretik,
20
melancarkan sirkulasi darah dan detoksifikasi (Sudarsono et al., 2002; Zhou et al.,
2002). Ekstrak etanol rumput mutiara dilaporkan memiliki aktivitas sitotoksik
terhadap sel WiDr dengan nilai IC50 = 116 μg/ml, menginduksi terjadinya
apoptosis dan cell cycle arrest pada fase G1. Selain itu, kombinasinya dengan
agen kemoterapi doxorubicin memberikan efek yang sinergis pada sel tersebut
(Suparman, 2008). Penelitian terhadap ekstrak etanolik rumput mutiara diketahui
mampu menghambat proliferasi sel kanker payudara MCF-7 melalui pemacuan
apoptosis yang diperantarai oleh penurunan ekspresi Bcl-2 (Haryanti, 2008).
Rumput mutiara mengandung asam ursolat (Gambar 8), asam oleat, asperulosid,
asam oleanolat, hentriacontane, stigmasterol, α-sitosterol, β-sitosterol, asam pkumarat, benzoilskandosidmetilester, dan glikosida flavonoid. Dalam rumput
mutiara terkandung asam ursolat sebanyak kurang lebih 4-7% (Chen et al., 2005).
Asam ursolat ini yang dipercaya memperantarai aktivitas antikanker dari rumput
mutiara (Sivapraksam et al., 2014).
Gambar 8. Struktur kimia asam ursolat (Liu et al., 2005)
Asam ursolat (3β-Hydroxyl-12-ursen-28-ic acid) merupakan triterpen
pentasiklik yang dapat diperoleh dari biji-bijian, dedaunan, bunga, dan buah pada
tanaman obat (Shishodia et al., 2003). Asam ursolat memiliki aktivitas menekan
pertumbuhan tumor, menginhibisi promosi tumor, menekan angiogenesis,
(Shishodia et al., 2003) dan menginhibisi proliferasi sel (Kuo et al., 2005).
21
Penelitian Chen et al. (2005) menunjukkan bahwa asam ursolat memiliki aktivitas
sitotoksik yang sangat baik pada sel A549, MDA-MB-231, dan MCF-7 dengan
IC50 berturut-turut 19,8 µg/ml, 1,49 µg/ml, dan 4,7 µg/ml. Selain itu, kombinasi
asam ursolat dengan doxorubicin memiliki efek yang sinergis pada sel kanker
payudara MCF-7 serta memperlihatkan pemhambatan siklus sel pada fase G1
yang mengindikasikan terjadinya apoptosis (Arifin, 2013). Hsu (1998)
melaporkan bahwa senyawa aktif yang terdapat dalam rumput mutiara adalah
asam ursolat dan asam oleanolat yang dapat menghambat pertumbuhan sel Hep2B.
Dong-Kyoo et al. pada tahun 2000 melaporkan bahwa asam ursolat
mampu menginduksi cell cycle arrest yang dimungkinkan melalui penghambatan
replikasi DNA dan peningkatan ekspresi p21. Adanya peningkatan ekspresi p21
menyebabkan pelepasan sitokrom C dan aktivasi caspase-3 yang berujung pada
terjadinya apoptosis. Induksi apoptosis oleh asam ursolat juga diketahui melalui
jalur intrinsik yang ditandai dengan menurunnya potensial transmembran akibat
peningkatan ekspresi Bax dan penurunan ekspresi Bcl-2 yang mengakibatkan
aktivasi caspase-3 (Harmand el al., 2005). Terjadinya induksi apoptosis oleh asam
ursolat juga dimediasi oleh p53 (Manu and Kuttan, 2008). Selain itu, pemberian
asam ursolat pada sel 293 (human embryonic kidney), KBM-5 (human
myelogenous leukemia), H1299 (human non-small cell lung carcinoma) dan U937
(human histiocytic lymphoma) diketahui mampu menghambat NF-κB yang
diaktivasi oleh berbagai karsinogen seperti TNF, phorbol ester, H2O2 dan asap
rokok (Shishodia et al., 2003).
22
Aktivitas apoptosis diperantarai oleh penghambatan aktivasi NF-κB.
Kompleks NF-κB merupakan protein regulator ekspresi sejumlah gen yang
berperan dalam proses pembentukan kanker, termasuk protein anti apoptosis, gen
pengatur adhesi molekul, dan gen pengatur siklus sel. Inaktivasi NF-κB oleh asam
ursolat diperantarai melalui penghambatan ikatan DNA dengan NF-κB yang
terdiri dari p50 dan p65 (Checker et al., 2012). Asam ursolat juga menghambat
degradasi, fosforilasi dan aktivasi kinase Ik-Bα, menghambat fosforilasi dan
translokasi p65 ke inti sel sehingga aktivasi NF-κB terhambat. Hal ini berkorelasi
dengan penghambatan ekspresi protein cyclin D, COX-2 dan MMP 9 (Shishodia
et al, 2003). Namun, interaksi yang terjadi dalam proses penghambatan aktivitas
IKK oleh asam ursolat belum diketahui secara pasti. Senyawa yang dapat
menghambat aktivasi NF-κB memiliki potensi terapetik sebagai senyawa anti
kanker (Li et al., 2010).
G. Landasan Teori
Agen kemoterapi 5-fluorourasil (5-FU) merupakan first line therapy
kanker kolon. Namun, 5-FU memiliki banyak efek samping seperti imunosupresi,
kerontokan rambut, dan diare. Ekspresi COX-2 berlebih pada sel WiDr
mengakibatkan sel kanker kolon tersebut menjadi kurang sensitif terhadap agen
kemoterapi termasuk 5-FU. Oleh karena itu, pengembangan pengobatan kanker
dengan efek samping yang rendah terus dikembangkan. Salah satu cara untuk
mengurangi resistensi dan menurunkan efek samping obat adalah dengan
pemakaian kombinasi bahan alam. Ekstrak etanol rumput mutiara (ERM) terbukti
23
memiliki aktivitas anti proliferatif terhadap sel kanker kolon WiDr, sedangkan
kombinasinya dengan doxorubicin memberikan efek anti proliferatif yang sinergis
serta meningkatkan efektivitas doxorubicin pada sel tersebut. Dengan demikian
dimungkinkan kombinasi ERM dengan agen kemoterapi 5-FU memiliki efek
yang sinergis.
Potensi sitotoksik ERM diketahui melalui induksi apoptosis. ERM
mampu menginduksi apoptosis pada beberapa jenis sel kanker seperti MCF-7,
COLO 205, Hep3B, HepG2, dan WiDr. Sedangkan 5-FU diketahui menginduksi
cell cycle arrest melalui penghambatan sintesis DNA karena dapat berikatan
dengan untai DNA sebagai nukleotida palsu. Kombinasi antara rumput mutiara
dengan agen kemoterapi doxorubicin dan cisplatin mampu meningkatkan induksi
apoptosis dibandingkan dengan pemberian agen kemoterapi tunggal. Kombinasi
antara ERM dan 5-FU diprediksikan mampu meningkatkan induksi apoptosis
karena ERM mampu meningkatkan induksi apoptosis pada pemberian agen
kemoterapi yang lain.
H. Hipothesis
1. Kombinasi ERM dengan 5-FU memiliki efek anti proliferatif yang sinergis
pada sel kanker kolon WiDr.
2. Kombinasi ERM dengan 5-FU mampu menurunkan viabilitas sel melalui
peningkatan kematian sel melalui apoptosis dan nekrosis pada sel kanker
kolon WiDr.