pemberian ekstrak etanol daun stevia (stevia rebaudiana)
advertisement
108 TESIS PEMBERIAN EKSTRAK ETANOL DAUN STEVIA (STEVIA REBAUDIANA) MENCEGAH DISLIPIDEMIA PADA TIKUS (RATTUS NORVEGICUS) WISTAR JANTAN YANG DIBERIKAN DIET TINGGI KOLESTEROL SISSY YUNITA SURYA NIM.1490761009 PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK PROGRAM PASCA SARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2016 109 PEMBERIAN EKSTRAK ETANOL DAUN STEVIA (STEVIA REBAUDIANA) MENCEGAH DISLIPIDEMIA PADA TIKUS (RATTUS NORVEGICUS) WISTAR JANTAN YANG DIBERIKAN DIET TINGGI KOLESTEROL Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister pada Program Magister, Program Studi Ilmu Biomedik, Program Pascasarjana Universitas Udayana SISSY YUNITA SURYA NIM.1490761009 PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK PROGRAM PASCA SARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2016 110 LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING TESIS INI TELAH DISETUJUI PADA TANGGAL : …………… Pembimbing I, Pembimbing II, Prof. dr. I.G.M. Aman, Sp.FK NIP. 194606191976021001 Prof. Dr.dr.Wimpie I. Pangkahila, Sp.And., FAACS NIP. 194612131971071001 Mengetahui Ketua Program Studi Ilmu Biomedik Program Pascasarjana Universitas Udayana, Dr.dr. Gde Ngurah Indraguna Pinatih, MSc., Sp.GK NIP. 195805211985031002 111 LEMBAR PENETAPAN PENGUJI Tesis Ini Telah Diuji dan Dinilai oleh Panitia Penguji pada Program Pascasarjana Universitas Udayana pada Tanggal .............................. Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana, No: ………………..….. Tanggal: …………………. Panitia Penguji Tesis adalah: Ketua Sekretaris Anggota : Prof. dr. IGM. Aman, Sp.FK : Prof. Dr.dr.Wimpie I. Pangkahila, Sp.And.,FAACS : 1. Prof. Dr.dr. J. Alex Pangkahila, M.Sc., Sp.And 2. Dr.dr. Ida Sri Iswari, Sp.MK.,M.Kes 3. Dr.dr. Gde Ngurah Indraguna Pinatih, M.Sc., Sp.GK 112 UCAPAN TERIMA KASIH Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena hanya atas karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul “Pemberian Ekstrak Etanol Daun Stevia (Stevia Rebaudiana) Mencegah Dislipidemia pada Tikus (Rattus norvegicus) Wistar Jantan yang Diberikan Diet Tiggi Kolesterol”. Tulisan ini disusun sebagai syarat dalam menyelesaikan pendidikan untuk memperoleh gelar Magister pada Program Magister Program Studi Ilmu Biomedik, kekhususan Anti Aging Medicine, Program Pascasarjana Universitas Udayana. Selama penelitian ini, penulis mendapat banyak pelajaran dan pengalaman berharga yang memperkaya wawasan dalam proses pembelajaran hidup penulis, baik dari segi ilmiah maupun aspek nilai sosial. Semua ini tidak lepas dari peran serta orang-orang disekeliling penulis yang senantiasa mendukung dan selalu ada pada saat-saat yang sulit. Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan rasa hormat, penghargaan dan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Rektor Universitas Udayana Prof. Dr. dr. Ketut Suastika, Sp.PD. KEMD atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk dapat menempuh pendidikan Program Pascasarjana di Universitas Udayana. 2. Direktur Program Pascasarjana Prof. Dr. A. A. Raka Sudewi, Sp.S(K) atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk dapat menempuh pendidikan Program Pascasarjana di Universitas Udayana 113 3. Prof. dr. I Gusti Made Aman, Sp. FK selaku pembimbing I dan Kepala Laboratory Animal Universitas Udayana Unit Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran yang tdengan bijak dan sabar memberikan banyak dorongan, semangat, bimbingan dan masukan kepada penulis selama penyusunan tesis ini. 4. Prof. Dr. dr. Wimpie Pangkahila, Sp.And, FAACS selaku pembimbing II yang dengan penuh perhatian telah banyak sekali memberikan dorongan, bimbingan dan masukan yang teliti dan sangat dirasakan manfaatnya oleh penulis selama penyusunan tesis ini 5. Dr. dr. Gde Ngurah Indraguna Pinatih, M.Sc., Sp.GK sebagai penguji dan ketua Program Studi Ilmu Biomedik yang telah banyak membantu penulis memberikan masukan dan bimbingan yang sangat bermanfaat dalam penyusunan tesis ini 6. Prof. Dr. dr. J Alex Pangkahila, M.Sc., Sp.And. selaku penguji, yang telah banyak memberikan saran, semangat, bimbingan dan masukan kepada penulis selama penulis mengikuti program magister, khususnya dalam penyusunan tesis ini. 7. Dr dr. Ida Sri Iswari, Sp.MK.,M.Kes, selaku penguji yang dengan sangat bersemangat membimbing dan memberi masukan kepada penulis selama penyusunan tesis ini. 114 8. Dr. dr. Desak Made Wihandani, M.Kes, selaku pembimbing akademis yang telah banyak memberikan bimbingan dan masukan kepada penulis selama penyusunan tesis ini. 9. Pak Gede Wiranatha yang banyak membantu dalam proses penelitian di Animal Laboratory bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana. 10. Seluruh dosen Pasca Sarjana Biomedik Universitas Udayana yang telah membimbing penulis dalam menempuh pendidikan dari awal hingga selesainya tesis ini 11. Seluruh staf Universitas Udayana khususnya Program Magister Ilmu Biomedik Kekhususan Anti-Aging Medicine yang selalu siap membantu dalam menyelesaikan tesis ini. Terimakasih sebesar-besarnya kepada Pak Edy, Geg Wah, Geg Eni, Mbok Ami dan seluruh staf Biomedik yang kebaikannya tidak terkira. 12. Kedua orang tua (Sunaryo Kamto dan Suliati Sandhi), kakak dan adik ( Deni Surya dan Yang-Yang Oetomo Surya), dan seluruh keluarga tercinta serta sahabat penulis yang selalu memberikan dukungan, semangat, serta doa serta pengertian selama penulis menempuh pendidikan. 13. dr. Astrid Tanumihardja, dr. Magdalena Mercyana, dr.Cheria Valentina, dr. Adeline Ivana Dewi, dr. Astrid Karina, dr. Ivonne Kurniawan, dr. Ellen Destrisa Ratnapuri, dr. Monica Pranoto, dan dr Laura Indriana sebagai sejawat 115 sekaligus sahabat yang berjuang bersama dan saling memberikan semangat satu sama lain sejak awal kuliah hingga selesainya tesis ini. 14. Teman sejawat mahasiswa Program Magister Ilmu Biomedik Kekhususan Anti-Aging Medicine Angkatan IX atas kekompakannya selama ini, perhatian dan dukungan yang tiada henti untuk menyemangati satu sama lain dalam menyelesaikan tesis. 15. Semua sahabat dan teman sejawat di RSK BIMC yang selalu memberikan dorongan semangat dan dukungan selama proses perkuliahan hingga selesainya tesis ini. Penulis juga mengucapkan banyak terima kasih kepada semua pihak yang telah ikut membantu dalam pelaksanaan dan penyelesaian tesis ini yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Penulis sangat menyadari bahwa tesis ini masih sangat jauh dari kesempurnaan, sehingga saran dan masukan membangun dari berbagai pihak sangatlah diharapka. Semoga hasil penelitian ini dapat memberikan manfaat bagi penulis pribadi, bagi program perkembangan ilmu pengetahuan kedokteran terutama di bidang Anti Aging Medicine (AAM) serta bagi pihak-pihak lain yang berkepentingan. Akhir kata, semoga Tuhan Yang Maha Kuasa, senantiasa melimpahkan berkat dan rahmat-Nya kepada kita semua, Amin. Denpasar, Juli 2016 Penulis 116 ABSTRAK PEMBERIAN EKSTRAK ETANOL DAUN STEVIA (STEVIA REBAUDIANA) MENCEGAH DISLIPIDEMIA PADA TIKUS (RATTUS NOVERGICUS) WISTAR JANTAN YANG DIBERIKAN DIET TINGGI KOLESTEROL Dislipidemia adalah faktor risiko mayor dan primer dari penyakit jantung koroner, bahkan mungkin merupakan salah satu persyaratan terjadinya penyakit jantung koroner sebelum faktor risiko mayor lainnya mulai berperan. Dislipidemia dapat menyebabkan stress oksidatif dalam tubuh, yaitu terjadinya peningkatan produksi radikal oksigen oleh sel endotel. Peningkatan kadar radikal oksigen akan menyebabkan degradasi NO (Nitric Oxide) serta produksi radikal bebas lainnya. Stevia rebaudiana merupakan jenis tanaman asli Amerika Selatan dari famili bunga matahari (Asteraceae), fungsi obat dari tanaman ini terletak pada beberapa zat kimia yang menghasilkan kerja fisiologis pada tubuh manusia, terutama ditemukan pada alkaloid, flavonoid, tannin, dan senyawa fenol. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui kegunaan ekstrak daun stevia dalam mencegah dislipidemia pada tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol. Penelitian ini adalah penelitian ekperimental murni dengan menggunakan post test only control group design. Dalam penelitian ini digunakan 36 ekor tikus (Rattus norvegicus) jantan sebagai sampel. Seluruh tikus kemudian dibagi menjadi 2 kelompok yaitu kelompok kontrol yang diberikan diet tinggi kolesterol dan plasebo yang berupa aquadest serta kelompok perlakuan diberi diet tinggi kolesterol dan ekstrak daun stevia dengan dosis 300mg/kg berat badan. Plasebo dan ekstrak daun stevia diberikan sekali sehari selama 28 hari, kemudian pada hari ke 29 diambil sampel darah untuk pemeriksaan profil lipid setelah tikus dipuasakan selama 18 jam. Hasil penelitian menunjukkan bahwa rerata kadar kolesterol total sesudah 28 hari perlakuan kelompok kontrol (P0) adalah 218,70±8,53mg/dl dan kelompok perlakuan (P1) adalah 112,12±5,91mg/dl (p<0,05). Rerata kadar trigliserida kelompok kontrol (P0) adalah 149,46±7,73mg/dl dan kelompok P1 adalah 95,00±6,99mg/dl (p<0,05). Rerata kadar kolesterol HDL kelompok kontrol (P0) adalah 26,66±2,29mg/dl dan kelompok P1 adalah 39,07±1,73mg/dl (p<0,05). Rerata kadar kolesterol LDL kelompok kontrol (P0) adalah 67,46±4,08mg/dl dan kelompok P1 adalah 38,95±4,32mg/dl (p<0,05). Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa pemberian ekstrak daun stevia dengan dosis 300mg/ kg berat badan selama 28 hari dapat mencegah dislipidemia pada tikus (Rattus norvegicus) Wistar jantan yang diberi diet tinggi kolesterol. Hasil penelitian ini perlu diteliti lebih lanjut untuk mengetahui komponen aktif daun stevia yang berperan dalam pencegahan dislipidemia dan dilanjutkan dengan clinical trial. Kata kunci: ekstrak daun stevia, dislipidemia, diet tinggi kolesterol, tikus putih jantan. 117 ABSTRACT ADMINISTRATION OF ETHANOL EXTRACT OF STEVIA LEAF (STEVIA REBAUDIANA) PREVENT DYSLIPIDEMIA IN MALE WISTAR RAT (RATTUS NOVERGICUS) WITH HIGH CHOLESTEROL DIET Dyslipidemia is a major and primary risk factor of coronary heart disease, even one of the requirements of coronary heart disease before other major risk factors begin. Dyslipidemia may cause oxidative stress in the body, which is increased production of oxygen radical by endothelial cells. Increased levels of oxygen radicals will cause the degradation of NO (Nitric Oxide) and production of the other free radical. Stevia rebaudiana is a South America native plant species from sunflower family (Asteraceae), the medicinal function of the plant is originated from some of the chemicals that produce physiological work on the human body, mainly found in alkaloids, flavonoids, tannins and phenolic compounds. The purpose of this study is to determine the benefit of stevia leaf extract in preventing dyslipidemia in male wistar rats with high-cholesterol diet. This study was a true experimental study using post test only control group design. This study used 36 male rats (Rattus novergicus) sample. The whole of mice were then divided into two groups: the control group which were given high-cholesterol diet and placebo in the form of distilled water and the treatment group which were given highcholesterol diet and stevia leaf extract at dose of 300mg / kg body weight. Placebo and stevia leaf extract was administered once daily for 28 days, blood samples for lipid profile analysis were taken on day 29 after the mice were fasted for 18 hours. The study results showed that the mean total cholesterol levels after 28 days of treatment control group was 218.70 ± 8,53mg / dl and the treatment group was 112.12 ± 5,91mg / dl (p <0.05) . Mean triglyceride levels of control group was 149.46 ± 7,73mg / dl and the treatment group was 95.00 ± 6,99mg / dl (p <0.05). The mean levels of HDL cholesterol control group was 26.66 ± 2,29mg / dl and the treatment group was 39.07 ± 1,73mg / dl (p <0.05). The mean levels of LDL cholesterol control group was 67.46 ± 4,08mg / dl and the treatment group was 38.95 ± 4,32mg / dl (p <0.05). It was concluded that stevia leaf extract at dose of 300mg/ kg body weight for 28 days prevend dyslipidemia in male rat (Ratus novergicus) with high cholesterol diet. This study need to be further investigated to determine the active component of the stevia leaf that prevent dyslipidemia and continue with clinical trial. Keywords: stevia leaf extract, dyslipidemia, high cholesterol diet, white male rat. 118 DAFTAR ISI SAMPUL DALAM…………………………………………………….…. PRASYARAT GELAR…………………………………………………… LEMBAR PERSETUJUAN…………………………………..……….…. LEMBAR ENGESAHAN…………………………………….……….…. UCAPAN TERIMA KASIH…………………………………………….... ABSTRAK………………………………………………………....……… ABSTRACT……………………………………………..…..….................. DAFTAR ISI…………………………………………………….………… DAFTAR GAMBAR..………………….………………………….………. DAFTAR TABEL…………………….……………….…………………... DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG…………………...………… DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………………… BAB I. PENDAHULUAN……………………….………………………... 1.1 Latar Belakang……………………….………………………. 1.2 Rumusan Masalah………………….………………………… 1.3 Tujuan Penelitian……………………...…………................... 1.4 Manfaat Penelitian……………………….…….….………… BAB II. KAJIAN PUSTAKA…..…………………..…………………….. 2.1 Lipid….………………………………………………………. 2.1.1 Metabolisme Lipid……………...……………………… 2.1.1.1 Oksidasi Asam Lemak (Oksidasi β)…………… 2.1.1.2 Biosintesis Kolesterol….………………………. 2.1.2 Transpor Lipid………....………………………………. 2.1.3 Kolesterol…………….……………...…………………. 2.1.4 Lipoprotein…..……………………...…………………. 2.1.5 Trigliserida…..…………………………………………. 2.1.6 Low Density Lipoprotein (LDL)………………………….. 2.1.7 High Density Lipoprotein (HDL)…..………..…………... 2.1.8 Very Low Density Lipoprotein (VLDL) dan Intermediate Density Lipoprotein (IDL)………………..………………….. 2.2 Dislipidemia…..……………………………………………… 2.2.1 Etiologi Dislipidemia…..………………………………. 2.2.2 Diagnosis Dislipidemia………………………………… 2.2.3 Penanganan Dislipidemia……………………………… 2.3 Diet terkait Kolesterol…...………………………………… Halaman i ii iii iv v ix x xi xiv xv xvi xix 1 1 9 9 10 12 12 13 16 18 20 22 24 26 27 28 28 29 30 32 34 39 119 2.4 Penuaan (Aging)……………………………………...……… 2.4.1 Tanda Penuaan……………………..…………………... 2.4.2 Biomarker Penuaan……………………....…………….. 2.4.3 Hubungan Dislipidemia dan Aging…………...………... 2.5 Stevia Rebaudiana……..…………………...………………… 2.5.1 Kandungan Stevia Rebaudiana……………………….... 2.5.2 Efek Anti Oksidan Stevia Rebaudiana………...………. 2.5.3 Stevia Rebaudiana dan Dislipidemia..…………………. 2.5.4 Toksisitas Stevia Rebaudiana…………...……………... 2.6 Hewan Percobaan……..…………………...……….………… BAB III. KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS..…….. 3.1 Kerangka Berpikir……………………...……………………. 3.2 Konsep Penelitian……………………...…………………….. 3.3 Hipotesis Penelitian………………….………………..……... BAB IV. METODE PENELITIAN……………………………………….. 4.1 Rancangan Penelitian……………......………………………. 4.2 Waktu dan Tempat Penelitian………………………………... 4.2.1 Tempat Penelitian………………………...……………. 4.2.2 Waktu Penelitian……………………………………….. 4.3 Populasi dan Sampel Penelitian…………………..………….. 4.3.1 Populasi Penelitian……………………...……………... 4.3.2 Sampel……………………...………………………….. 4.3.2.1 Kriteria Inklusi…………………………………. 4.3.2.2 Kriteria Dropout.…………………...………….. 4.3.3 Penentuan Besar Sampel………………...…………….. 4.4 Variabel Penelitian………...………………………………… 4.4.1 Klasifikasi Variabel…………..…….………………….. 4.4.2 Definisi Operasional Variabel…………...…………….. 4.5 Bahan Penelitian…………………………………...………… 4.6 Instrumen Penelitian…………………...…………………….. 4.7 Prosedur Penelitian…………………...……………………… 4.8 Alur Penelitian…………………...………………………...… 4.9 Analisis Data…………………………………………………. BAB V. HASIL DAN PEMBAHASAN….……………………………….. 5.1 Hasil Penelitian……..……………..…………………………. 5.1.1 Analisis Deskriptif…...………………...………………. 5.1.2 Uji Normalitas Data…………………………..……….. 5.1.3 Uji Homogenitas Data antar Kelompok.……………..... 41 43 46 46 48 50 56 58 62 63 66 66 68 69 70 70 71 71 71 72 72 72 72 72 72 73 73 74 75 75 76 78 79 80 80 80 81 82 120 5.1.2 Uji Komparabilitas …………………………..……….. 83 5.2 Pembahasan…………………...…..…………..…………….. 88 4.2.1 Subyek Penelitian..………………………..…………... 88 5.2.2 Dosis dan Pelarut Ekstrak Daun Stevia Rebaudiana.…. 90 91 5.2.3 Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Daun Stevia Rebaudiana terhadap Perbaikan Profil Lipid………………………..…….. BAB VI. KESIMPULAN DAN SARAN….………..…………………….. 99 DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………… 101 LAMPIRAN……………...………………………………………………... 108 121 DAFTAR GAMBAR Halaman 2.1 Ikhtisar metabolisme lemak …..…………………………… 2.2 Lintasan Ketogenesis di Hati………………...…………….. 18 2.3 Tahapan Biosintesis Kolesterol………………………………. 20 2.4 Struktur Dasar Kolesterol……………………………………... 24 2.5 Jenis-Jenis Lipoprotein dalam Darah......……………………... 26 2.6 Stres Oksidatif sebagai Demoninator Mayor Teori Penuaan..... 42 2.7 Stevia Rebaudiana… …………………………………………. 49 2.8 Steviol, Blok Bangunan Dasar dari Glikosida Manis….……... 51 4.1 Bagan Rancangan Penelitian..……………….……………… 70 Grafik Perbandingan Rerata Total Kolesterol antar Kelompok 84 5.1 15 Sesudah Perlakuan.……………………………………….... 5.2 Grafik Perbandingan Rerata Total Kolesterol antar Kelompok 85 Sesudah Perlakuan………………………………………….... 5.3 Grafik Perbandingan Rerata Kolesterol HDL antar Kelompok 87 Sesudah Perlakuan………………………………………….... 5.4 Grafik Perbandingan Rerata Kolesterol LDL antar Kelompok Sesudah Perlakuan………………………………………….... 88 122 DAFTAR TABEL Halaman 2.1 Klasifikasi total kolesterol dan LDL kolesterol berdasarkan ATP III……………..…………………………………………………………….….. 33 2.2 Klasifikasi serum trigliserida berdasarkan ATP III…………………………...... 33 2.3 Klasifikasi HDL kolesterol berdasarkan ATP III……...…………………..…... 33 2.4 Target terapi LDL kolesterol berdasarkan ATP III…...…..………………….... 35 2.5 Kandungan nutrisional dari ekstrak daun stevia rebaudiana ..……………….. 52 2.6 Perkiraan Komposisi Stevia Rebaudiana Bertoni...