PCR FIX - Blog UB

ROFIATUL KHUSNA/ 125100600111008/K
PCR
1. PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan
DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.
Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal
yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses
replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif. Reaksi berantai polimerase atau
lebih umum dikenal sebagai PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik atau
metode perbanyakan DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik
ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga
memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. PCR adalah suatu teknik yang
melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi
jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA template (unamplified DNA) dipisahkan
dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu
untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target
DNA. Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan
adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Umumnya keadaan
ini dilakukan antara 20 – 40 siklus. Target DNA yang diinginkan (short ”target” product) akan
meningkat secara eksponensial setelah siklus keempat dan DNA non-target (long product)
akan meningkat secara linier seperti tampak pada bagan di atas.
2. Macam- macam PCR
 Real-Time PCR
 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Rt-Pcr)
 Nested PCR
 Multiplex PCR
 ELISA PCR
3. Prinsip kerja Real-Time PCR adalah mendeteksi dan menguantifikasi reporter fluoresen.
Sinyal fluoresen akan meningkat seiring dengan bertambahnya produk PCR dalam reaksi.
Dengan mencatat jumlah emisi fluoresen pada setiap siklus, reaksi selama fase eksponensial
dapat dipantau. Peningkatan produk PCR yang signifikan pada fase eksponensial
berhubungan dengan jumlah inisiasi gen target. Berbeda dengan PCR konvensioal, pada realtime PCR tahap deteksi dan tahap penggandaan materi genetik dilakukan secara bersamaan
(simultan), deteksi produk PCR dilakukan pada fase eksponensial sehingga hasil yang
diperoleh berada pada rentang daerah dengan presisi hasil tinggi. Selain itu, deteksi dilakukan
menggunakan pelacak bertanda fluoresense. Pelacak adalah reagen yang menentukan
kespesifikan hasil. Penggunaan fluoresense dalam tahap deteksi menawarkan sensitivitas yang
tinggi. Dengan demikian, real time PCR menawarkan sensitivitas yang tinggi dan rentang
linearitas yang cukup luas sehingga hasil penentuan kandungan DNA atau RNA di dalam
spesimen menjadi sangat akurat. Contoh produk komersial yang menggunakan real time PCR
yaitu Cobas Taqman.
4. RT-PCR merupakan singkatan Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction. Seperti
namanya, proses RT-PCR merupakan bagian dari proses PCR biasa. Perbedaanya dengan
PCR yang biasa, pada proses ini berlangsung satu siklus tambahan yaitu adanya perubahan
RNA menjadi cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan enzim Reverse
Transkriptase. Reverse Transcriptase adalah suatu enzim yang dapat mensintesa molekul
DNA secara in vitro menggunakan template RNA. Seperti halnya PCR biasa, pada pengerjaan
RT-PCR ini juga diperlukan DNA Polimerase, primer, buffer, dan dNTP. Namun berbeda
dengan PCR, template yang digunakan pada RT-PCR adalah RNA murni. Oleh karena primer
juga dapat menempel pada DNA selain pada RNA, maka DNA yang mengkontaminasi proses
ini harus dibuang. Untuk proses amplifikasi mRNA yang mempunyai poly(A) tail pada ujung
3′, maka oligo dT, random heksamer, maupun primer spesifik untuk gen tertentu dapat
dimanfaatkan untuk memulai sintesa cDNA. Reverse transcriptase biasanya digunakan untuk
mensintesis rantai pertama cDNA dari RNA. Reverse transkriptase dapat dipurifikasi dari
beberapa sumber, seperti: avian myeloblastosis virus (AMV) dan Molones murine leucemia
virus (MMLV). AMV reverse transkriptase adalah RNA-dependent DNA plimerase yang
menggunakan RNA rantai tunggal sebagai template dan dapat mensintesis cDNA dengan arah
5’→3’ jika terdapat primer. Sama seperti aktivitas DNA polimerase.