………………………….... 53 2.7 Tabel Hasil Analisis Ekstrak Daun Stevia……...……...…………………..…... 55 2.8 Tabel Hasil Skrining Fitokimia Ekstrak Daun Stevia rebaudiana…………….... 56 5.1 Hasil Analisis Deskriptif Profil………………………………………………... 81 5.2 Hasil Uji Normalitas Data antar Kelompok…………..……………………….. 82 5.3 Hasil Uji Homogenitas Data antar Kelompok…...…………………………….. 83 5.4 Rerata Nilai Kolesterol Total antar Kelompok Sesudah Perlakuan…………….. 83 5.5 Rerata Nilai Trigliserida antar Kelompok Sesudah Perlakuan……..……..…... 85 5.6 Rerata Nilai Kolesterol HDL antar Kelompok Sesudah Perlakuan……….…….. 86 5.7 Rerata Nilai Kolesterol LDL antar Kelompok Sesudah Perlakuan...………….... 87 123 DAFTAR SINGKATAN A.E. = Aqueous Extract ACC = Acetyl-CoA Carboxylase ACO = Acetyl-CoA Oxidase ACS = Acetyl-CoA Synthase AIAC = Acid-Insoluble Acylcarnitine AMPK = Adenosine Monophosphate-Activated Protein Kinase Apo = Apolipoprotein ATP = Adenosine Triphosphate C = Carbon CAA = Cellular Antioxidant Activity CAD = Coronary Artery Disease CO2 = Carbon Dioxide CPT = Carnitine Palmitoyl Transferase CRP = C-Ractive Protein DNA = Deoxyribonucleic Acid DPPH = 1,1 -diphenyl-2-picrylhydrazyl E.E. = Ether Extract Fabp = Fatty Acid Binding Protein FAD = Flavin Adenine Dinucleotide FADH = Flavin Adenine Dehydrogenase FFA = Free Fatty Acid GAE = Gallic Acid Equivalent GAEAC = Gallic Acid Equivalent Antioxidant Capacity H2O = Hydrogen Oxygen HDL = High Density Lipoprotein HMG Ko-A = 3- Hidroksi-3-MetilGlutaril Koenzim A 124 IDL = Intermediate Density Lipoprotein IL = Interleukin Kap. Antioksidan = Kapasitas Antioksidan KoA = Koenzim A LACT = Lecithin-cholesterol acyl transferase LD = Lethal Dose LDL = Low Density Lipoprotein Lp = Lipoprotein LPL = Lipoprotein Lipase LSD = Least Significant Difference Lxr = Liver-X-receptor M.E. = Methanol Extract MCP-I = Monocyte Chemotractant Protein-I M-CSF = Monocyte Colony Stimulating Factor mRNA = Messenger Ribonucleic Acid NAD = Nicotinamide Adenine Dinucleotide NADH = Nicotinamide Adenine Dehydrogenase NCEP-ATP III = National Cholesterol Education Program – Adult Tratment Panel III NO = Nitrite Oxide ORAC = Oxygen Radical Absorbance Capacity PERKI = Perhimpunan Dokter Spesialis Kardiovaskular Indonesia PJK = Penyakit Jantung Koroner PPAR = Peroxisome Proliferator-Activated Receptor QE = Quarcetin Equivalent Riskesdas = Riset Kesehatan Dasar RMR = Resting metabolic rate SOD = Super Oksid Dismutase TAE = Tannic Acid Equivalent 125 TLC = Therapeutic Lifestyle Change UD = Usaha Dagang VLDL = Very Low Density Lipoprotein VSMC = Vascular Smooth Muscle Cell WHO = World Health Organization DAFTAR LAMBANG α = Alfa β = Beta γ = Gamma 126 DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1 Ethical Clearance……….…..………………………… 108 Lampiran 2 Hasil Analisis Ekstrak Daun Stevia……...………….. 109 Lampiran 3 Analisis Deskriptif…………….………………………. 110 Lampiran 4 Uji Normalitas Data…….……………………………... 111 Lampiran 5 Uji Homogenitas Data…………….......………………... 112 Lampiran 6 Analisis Komparasi..…………………………………... 113 Lampiran 7 Hasil Pemeriksaan Profil Lipid Setelah Perlakuan……... 114 Lampiran 8 Data Berat Badan Tikus…………………....………….. 115 Lampiran 9 Data Sisa Pakan Tikus… ………………………………. 116 Lampiran 10 Analisis Komparasi BB Post Test dan Rerata Sisa Pakan 3 Hari Terakhir ……………………………………….. 117 127 BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Dalam proses kehidupan, manusia lahir, berkembang menjadi anak-anak, dewasa dan akhirnya mengalami proses penuaan. Jumlah penduduk lanjut usia di dunia, termasuk di Indonesia, semakin hari semakin meningkat. Peningkatan jumlah penduduk ini belum dibarengi dengan derajat kesehatan dan kualitas hidup yang lebih baik. Dengan semakin majunya dunia kedokteran saat ini diharapkan tenaga medis dapat memberikan pengertian dan kesadaran terhadap masyarakat tentang proses penuaan, pencegahannya, proses untuk menghambat penuaan atau bahkan membalikkannya. Seiring dengan bertambahnya usia, fungsi seluruh organ tubuh juga mengalami perubahan. Penuaan merupakan proses alami pada kehidupan manusia, dimulai pada usia 25 tahun walaupun belum ada gejala yang muncul. Proses penuaan dipengaruhi oleh faktor internal dan eksternal, hal ini berhubungan dengan terjadinya penyakit terkait penuaan. Faktor internal meliputi radikal bebas, hormon yang berkurang, proses glikosilasi, metilasi, apoptosis, sistem kekebalan tubuh yang menurun dan genetik. Faktor eksternal yang utama adalah gaya hidup tidak sehat, diet yang tidak sehat, kebiasaan yang salah, polusi, stres serta kemiskinan (Pangkahila, 2007). 128 Penuaan adalah kerusakan secara menyeluruh dan progresif terhadap fungsi tubuh yang mengakibatkan hilangnya kemampuan adaptasi terhadap stres dan meningkatnya risiko penyakit terkait usia (Field, 2006). Banyak penyakit kronis yang prevalensinya meningkat seiring dengan penuaan, bahkan sangat umum bagi orang tua untuk memiliki lebih dari satu penyakit kronis (Rader dan Hobbs, 2014). Saat ini banyak penyakit yang berhubungan dengan pola makan yang tidak sehat, karena pola makan sekarang cenderung mengandung tinggi kalori dan tinggi lemak, serta pola hidup sedentari dimana aktivitas fisik sehari-hari sangat minimal sehingga menyebabkan kelebihan lemak tubuh. Konsumsi Asam lemak jenuh dan kalori yang tinggi dalam menu makanan masyarakat sekarang akan menimbulkan kelainan metabolisme lemak yang dikenal sebagai dislipidemia (Halim, 2006). Penyakit kardiovaskular merupakan penyebab utama kematian di dunia yang penyebabnya multifaktorial. Dislipidemia adalah faktor risiko mayor dan primer dari penyakit jantung koroner, bahkan mungkin merupakan salah satu persyaratan terjadinya penyakit jantung koroner sebelum faktor risiko mayor lainnya mulai berperan (Jellinger et al., 2012; PERKI, 2013). Data di Indonesia berdasarkan Laporan Riskesdas Bidang Biomedis tahun 2007 menunjukkan bahwa prevalensi dislipidemia atas dasar konsentrasi kolesterol total >200 mg/dL adalah 39,8%. Beberapa propinsi di Indonesia seperti Nangroe Aceh, 129 Sumatra Barat, Bangka Belitung dan Kepulauan Riau bahkan mempunyai prevalensi dislipidemia ≥50% (PERKI, 2013). Pengobatan dislipidemia memegang peranan penting dalam pencegahan primer dan sekunder terhadap penyakit kardiovaskular. Tujuan utama terapi pada dislipidemia adalah untuk mencegah penyakit kardiovaskular dan komplikasinya Penilaian faktor risiko absolut, pengobatan faktor risiko yang dapat dimodifikasi dan optimalisasi gaya hidup, terutama diet dan olah raga, adalah yang utama dalam penanganan dislipidemia. Pengobatan dislipidemia dapat dibagi menjadi dua yaitu, terapi non farmakologis dan terapi farmakologis (Field et al., 2006; Rader dan Hobbs, 2014). Keputusan untuk memulai terapi farmakologis tergantung pada level risiko kardiovaskular. NCEP ATP III guidelines merekomendasikan untuk menghitung risiko absolut kejadian kardiovaskular dalam 10 tahun dengan sistem Framingham Heart Study, penderita dengan risiko melebihi 20% dianggap risikonya ekuivalen dengan penyakit jantung koroner sehingga harus ditangani dengan agresif seperti pada penderita dengan penyakit jantung koroner (Rader dan Hobbs, 2014). Sepanjang abad kedua puluh satu, ilmu kesehatan difokuskan pada penyembuhan penyakit dengan obat-obatan, pemeriksaan diagnostik yang canggih dan terapi yang efektif. Dalam beberapa tahun terakhir, terdapat tren yang mendukung pengembangan suplemen makanan alami dan obat-obatan herbal karena 130 adanya bukti ilmiah yang mengkonfirmasi manfaat kesehatan dari ekstrak dan senyawa bioaktif yang diisolasi dari tanaman. Fitokonstituen dengan aktivitas biologis yang signifikan sebagian besar merupakan metabolit sekunder, seperti flavonoid, carothenoids, anthocyanin, protein dan peptida, serta enzim dan vitamin yang diproduksi secara alami oleh tanaman (Sharma et al., 2009; Gawel-Beben et al,. 2015). Gula merupakan bagian yang tidak dapat dipisahkan dari makanan sehari-hari kita. Penelitian oleh Welsh et al. (2010) menemukan bahwa peningkatan konsumsi gula yang terjadi di masyarakat belakangan ini terkait dengan peningkatan LDL kolesterol dan trigliserida serta penurunan HDL kolesterol. Pemanis buatan merupakan makanan tambahan yang menyerupai gula dari segi rasanya, namun dengan energi makanan yang lebih rendah. Penelitian pada binatang menunjukkan bahwa pemanis buatan menyebabkan peningkatan berat badan, tumor otak, tumor kandung kencing dan berbagai bahaya kesehatan lainnya (Jahan, 2010; Gupta et al., 2014). Stevia rebaudiana merupakan jenis tanaman dari famili bunga matahari (Asteraceae) yang sering disebut dengan daun manis ataupun daun gula, tanaman ini berasal dari daerah Brazil dan Paraguay. Walaupun terdapat lebih dari 200 macam spesies dari genus stevia hanya stevia rebaudiana yang memberikan rasa manis. Tanaman ini telah digunakan sejak lebih dari 1500 tahun yang lalu oleh kaum Guirani 131 di Paraguay sebagai pemanis ataupun obat-obatan. Daunnya telah banyak digunakan sebagai obat tradisional untuk diabetes (Sharma et al., 2009; Gupta et al., 2014). Stevia merupakan pemanis natural yang memiliki rasa manis 200-300 kali dari gula. Stevioside merupakan satu dari delapan glikosida yang memberikan rasa manis pada stevia rebaudiana paling tinggi, memiliki stabilitas kimia yang baik (Jahan, 2010; Gupta et al., 2014). Ekstrak stevia menjadi sangat populer dan sekarang digunakan sebagai pemanis secara komersial dengan pasar di atas 50%. Stevia digunakan sebagai pemanis mulai dari saus kedelai, sayur–sayuran hingga minuman ringan. Sebagai pemanis tanpa kalori, tanpa penambahan bahan kimia dan tanpa menimbulkan efek samping yang serius, stevia cepat popular di seluruh dunia (Raini dan Isnawati, 2011). Disamping rasa manis natural yang dimilikinya, stevia tidak memberikan after-taste dan aman dan bersifat non toksik berdasarkan penelitian yang dilakukan di Jepang. Stevia memberikan banyak manfaat termasuk efek anti-hipertensi, anti diabetik, melalui perbaikan kerja insulin pada sistem transpor glukosa otot, efek antiinflamasi, anti tumor, antioksidan serta efek imunomodulator (Sharma et al., 2009; McCarty, 2012; Gupta et al., 2014). Stevia merupakan sumber antioksidan natural, berbagai antioksidan diperoleh dari ekstrak stevia rebaudiana, meliputi opigenin, kaempferol, dan quereitrin yang 132 menghambat kerusakan rantai DNA. Isosteviol yang merupakan turunan dari stevioside menghambat pembentukan reactive oxygen species (ROS). Stevia juga kaya beta karoten, asam askorbat, protein, kalsium, zat besi, magnesium, fosfor dan fitokimia lainnya (Gupta et al., 2014). Banyak penyakit termasuk proses penuaan terkait dengan produksi yang tidak terkontrol dari radikal bebas turunan oksigen. Ketika mekanisme perlindungan antioksidan menjadi tidak seimbang akibat berbagai faktor seperti penuaan, penurunan fungsi fisiologis dapat terjadi berupa timbulnya penyakit ataupun percepatan penuaan. Hal ini menimbulkan ketertarikan yang besar terhadap bahan makanan natural, tanaman obat dan fitokonstituen karena kemampuannya untuk mengikat radikal bebas sebagai antioksidan (Jahan, 2010). Terdapat dua studi pada tikus diabetes serta satu studi pada tikus dengan diet tinggi lemak yang menunjukkan penurunan level serum lipid dengan pemberian ekstrak daun stevia. Penelitian pada tikus diabetes ditujukan pada efek daun stevia terhadap gula darah dengan pemeriksaan lipid sebagai tambahan. Aktivitas antihiperlipidemik dari stevia rebaudiana diduga dikarenakan adanya flavonoid, asam askorbat dan bahan lainnya (Park dan Cha, 2010; Hossain et al., 2011; Singh et al., 2013). Sebuah studi pemberian ekstrak stevia pada wanita hiperkolesterol menunjukkan penurunan total kolesterol, trigliserida dan LDL kolesterol secara 133 signifikan disertai dengan peningkatan HDL kolesterol dalam angka yang memuaskan. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak stevia memiliki efek hipolipidemik dan dapat digunakan untuk menurunkan risiko penyakit kardiovaskular di masa depan (Sharma, 2009). Penelitian lainnya dengan pemberian stevioside, komponen aktif stevia, secara double–blind pada penderita hipertensi menunjukkan tidak terdapat perubahan yang bermakna pada profil lipid dengan pemberian stevioside (Chan et al., 2000). Penelitian oleh Savita, et al (2004) terhadap pemberian ekstrak stevia pada penderita hipertensi dan diabetes juga menunjukkan perbaikan profil lipid, namun tidak bermakna. Kerja antihiperlipidemik dari stevia diduga terkait dengan kandungan konstituen di dalamnya, meliputi flavonoid, saponin, tannin, triterpin dan alkaloid. Flavonoid telah diketahui memiliki aktivitas biologisnya yang luas termasuk aktivitas hipolipidemik dari kerja antioksidannya. Kapasitas penurunan lipid dari tanaman ini diperkirakan berasal dari konstituennya yang bekerja menghambat enzim hydroxylmethyl-glutaryl-CoA reductase yang berperan dalam biosintesis kolesterol secara de novo (Hossain et al., 2011). Penelitian oleh Park dan Cha (2010) menemukan bahwa suplementasi ekstrak stevia meningkatkan ACO, PPAR α, dan level mRNA ACC di hati, sehingga meningkatkan level ACS dan CPT-I mRNA di hati. Penelitian ini menemukan bahwa 134 ekstrak stevia menyebabkan up-regulation proses kode gen enzim pada oksidasi asam lemak di hati melalui aktivasi PPAR, sehingga didapatkan bahwa ekstrak stevia mencegah obesitas dan gejala terkait obesitas, termasuk hyperlipidemia dan penyakit kardiovaskular. Stevioside, kandungan aktif stevia rebaudiana, menginduksi Lxr α di jaringan adipose sehingga terjadi peningkatan ekspresi Fabp4 yang memperbaiki metabolisme asam lemak. Stevioside juga memperbaiki pertahanan antioksidan melalui peningkatan ekspresi SOD, yang berhubungan dengan penurunan akumulasi LDL teroksidasi di sirkulasi dan pembuluh darah (Geeraert, 2010). Beberapa penelitian tentang pemberian ekstrak stevia menunjukkan hasil yang positif terhadap perbaikan profil lipid, namun beberapa lainnya menunjukkan hasil yang tidak signifikan. Sebagian besar penelitian terdahulu lebih berfokus pada efek stevia pada gula darah dengan menyertakan pemeriksaan profil lipid sebagai tambahan. Hasil penelitian yang masih kontroversial tentang pengaruh daun stevia terhadap profil lipid membuat penulis tertarik untuk melakukan penelitian tentang pemberian ekstrak daun stevia dalam mencegah dislipidemia, mengingat fungsinya yang luas bagi kesehatan dan bagi anti aging medicine. Penelitian ini dilakukan pada tikus dengan pertimbangan sudah ada konversi dosis tikus ke manusia yang rasional, dan untuk memudahkan pengendalian faktor- 135 faktor seperti umur, aktivitas fisik, diet, obat-obatan/suplemen dan juga faktor genetik dan keturunan. 1.2. Rumusan Masalah Berdasarkan uraian latar belakang masalah di atas, maka dapat dirumuskan masalah dalam penelitian ini sebagai berikut: 1. Apakah ekstrak etanol daun stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kgBB secara oral mencegah peningkatan kadar kolesterol total pada tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol? 2. Apakah ekstrak etanol daun stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kgBB secara oral mencegah peningkatan kadar LDL kolesterol pada tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol? 3. Apakah ekstrak etanol daun stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kgBB secara oral mencegah peningkatan kadar trigliserida pada tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol? 4. Apakah ekstrak etanol daun stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kgBB secara oral mencegah penurunan kadar HDL kolesterol pada tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol? 1.3. Tujuan Penelitian I.3.1. Tujuan Umum 136 Secara umum tujuan penelitian ini ialah untuk membuktikan pemberian ekstrak etanol daun stevia rebaudiana mencegah dislipidemia pada tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol. I.3.2. Tujuan Khusus Tujuan yang ingin dicapai pada penelitian ini dapat diuraikan sebagai berikut: 1. Membuktikan pemberian ekstrak etanol daun stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kgBB secara oral mencegah peningkatan kadar kolesterol total pada tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol. 2. Membuktikan pemberian ekstrak etanol daun stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kgBB secara oral mencegah peningkatan kadar LDL kolesterol pada tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol. 3. Membuktikan pemberian ekstrak etanol daun stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kgBB secara oral mencegah peningkatan kadar trigliserida pada tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol. 4. Membuktikan pemberian ekstrak etanol daun stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kgBB secara oral mencegah penurunan kadar HDL kolesterol pada tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol. 1.4. Manfaat Penelitian 1.4.1. Manfaat Ilmiah 137 Menambah wawasan ilmu pengetahuan dan pengembangan ilmiah tentang penggunaan ekstrak etanol daun stevia rebaudiana oral dalam mencegah dislipidemia. Hasil penelitian ini dapat menjadi dasar dan acuan untuk penelitian selanjutnya. 1.4.2. Manfaat Aplikasi Karena ekstrak etanol daun stevia mencegah dislipidemia maka hasil penelitian dapat disosialisasikan kepada masyarakat sebagai alternatif pencegahan dislipidemia. Mendukung pengembangan penelitian untuk menggunakan bahanbahan natural dalam pencegahan dan pengobatan dislipidemia dalam usaha untuk memperlambat penuaan. 