5. Teknik PCR-ELOSA adalah suatu metode untuk mendeteksi suatu segmen nukleotida
menggunakan PCR dan ELISA. Amplikon PCR didenaturasi, diimobilisasi pada microwell
plate lalu diidentifikasi secara hibridisasi DNA dan imunologis (ELISA). Sejumlah istilah
telah digunakan untuk teknik tersebut diantaranya PCR and DIG-ELISA detection, ELISAbased oligonucleotide ligation assay, PCRoligonucleotide ligation assay, DIAPOPS
(Detection of immobilised amplified products in one phase system) PCR-ELISA merupakan
metode yang digunakan untuk menangkap asam nukleat yang meniru prinsip dari enzim
linked immunosorbant yang terkait. Dimana dalam sebuah pengujian hibridisasi hasil produk
dari PCR akan terdeteksi dengan metode ini. Dengan metode inilah dapat dilakukan
pengukuran sequen internal pada produk PCR. Meskipun banyak metode yang tersedia untuk
mendeteksi sequen tersebut, ELISA PCR berguna untuk mendeteksi dan membedakan antara
beberapa sasaran dari sequen yang diinginkan. ELISA PCR ini juga berguna untuk screening
beberapa sampel, terutama bila jumlah sampel tidak menjamin. Salah satu aspek yang paling
berguna dari PCR-ELISA adalah kemampuannya dalam membedakan antara produk reaksi
perubahan polimerase yang dihasilkan dari seperangkat primer yang mengandung variasi
sequen, yaitu sequen yang bervariasi antar primer.
TEKNIK REKAYASA GENETIKA
1. Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik penentuan urutan basa
nukleotida pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens DNA, yang
merupakan informasi paling mendasar suatu gen atau genom karena mengandung instruksi
yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk hidup. Sekuensing DNA dapat
dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya
dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui.
Teknik ini digunakan dalam riset dasar biologi maupun berbagai bidang terapan seperti
kedokteran, bioteknologi, forensik, dan antropologi.
2. hibridisasi adalah proses penyilangan untuk menghasilkan varietas baru. persilangan
dilakukan dengan cara menyilangkan tetua terpilih sebagai tetua jantan atau betina, secara
acak maupun resiprok, dan persilangan dilakukan interspesific maupun intergenerik. Tujuan
hibridisasi memperoleh kombinasi genetik yang diinginkan melalui persilangan dua atau lebih
tetua yang berbeda genotipenya.
3. Southern blot pertama kali dikemukakan oleh Southern (1975). Teknik ini mentransfer DNA
ke kertas NC dengan menggunakan prosedur aliran pelarut. Caranya yaitu dengan
menempatkan gel elektroforesis ke kertas matriks yang direndam buffer dan berada di atas
sesuatu seperti spons yang telah dibasahi dengan buffer. Membran tersebut diletakkan di atas
gel dan ditumpuk pula beberapa kertas peresap di atasnya. Buffer kemudian akan mengalir
pelan-pelan ke membran, demikian pula dengan gel yang membawa molekul ke kertas
membran, sementara gelnya diserap oleh kertas peresap. Fragmen DNA yang spesifik
dideteksi dengan menggunakan pelacak. Pelacak biasanya merupakan DNA yang dimurnikan
dan bisa ditandai dengan aktifitas spesifik radionukletida. Lokasi sinyal yang terlihat setelah
autradiografi membuat kita dapat menentukan ukuran dari fragmen DNA tersebut.
4. Northern Blot merupakan tekniknya sama dengan Southern Blot, namun menggunakan kertas
DBM dan biasanya mendeteksi RNA. Teknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal Burnette
dan dinamai western blot sebagai olok-olokan terhadap tekini southern blot yang pertama kali
ditemukan.
5. Western blot merupakan teknik untuk mendeteksi protein spesifik pada sampel jaringan yang
homogenat ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan protein tersebut berikatan
dengan antibodi. Teknik ini menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein
berdasarkan panjang polipeptida atau berdasarkan struktur 3D-nya. Protein tersebut kemudian
ditransfer ke sebuah membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF, dimana mereka kemudian
akan dilacak dengan menggunakan antibodi yang spesifik kepada protein target. Western blot
dapat mendeteksi suatu protein dalam kombinasinya dengan sangat banyak protein lain, dapat
memberikan informasi mengenai ukuran dan ekspresi protein tersebut. Western blot adalah
proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke membran. Membran ini dapat
diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga protein yang terblot pada membran dapat
dideteksi dengan cara visual maupun fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada organisme
dilakukan dengan prinsip imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder.
Setelah pemberian antibodi sekunder, deteksi dilakukan secara visual dengan pemberian
kromogen atau secara fluoresensi. Pada deteksi secara fluoresensi, reaksi antara antibodi
primer dengan antibodi sekunder akan memberikan hasil fluoresens yang selanjutnya akan
membakar film X-ray, deteksi ini dilakukan di kamar gelap.