138 BAB II KAJIAN PUSTAKA 2.1. Lipid Lipid adalah senyawa yang terdiri dari karbon dan hydrogen yang mempunyai sifat umum tidak larut dalam air dan larut dalam pelarut bipolar. Kelompok lipid mencakup lemak, minyak, malam (wax), dan senyawa-senyawa lainnya (Mayes, 2003a). Lemak disebut juga lipid, adalah suatu zat yang kaya energy, berfungsi sebagai sumber energy yang utama dalam proses metabolisme tubuh. Lemak yang beredar di dalam tubuh diperoleh dari dua sumber yaitu dari makanan dan hasil produksi organ hati, yang bisa disimpan di dalam sel-sel lemak sebagai cadangan energi (Guyton dan Hall, 2007). Lipid dapat diklasifikasikan menjadi 3, yaitu: 1. Lipid sederhana yaitu senyawa ester asam lemak dengan berbagai alcohol, termasuk di dalamnya lemak dan malam (wax) 2. Lipid kompleks yaitu asam lemak yang mengandung gugus lain selain alcohol dan asam lemak. Dapat dikelompokkan lagi menjadi fosfolipid, glikolipid dan lipid kompleks lainnya, lipoprotein termasuk dalam kelompok ini. 3. Prekursor dan derivate lipid, bentuk ini mencakup asam lemak, gliserol, steroid, senyawa alcohol disamping gliserol serta sterol, aldehid lemak, badan keton, hidrokarbon, vitamin larut lemak serta berbagai hormon (Mayes, 2003a). 139 2.1.1. Metabolisme Lipid Lipid dari intestinal akan diangkut oleh lipoprotein sebagai kilomikron dan dari hati sebagai VLDL, untuk kemudian didistribusikan ke seluruh jaringan tubuh untuk dioksidasi dan ke jaringan adiposa untuk penyimpanan. Kemudian lipid dari jaringan adiposa akan diangkut sebagai asam lemak bebas yang terikat dengan albumin serum (Mayes, 2003b). Di dalam sel-sel hati dan jaringan adiposa, kilomikron segera dipecah menjadi asamasam lemak dan gliserol. Selanjutnya asam-asam lemak dan gliserol tersebut, dibentuk kembali menjadi simpanan trigliserida. Proses pembentukan trigliserida ini dinamakan esterifikasi. Sewaktu-waktu jika kita membutuhkan energi dari lemak, trigliserida dipecah menjadi asam lemak dan gliserol, untuk ditransportasikan menuju sel-sel untuk dioksidasi menjadi energi. Proses pemecahan lemak jaringan ini dinamakan lipolisis (Guyton dan Hall 2007). Asam lemak tersebut ditransportasikan oleh albumin ke jaringan yang memerlukan dan disebut sebagai asam lemak bebas (free fatty acid/FFA). Tidak semua asam lemak bebas berasal melalui lipolisis, dan digunakan sebagai energi. Asam lemak bebas yang tidak dioksidasi akan mengalami reesterifikasi menjadi trigleserida didalam jaringan adiposa maupun hepar atau disimpan intramuskular (Guyton dan Hall 2007). Asam lemak bebas yang digunakan untuk energi diaktifkan oleh enzim asil-KoA sintetase (tiokinase), kemudian dibawa ke dalam mitokondria dengan diubah oleh CPT (Carnitine Palmitoyl Transferase) I menjadi asilkarnitin, kemudian CPT II mengubah kembali asilkarnitin menjadi Asil-KoA dengan melepaskan karnitin. Asil-KoA mengalami oksidasi β menjadi asetil-KoA. Asetil-KoA masuk ke dalam siklus asam sitrat untuk 140 menghasilkan energi. Di sisi lain, jika kebutuhan energi sudah mencukupi, asetil KoA dapat mengalami lipogenesis menjadi asam lemak dan selanjutnya dapat disimpan kembali sebagai trigliserida (Guyton dan Hall 2007; Mayes, 2003d). Langkah-langkah masuknya asil KoA ke dalam mitokondria dijelaskan sebagai berikut (Kathleen et al., 2006): 1. Asam lemak bebas (FFA) diaktifkan menjadi asil-KoA dengan dikatalisir oleh enzim tiokinase. 2. Setelah menjadi bentuk aktif, asil-KoA dikonversikan oleh enzim karnitin palmitoil transferase I (CPT I) yang terdapat pada membran eksterna mitokondria menjadi asil karnitin. Setelah menjadi asil karnitin, barulah senyawa tersebut bisa menembus membran interna mitokondria. 3. Pada membran interna mitokondria terdapat enzim karnitin asil karnitin translokase yang bertindak sebagai pengangkut asil karnitin ke dalam dan karnitin keluar. 4. Asil karnitin yang masuk ke dalam mitokondria selanjutnya bereaksi dengan KoA (Koenzim A) dengan dikatalisir oleh enzim karnitin palmitoil transferase II (CPT II) yang ada di membran interna mitokondria menjadi Asil KoA dan karnitin dibebaskan. 5. Asil KoA yang sudah berada dalam mitokondria ini selanjutnya masuk dalam proses oksidasi β. Asetil-KoA yang dihasilkan oleh oksidasi β ini selanjutnya akan masuk siklus asam sitrat. Sebagian dari Asetil KoA mengalami kolesterogenesis menjadi kolesterol. Selanjutnya kolesterol mengalami steroidogenesis membentuk steroid. Asetil KoA sebagai hasil oksidasi 141 asam lemak juga berpotensi menghasilkan badan-badan keton (aseto asetat, hidroksi butirat dan aseton). Proses ini dinamakan ketogenesis (Guyton dan Hall, 2007). Diet Trigliserida Esterifikasi Lipolisis Steroid Asam lemak Lemak Gliserol Lipogenesis Steroidogenesis Oksidasi beta Kolesterogenesis Karbohidrat Kolesterol Protein Asetil-KoA + ATP Aseto asetat Ketogenesis Siklus asam sitrat ATP hidroksi butirat Aseton H2O CO2 Gambar 2.1. Ikhtisar Metabolisme Lemak 2.1.1.1 Oksidasi Asam Lemak (Oksidasi β) Asam lemak bebas dioksidasi di mitokondria untuk memperoleh energi dalam proses oksidasi β. Pada oksidasi β, asam lemak bebas masuk ke dalam rangkaian siklus dengan 4 142 tahapan proses dan pada setiap proses, 2 atom C diangkat dengan hasil akhir berupa asetil KoA. Selanjutnya asetil KoA masuk ke dalam siklus asam sitrat (Kathleen et al., 2006). Tahapan-tahapan tersebut adalah sebagai berikut (Kathleen et al., 2006) : 1. Reaksi pertama adalah reaksi pembentukan enoil KoA dengan cara oksidasi. Enzim asil KoA dehidrogenase berperan sebagai katalis dalam reaksi ini. Koenzim yang dibutuhkan dalam reaksi ini adalah FAD yang berperan sebagai akseptor hidrogen. Dua molekul ATP dibentuk untuk tiap pasang elektron yang ditransportasikan dari molekul FADH2 melalui sistem transport elektron. 2. Pada reaksi kedua, enzim enoil KoA hidratase merupakan katalis yang menghasilkan Lhidroksiasil KoA. Reaksi ini ialah reaksi hidrasi terhadap ikatan rangkap antara C-2 dan C3. 3. Reaksi ketiga adalah reaksi oksidasi yang mengubah hidroksiasil koenzim A menjadi ketoasil koenzim A. Enzim L-hidrokdiasil koenzim A dehidrogenase melibatkan NAD yang direduksi menjadi NADH. 4. Tahap keempat adalah reaksi pemecahan ikatan C-C, sehingga menghasilkan asetil koenzim A dan asil koenzim A yang mempunyai jumlah atom C dua buah lebih pendek dari molekul semula. Asil KoA yang terbentuk pada reaksi tahap 4, mengalami metabolisme lebih lanjut melalui reaksi tahap 1 hingga tahap 4 dan demikian seterusnya sampai rantai C pada asam lemak bebas terpecah menjadi molekul-molekul asetil KoA yang mengandung 2 atom C dan asil-KoA yang telah kehilangan 2 atom C. Demikian seterusnya hingga hasil yang terakhir 143 adalah 2 asetil-KoA. Asetil-KoA yang dihasilkan oleh oksidasi β ini kemudian akan masuk siklus asam sitrat (Kathleen et al., 2006; Guyton dan Hall, 2007). Sebagian dari asetil-KoA akan berubah menjadi asetoasetat, selanjutnya asetoasetat berubah menjadi hidroksi butirat dan aseton atau badan-badan keton, proses ini dinamakan ketogenesis. Sebagian lain dari asetil KoA dapat diubah menjadi kolesterol melalui proses kolesterogenesis yang selanjutnya dapat digunakan sebagai bahan untuk disintetik menjadi steroid melalui proses steroidogenesis (Guyton dan Hall, 2008). Gambar 2.2.Lintasan Ketogenesis di Hati (Dikutip dari : Guyton dan Hall, 2008). 144 2.1.1.2. Biosintesis Kolesterol Pada hakekatnya semua jaringan tubuh yang mengandung sel-sel berinti mampu mensintesis kolesterol. Banyak faktor mempengaruhi keseimbangan kolesterol dalam jaringan. Peningkatan terjadi akibat ambilan lipoprotein yang mengandung kolesterol oleh reseptor, ambilan kolesterol bebas dari lipoprotein yang kaya kolesterol ke membrane sel, sinstesis kolesterol dan hidrolosis ester kolesteril oleh enzim ester kolesteril hidrolase. Penurunan terjadi akibat aliran keluar kolesterol dari membrane sel ke lipoprotein yang potensial kolesterolnya rendah, esterifikasi kolesterol oleh enzim asil ko-A transferase dan penggunaan kolesterol untuk sintesis senyawa steroid lainnya di hati (Mayes, 2003c). Struktur dasar kolesterol adalah inti sterol. Inti sterol seluruhnya dibentuk dari molekul asetil-KoA. Selanjutnya, inti sterol dapat dimodifikasi dengan berbagai rantai samping untuk membentuk kolesterol, asam kolat (merupakan dasar dari asam empedu yang dibentuk di hati), dan beberapa hormon steroid penting yang diskresi oleh korteks adrenal, ovarium dan testis (Guyton dan Hall, 2008). Terdapat lima tahapan utama dalam biosintesis kolesterol yaitu (Mayes, 2003c): 1. Konversi asetil-KoA menjadi 3-hidroksi-3-metilglutaril-KoA (HMG KoA) dan mevalonat 2. Fosforilasi mevalonat menjadi molekul isoprenoid aktif yaitu isopentenil difosfat bersamaan dengan hilangnya CO2. 3. Pembentukan skualen dari 6 unit isoprenoid. 4. Konversi squalene menjadi lanosterol 5. Konversi lanosterol menjadi kolesterol. 145 Gambar 2.3. Tahapan Biosintesis Kolesterol Sintetis kolesterol melibatkan banyak enzim yaitu asetoasetil-KoA sintetase (thiolase), HMG KoA sintase, HMG KoA reduktase, mevalonat kinase, difosfomevalonat kinase, difosfomevalonat dekarboksilase, isopentenil-difosfat isomerase, cis-prenil transferase, squalene sintetase, squalene eposkisdase, oksidoskualen lanosterol siklase, isomerase dan skualen reduktase (Mayes, 2003c; Guyton dan Hall, 2008). 2.1.2. Transpor Lipid Lemak yang diserap dari makanan dan lipid yang diproduksi oleh hati dan jaringan adipose, harus diangkut ke berbagai jaringan dan organ tubuh untuk digunakan dan disimpan. Karena lipid tidak larut air maka untuk pengangkutannya dalam plasma darah, senyawa lipid 146 non polar harus dikaitkan dengan lipid amfipatik dan protein untuk membentuk lipoprotein yang bisa bercampur dengan air (Mayes, 2003b). Lemak dalam darah diangkut dengan dua cara, yaitu melalui jalur eksogen dan jalur endogen (Rader dan Hobbs, 2014). 1. Jalur eksogen Trigliserida yang berasal dari makanan akan dihidrolisa oleh enzim lipase di lumen usus kemudian diemulsifikasikan oleh asam empedu membentuk misel. Asam lemak rantai panjang bergabung membentuk trigeliserida dan dikemas dengan apo B-48, ester kolesterol, ester retinil, fosfolipid, dan kolesterol membentuk kilomikron. Kilomikron yang baru terbentuk disekresikan ke dalam limfe intestinal dan masuk ke sirkulasi melalui duktus torasikus, diproses di jaringan perifer kemudian masuk ke hati. Kilomikron akan bertemu dengan lipoprotein lipase (LPL) yang melekat di dinding endotel kapiler jaringan adipose, jantung dan otot skeletal. Trigliserid yang ada pada kilomikron akan dihidrolisa oleh LPL dan asam lemak bebas dilepaskan. Asam lemak ini akan diambil oleh jaringan adipose atau miosit dan dapat juga dioksidasi untuk menghasilkan energy ataupun mengalami reesterisfikasi dan disimpan sebagai trigliserid. Apolipoprotein pada pada permukaan kilomikron akan ditransfer ke HDL, menghasilkan kilomikron remnant. Kilomikron remnant kemudian dikeluarkan dari sirkulasi oleh hati melalui proses yang memerlukan apoE sebagai ligan untuk reseptor di hati. 2. Jalur endogen Jalur endogen dari metabolisme lipoprotein mengacu pada sekresi lipoprotein yang mengandung apoB dari hati dan metabolisme partikel kaya trigliserid ini di jaringan perifer. 147 Partikel VLDL menyerupai kilomikron pada komposisi proteinnya namun ia mengandung apoB-100 dan memiliki perbandingan kolesterol terhadap trigliserid yang lebih tinggi. Setelah disekresikan ke plasma VLDL memperoleh banyak apoE dan apoC dari HDL, trigliserid dari VLDL kemudian dihidrolisa oleh LPL, terutama di otot, jantung, dan jaringan adipose. Setelah VLDL remnant terpisah dari LPL, mereka disebut dengan IDL yang mengandung jumlah kolesterol dan trigliserid dalam jumlah yang hampir sama. Hati akan mengeluarkan 40-60% IDL dengan endositosis yang dimediasi oleh reseptor LDL melalui ikatannya dengan apoE. IDL yang tersisa akan diremodeling oleh hepatic lipase untuk membentuk LDL. Selama proses ini, hampir semua trigliserid telah terhidrolisis dan semua apolipoporotein telah ditransfer ke lipoprotein lain, kecuali apoB-100. Kolesterol dalam LDL mencakup lebih dari separuh dari total kolesterol plasma pada sebagian besar orang. Sekitar 70% LDL di sirkulasi dibersihkan melalui endositosis yang dimediasi LDL reseptor di hati 2.1.3. Kolesterol Kolesterol adalah konstituen mayor dari membran sel pada sel hewan. Tubuh dapat mencukupi kebutuhan kolesterol harian dengan mensintesisnya sendiri. Dengan diet campuran hanya setengah dari kolesterol berasal dari biosíntesis endogen di usus, kulit dan sebagian besar di hati (50%); sisanya berasal dari makanan (makanan yang dikonsumsi) (Koolman dan Roehm, 2015). Kolesterol merupakan zat esensial dalam tubuh yang menyusun membran, struktur selaput sel dan merupakan komponen utama sel otak plasma. Kolesterol adalah jenis lemak yang paling dikenal oleh masyarakat dan merupakan bahan perantara untuk pembentukan 148 sejumlah komponen penting seperti vitamin D untuk membentuk dan mempertahankan tulang yang sehat, hormon seks (contohnya Estrogen dan Testosteron) dan asam empedu untuk fungsi pencernaan (Mark et al., 2000). Kolesterol terdapat dalam diet semua orang, dan dapat diabsorbsi dengan lambat dari saluran pencernaan ke dalam saluran limfe , secara spesifik mampu membentuk ester dengan asam lemak. Hampir 70% kolesterol dalam lipoprotein plasma berada dalam bentuk ester kolesterol (Guyton dan Hall, 2007). Kolesterol bebas di dalam sirkulasi diangkut oleh lipoprotein. Ester kolesteril merupakan bentuk penyimpanan kolesterol yang ditemukan pada sebagian besar jaringan tubuh. LDL merupakan perantara ambilan kolesterol dan ester kolesteril ke dalam banyak jaringan. Kolesterol bebas dikeluarkan dari jaringan oleh HDL kemudian diangkut ke hati untuk dikonversi menjadi asam empedu, proses ini dikenal dengan nama pengangkutan balik kolesterol (reverse cholesterol transport) (Mayes, 2003c). Kolesterol adalah substansi menyerupai lemak yang berada di membrane sel dan merupakan precursor dari asam empedu dan hormone steroid. Kolesterol beredar dalam darah dalam bentuk partikel yang mengandung lipid dan protein (Lipoprotein). Terdapat 3 kelas utama dari lipoprotein yang ditemukan dalam darah yaitu low density lipoproteins (LDL), high density lipoproteins (HDL), dan very low density lipoproteins (VLDL). Kelas lipoprotein lainnya, intermediate density lipoprotein (IDL), terletak antara VLDL dan LDL, dalam praktis klinis termasuk dalam perhitungan LDL (Grundy. et al., 2002). 149 Gambar 2.4. Struktur Dasar Kolesterol (Mayes, 2003c) 2.1.4. Lipoprotein Lipid diangkut di dalam plasma sebagai lipoprotein. Lipoprotein terdiri dari inti lipid hidrofobik (trigliserid dan ester kolesteril) yang dikelilingi oleh lipid hidrofilik (fosfolipid, kolesterol tidak teresterifikasi) dan protein yang berinteraksi dengan cairan tubuh. Disamping itu terdapat juga asam lemak bebas dalam jumlah yang jauh lebih sedikit, yang kini dikenal sebagai lipid plasma yang paling aktif secara metabolic (Mayes, 2003b; Rader dan Hobbs, 2014). Empat kelas lipoprotein plasma yang telah diidentifikasikan ialah (Mayes, 2003b): 1. Kilomikron Kilomikron berasal dari penyerapan triasilgliserol di usus, berfungsi sebagai alat transportasi lemak dari usus ke jaringan lain, kecuali ginjal 2. VLDL (very low - density lypoproteins) VLDL berasal dari hati untuk mengeluarkan triasilgliserol dengan mengikatnya di dalam hati dan mengangkutnya menuju jaringan lemak 150 3. LDL (low - density lypoproteins) LDL merupakan tahap akhir katabolisme VLDL, berperan mengangkut kolesterol ke jaringan perifer 4. HDL (high - density lypoproteins) HDL mengikat kolesterol plasma dan mengangkut kolesterol ke hati, juga berperan dalam metabolism VLDL dan kilomikron. Keterangan : A = Protein C = Kolesterol B = Trigeliserida D = Fosfolipid Gambar 2.5. Jenis-Jenis Lipoprotein dalam Darah (Rader and Hobbs, 2005 ) 151 2.1.5. Trigliserida Sebagian besar lemak dan minyak di alam terdiri atas 98-99% trigliserida. Trigliserida adalah suatu ester gliserol. Trigliserida terbentuk dari 3 asam lemak dan gliserol. Apabila terdapat satu asam lemak dalam ikatan dengan gliserol maka dinamakan monogliserida. Fungsi utama trigliserida adalah sebagai zat energi. Lemak disimpan di dalam tubuh dalam bentuk trigliserida. Apabila sel membutuhkan energi, enzim lipase dalam sel lemak akan memecah trigliserida menjadi gliserol dan asam lemak serta melepasnya ke dalam pembuluh darah. Oleh sel-sel yang membutuhkan komponen-komponen tersebut kemudian dibakar dan menghasilkan energi, karbondioksida (CO2), dan air (H2O) (Lichtenstein dan Jones, 2001). 2.1.6. Low Density Lipoprotein (LDL) LDL kolesterol meliputi 60–70% dari total serum kolesterol. LDL mengandung apolipoprotein tunggal yaitu apo B-100 (Apo B). LDL merupakan lipoprotein aterogenik yang utama dan telah diidentifikasikan sebagai target utama dalam terapi penurunan kolesterol, penelitian menunjukkan efikasi bahwa penurunan LDL kolesterol akan menurunkan risiko penyakit jantung koroner (Grundy, et al., 2002). Lipoprotein densitas rendah (LDL) berfungsi membawa kolesterol dari hepar ke jaringan perifer termasuk ke sel otot jantung, pembuluh darah, otak dan lain-lain agar dapat berfungsi sebagaimana mestinya (untuk sintetik membran plasma dan hormon steroid). Partikel LDL mengandung trigliserida sebanyak 10 persen dan kolesterol 60 persen. Kadar LDL plasma tergantung dari banyak faktor termasuk kolesterol dalam makanan, asupan lemak jenuh, kecepatan produksi dan eliminasi LDL. Bila kita makan banyak lemak jenuh 152 atau bahan makanan yang kaya akan kolesterol, maka kadar LDL dalam darah kita tinggi. Kelebihan LDL akan berada dalam darah dengan risiko penumpukan atau pengendapan kolesterol LDL pada dinding pembuluh darah arteri yang diikuti dengan terjadinya aterosklerosis. Oleh karena sifat di atas, maka LDL disebut kolesterol yang aterogenik (Metchinson dan Ball, 2004). 2.1.7. High Density Lipoprotein (HDL) HDL berasal dari hati, ia mengembalikan kolesterol yang terbentuk secara berlebihan di jaringan dan dinding pembuluh darah kembali ke hati. Selama ditranspor, kolesterol diasilasi oleh lechitin cholesterol acytransferase (LCAT). HDL ini mempunyai kandungan lemak lebih sedikit dan mempunyai kepadatan tinggi atau lebih berat sehingga mampu membawa kelebihan kolesterol jahat di pembuluh arteri untuk diproses dan dibuang. Ester kolesterol yang terbentuk tidak lagi bersifat amfipatik dan dapat ditransfer ke inti lipoprotein. HDL juga mendukung perubahan VLDL dan kilomikron dengan bertukar lipid dan apoprotein dengan mereka. .. HDL mencegah kolesterol mengendap di arteri dan mencegah terjadinya atherosklerosis (Mark et al., 2000; Koolman dan Roehm, 2005). HDL biasanya mencakup 20-30% dari total serum kolesterol. Apolipoprotein mayor dari HDL adalah apo A-I dan apo A-II. Level HDL kolesterol berbanding terbalik dengan risiko penyakit jantung koroner. Beberapa bukti bahkan menunjukkan bahwa HDL melindungi dari perkembangan ateroklerosis, walaupun HDL yang rendah dapat juga mencerminkan adanya faktor aterogenik lain (Grundy, et al., 2002). 153 2.1.8. Very Low Density Lipoprotein (VLDL) dan Intermediate Density Lipoprotein (IDL) Sebenarnya VLDL, IDL, dan LDL mirip satu sama lain. VLDL mentranspor triasilgliserol, kolesterol dan fosfolipid ke jaringan lain. Seperti kilomikron, mereka dikonversi menjadi IDL dan LDL oleh lipoprotein lipase. Proses ini juga distimulasi oleh HDL. Sel yang memerlukan kolesterol mengikat LDL melalui interaksi antara reseptor LDL dengan ApoB-100, kemudian mengambil partikel secara keseluruhan melalui endositosis yang dimediasi oleh reseptor (Koolman dan Roehm, 2005). VLDL adalah lipoprotein yang kaya trigliserid, meliputi 10-15% dari total serum kolesterol. Apolipoprotein utamanya dalah apo B-100, apo Cs (C-I, C-II, dan C-III) dan apo E. VLDL diproduksi di hati dan merupakan precursor dari LDL. Beberapa bentuk dari VLDL, terutama VLDL remnant, mendukung terjadinya aterosklerosis =, seperti LDL. VLDL remnant terdiri dari VLDL yang terdegradasi dan kaya ester kolesterol. SebenarnyaIDL termasuk dalam lipoprotein remnant, walaupun dalam prakti sklinis ia termasuk dalam fraksi LDL (Grundy. et al., 2002). 2.2. Dislipidemia Dislipidemia sebagai faktor risiko dari penyakit jantung koroner, dimanifestasikan oleh peningkatan atau penurunan konsentrasi lipoprotein plasma (Fakhrzadeh dan Tabatabaei, 2012). Dislipidemia adalah tingginya level lipid yang diangkut oleh lipoprotein dalam darah (kolesterol, trigliserida ataupun keduanya), termasuk di dalamnya hiperlipoproteinemia (hiperlipidemia) yang mengacu pada tingginya total kolesterol, LDL kolesterol ataupun trigliserida dan juga rendahnya HDL kolesterol (Goldberg, 2015). 154 Secara umum dislipidemia didefinisikan sebagai level total kolesterol, LDL kolesterol, trigeliserida, apoB dan Lp(a) di atas persentil 90 ataupun HDL kolesterol dan ApoA dibawah persentil 10 dari populasi (Fakhrzadeh dan Tabatabaei, 2012). Dislipidemia juga didefinisikan sebagai kelainan metabolisme lipid yang ditandai dengan peningkatan maupun penurunan fraksi lipid dalam plasma. Kelainan fraksi lipid yang utama adalah kenaikan kadar kolesterol total , kolesterol LDL, trigliserida, serta penurunan kolesterol HDL (Muray,1991). Tidak ada batasan yang jelas antara tingkat lipid normal dan abnormal karena pengukuran lipid adalah kontinyu. Sehingga, tidak ada definisi numerik dislipidemia, hubungan linear antara kadar lipid dan risiko kardiovaskular yang menentukan kadar lipid yang memerlukan pengobatan (Goldberg, 2015). Dislipidemia dapat dibagi menjadi dua, yaitu dislipidemia primer dan sekunder. Dislipidemia primer biasanya perubahan level lipoprotein terkait dengan kondisi genetik sedangkan pada dislipidemia sekunder perubahan level lipoprotein terkait dengan penyakit lainnya, seperti obesitas, diabetes, penyakit tiroid, penyakit ginjal, penyakit hati dan konsumsi alkohol, estrogen ataupun pemakaian obat-obatan (Rader dan Hobbs, 2014). 2.2.1 Etiologi Dislipidemia Penyebab primer (genetik) dan sekunder (gaya hidup dan lainnya) berkontribusi terhadap terjadinya dislipidemia dalam berbagai tingkatan. Contohnya familial combined hyperlipidemia hanya akan berekspresi dengan adanya penyebab sekunder yang signifikan (Goldberg, 2015). 155 1. Penyebab Primer Ialah mutasi gen tunggal atau multipel yang menghasilkan overproduksi ataupun defek pada pembersihan trigliserida dan LDL kolesterol, ataupun underproduksi atau pembersihan yang berlebihan dari HDL kolesterol. Yaitu kelainan penyakit genetik dan bawaan yang dapat menyebabkan kelainan kadar lipid dalam darah. 2. Penyebab Sekunder Penyebab sekunder berkontribusi besar terhadap banyak kasus dislipidemia pada orang dewasa. Penyebab sekunder terpenting di negara yang berkembang adalah gaya hidup sedentari dengan asupan makanan berlebihan dari lemak jenuh, kolesterol dan lemak trans. Penyebab sekunder lainnya meliputi diabetes mellitus, penggunaan alkohol yang berlebihan, penyakit ginjal kronik, hipotiroidisme, sirosis bilier primer atau penyakit hati lainnya, dan penggunaan obat-obatan (contohnya: thiazide, β-blockers, retinoid, antiretroviral, siklosporin, takrolimus, estrogen dan progestin dan glukokortikoid) Diabetes merupakan penyebab sekunder yang signifikan karena pasien cenderung memiliki kombinasi kolesterol aterogenik dengan tingginya trigliserida dan small dense LDL kolesterol, dan rendahnya HDL kolesterol (Dislipidemia diabetes). Hal ini dikarenakan konsekuensi dari adanya obesitas, control diabetes yang buruk ataupun keduanya yang dapat menyebabkan peningkatan asam lemak bebas (FFA), yang menyebabkan peningkatan produksi VLDL. VLDL yang tinggi trigliserida kemudian akan mentransfer trigliserida dan kolesterol ke LDL kolsterol sehingga terbentuk small dense LDL kolesterol yang kaya trigliderida dan pembersihan HDL kolesterol. Dislipidemia diabetes biasanya muncul karena adanya peningkatan asupan kalori dan inaktifitas fisik (Goldberg, 2015). 156 2.2.2. Diagnosis Dislipidemia Langkah pertama dalam menangani kelainan lipid adalah menentukan kelas lipoprotein yang meningkat atau menurun pada pasien. Dislipidemia pada umumnya tidak memberikan gejala namun dapat menyebabkan penyakit vascular seperti, penyakit jantung koroner, stroke dan penyakit arteri perifer (Rader dan Hobbs, 2014; Goldberg, 2015). Pedoman skrining oleh Grundy, et al (NCEP-ATP III [Adult Treatment Panel]) untuk abnormalitas lipid merekomendasikan bahwa skrining harus dilakukan paling tidak sekali dalam 5 tahun pada usia diatas 20 tahun. Individu tanpa riwayat penyakit jantung koroner dengan level kolesterol yang memuaskan (<160mg/dL pada individu dengan 0-1 faktor risiko dan <130mg/dL pada individu dengan 2 atau lebih faktor risiko) dapat melakukan skrining ulang dalam 5 tahun. Namun pasien dengan kolesterol di ambang batas tinggi harus melakukan skrining ulang dalam 1-2 tahun. Level memuaskan LDL kolesterol pada penderita penyakit jantung koroner atau yang memiliki risiko ekuivalennya adalah dibawah 100mg/dL, risiko ekuivalen tersebut meliputi penyakit arteri carotid dengan gejala, penyakit arteri perifer, aneurisma aorta abdominal dan diabetes mellitus (Rosenson, 2012). 157 Tabel 2.1. Klasifikasi total kolesterol dan LDL kolesterol berdasarkan ATP III Total kolesterol (mg/dL) LDL kolesterol (mg/dL) <100 Optimal <200 Desireable 100-129 Near optimal 200-239 Borderline high 130-159 Borderline high > 240 High 160-189 High >190 Very high Tabel 2.2. Klasifikasi serum trigliserida berdasarkan ATP III Katagori trigliserida Level Normal <150mg/dL Borderline high 150-199 mg/dL High 200-499 mg/dL Very high >500 mg/dL Tabel 2.3. Klasifikasi HDL kolesterol berdasarkan ATP III Katagori 158 Low HDL <40mg/dL High HDL >60mg/dL (Grundy, et al., 2002) 2.2.3. Penanganan Dislipidemia Gol dari terapi modifikasi lipid adalah pencegahan terjadinya penyakit kardiovaskular aterosklerotik dan komplikasinya. LDL kolesterol merupakan target utama terapi dislipidemia, hal ini dikarenakan peningkatan LDL kolesterol merupakan faktor risiko kuat terjadinya penyakit jantung koroner. Penelitian juga menunjukkan bahwa LDL kolesterol merupakan lipoprotein aterogenik yang paling banyak, peran LDL kolesterol dalam aterogenesis terbukti pada kelainan genetik dimana LDL kolesterol meningkat tajam tanpa adanya faktor risiko lain (Grundy, et al., 2002; Rader dan Hobbs, 2014). Terapi untuk menurunkan lipid memegang peranan penting dalam pencegahan primer dan sekunder dari penyakit kardiovascular. Penilaian terhadap risiko absolute, pengobatan faktor risiko yang dapat dimodifikasi dan optimalisasi gaya hidup, terutama diet dan olah raga, adalah pusat dari penanganan semua kasus. Pasien dengan risiko absolute kardiovaskular yang tinggilah yang akan mendapatkan keuntungan terbesar dengan pengobatan. Pasien dengan risiko tinggi harus mencapai HDL kolesterol >38mg/dL, trigliserida<180mg/dL dan LDL kolesterol < 76mg/dL. Secara umum total kolesterol harus dibawah 190mg/dL selama terapi dan <150mg/dL pada pasien dengan risiko tinggi ataupun untuk pencegahan sekunder dari penyakit kardiovaskular (Field et al., 2006). ATP III merekomendasikan LDL kolesterol sebagai target terapi, gol untuk masingmasing kategori risiko ialah (Grundy, et al., 2002): 159 Tabel 2.4. Target terapi LDL kolesterol menurut ATP III Level risiko Gol LDL kolesterol CHD dan CHD risk equivalent < 100mg/dL Multiple (2+) risk factor <130 mg/dL 0-1 risk factor <160mg/dL Penanganan dislipidemia dibagi 2 yaitu terapi non farmakologi dan terapi farmakologi (Grundy, 2006,; Field et al., 2006; Rader dan Hobbs, 2012). A. Terapi Non Farmakologi dapat dilakukan dengan : 1. Melakukan terapi diet. Modifikasi diet merupakan komponen penting dalam penanganan dislipidemia. Terapi diet bertujuan untuk menurunkan asupan lemak total, asam lemak jenuh, dan kolesterol secara progresif dan untuk mencapai berat badan yang diinginkan. Pasien dengan peningkatan LDL kolesterol harus melakukan restriksi diet lemak jenuh dan kolesterol. Pada pasien dengan hipertrigliserida asupan karbohidrat sederhana harus dibatasi dan pada hipertrigliserida yang berat, restriksi total asupan lemak sangat kritis. Diet kolesterol dan asam lemak jenuh memicu penurunan pengeluaran LDL di hati. Respon terhadap diet biasanya mulai terlihat hasilnya setelah 3-4 minggu dan penyesuaian diet perlu dilakukan secara gradual. Penurunan berat badan, bahakan 160 yang minimal, akan menurunkan risiko kardiovaskular, terutama pada pasien dengan obesitas. 2. Perbaikan gaya hidup (Therapeutic Lifestyle Change). Komponen-komponen Therapeutic Lifestyle Change (TLC) meliputi pengurangan asupan-asupan dari kolesterol dan asam lemak jenuh, pemilihan makanan yang berhubungan dengan aturan makan untuk mengurangi LDL seperti stanol dan sterol serta peningkatan masukan serat yang dapat larut, penurunan berat badan, dan peningkatan aktivitas fisik. Penurunan berat badan, bahkan yang minimal, akan menurunkan risiko kardiovaskular, terutama pada pasien dengan obesitas. Level trigliserida dan LDL kolesterol cenderung turun dan HDL kolesterol cenderung meningkat pada penderita obesitas yang mengalami penurunan berat badan. Terapi non farmakologi ini hendaknya menjadi terapi utama untuk dislipidemia, kecuali untuk pasien dengan hiperkolesterolemia familial (secara bawaan/genetik mempunyai kelainan metabolisme lipoprotein/kolesterol) atau hiperlipidemia gabungan yang bersifat familial, yaitu penanganan terapinya dengan pengaturan makanan dan terapi dengan obat dimulai secara bersamaan (Grundy, 2006). B. Terapi Farmakologi Keputusan untuk menggunakan obat-obatan tergantung pada risiko kardiovaskular yang dimiliki. Terapi hiperkolesterolemia pada penderita penyakit kardivaskular dan bahkan pada pasien dengan risiko kardiovaskular sangatlah menguntungkan (Grundy, et al., 2002). 161 Obat antidislipidemik adalah obat yang ditujukan untuk menurunkan/meningkatkan kadar lipid/lemak di dalam darah/plasma. Pemberian obat antidislipidemik dapat diberikan dalam menangani kasus dislipidemia apabila dengan terapi diet dan olah raga kondisi pasien tidak responsive (Illingworth, 2002). Efek terapi farmakologi dapat diperiksa setelah 6 minggu (12 minggu untuk fibrat). Pada pemeriksaan ulang perlu dievaluasi efek samping yang timbul, respon penurunan lipid, level creatinin kinase dan fungsi hati (Field et al., 2006). Obat antidislipidemik yang beredar di Indonesia dapat dibagi sebagai berikut (Grundy, 2006; Rader dan Hobbs, 2012): 1. Penghambat HMG-KoA Reduktase (3 Hidroksi 3 Metil Glutaril Ko - Enzim A Reduktase Inhibitor). Statin yang merupakan obat pilihan utama pada terapi dislipidemia. HMG Ko-A adalah enzim kunci dalam biosintesis kolesterol. Golongan obat ini menghambat pembentukan kolesterol dengan cara menghambat kerja enzim HMG KoA reduktase yang ada di jaringan hati yang memproduksi mevalonate, molekul kecil yang digunakan untuk mensintesa kolesterol dan derivat mevalonat, sehingga sintesis kolesterol akan menurun. Dengan menghambat sintesis kolesterol, statin menyebabkan peningkatan aktivitas reseptor LDL hati sebagai mekanisme counter-regulatory dan akhirnya mempercepat pembersihan LDL yang ada di sirkulasi. Juga terjadi peningkatan pembersihan precursor LDL, IDL, sehingga terjadi penurunan sekunder dari sintesis LDL kolesterol. Statin juga dapat menurunkan trigliserid tergantung pada dosis, yang biasanya proporsional dengan penurunan LDL kolesterol. Golongan ini dapat menurunkan 162 kolesterol total, LDLkolesterol dan trigliserida, juga meningkatkan HDL (Field et al., 2006; Rader dan Hobbs, 2014). 2. Penghambat absorbsi kolesterol (Ezetimibe) Kolesterol yang berada di intestinal adalah turunan dari diet (sekitar sepertiga) dan dari asam empedu ( sekitar dua per tiga), diserap secara aktif oleh enterosit melalui proses yang melibatkan protein NPC1L1. Ezetimibe terikat secara langsung pada protein NPC1L1 dan memblok absorbsi kolesterol dari intestinal. Ezetimibe menghambat absorbsi kolesterol sampai dengan 60%, sehingga menurunkan pengiriman sterol dari diet ke hati dan meningkatkan ekspresi reseptor LDL kolesterol hati. 3. Sekuestran Asam Empedu (Resin) Golongan obat ini mengikat asam empedu di intestinal dan merangsang sekresinya. Untuk mempertahankan jumlah asam empedu, hati akan mengalihkan kolesterolnya untuk sintesis asam empedu. Penurunan kolesterol intraselular di hati akan menyebabkan upregulation reseptor LDL dan meningkatkan pembersihan LDL kolesterol dari sirkulasi. 4. Asam nikotinat Asam nikotinat (nicotinic acid) atau niasin adalah vitamin B komplek yang telah digunakan sebagai agen modifikasi lipid sejak lebih dari 5 dekade. Niasin menurunkan aliran asam lemak non-ester ke hati, yang diperkirakan menimbulkan penurunan sintesis trigliserida hati dan sekresi VLDL. Belakangan ini ditemukan adanya reseptor asam nikotinat (GPR109A) yang menekan pelepasan asam lemak 163 non-ester oleh jaringan adipose, yang memediasi efek niasinpada supresi asam lemak non-ester. Niasin menurunkan trigliserida dan LDL kolesterol, serta meningkatkan HDL kolesterol. Niasin adalah satu-satunya obet penurun lipid yang menurunkan Lp(a), sampai dengan 40%. 5. Turunan Asam Fibrat (Fibrat) Turunan asam fibrat adalah agonis PPAR α, reseptor yang terlibat dalam pengaturan metabolism lipid. Fibrat merangsang aktivitas lipoprotein lipase sehingga hidrolisis trigliserida meningkat, menurunkan sintesis ApoC-III sehingga meningkatkan pembersihan lipoprotein remnant, merangsang oksidasi beta dari asam lemak dan menurunkan VLDL kolesterol. Fibrat adalah obat yang paling efektif dalam menurunkan trigliserida dan meningkatkan HDL kolesterol secara moderat. 2.3. Diet Terkait Kolesterol Rekomendasi diet kolesterol harian saat ini adalah di kisaran 200-300 mg per hari. Pada individu yang sehat tanpa diabetes, penyakit jantung dan hiperkolesterol rekomendasi asupan yang dianjurkan adalah di bawah 300 mg per hari, sedangkan pada individu dengan resiko tinggi rekomendasi yang disarankan adalah di bawah 200 mg. Rekomendasi asupan kolesterol oleh Institute of Medicine ialah serendah mungkin (Kanter, et al., 2012). Tubuh dapat mencukupi kebutuhan kolesterol harian dengan mensintesisnya sendiri. Orang dewasa muda mensintesis kolesterol sekitar 1 gr per hari dan mengkonsumsi sekitar 0.3gr per hari. Dengan tambahan asupan diet, setengah dari kolesterol berasal dari biosíntesis 164 endogen yang sebagian besar di hati, juga di usus dan kulit (50%); sisanya berasal dari makanan (makanan yang dikonsumsi). Level kolesterol dalam darah yang konstan di kisaran 150-200 mg/dL dipertahankan terutama oleh pengontrolan sintesis secara de novo. Sintesis kolesterol diatur sebagian oleh asupan kolesterol (Koolman dan Roehm, 2015; King, 2016). Laporan terbaru dari berbagai intervensi klinis menunjukkan bahwa peningkatan asupan kolesterol menyebabkan peningkatan kolesterol LDL dan kolesterol HDL pada subyek yang responsif terhadap tantangan diet kolesterol (Sekitar 25% populasi), baik anakanak, dewasa muda ataupun orang tua. Pada kondisi tertentu asupan kolesterol meningkatkan kolesterol HDL saja, tanpa peningkatan kolesterol LDL, seperti pada kasus intervensi penurunan berat badan, asupan satu telur per hari ataupun faktor lainnya (Kanter, et al., 2012). Bukti epidemiologi saat ini mengindikasikan bahwa asupan kolesterol tidak meningkatkan resiko penyakit jantung pada individu yang sehat. Studi klinis menunjukkan bahwa dua per tiga atau lebih dari populasi tidak memiliki peningkatan yang bermakna setelah pemberian asupan kolesterol dalam waktu yang lama, dan mereka yang berespon akan mengalami peningkatan kolesterol HDL dan kolesterol LDL sehingga rasio kolesterol LDL terhadap kolesterol HDL tetap terjaga (Kanter, et al., 2012). 2.4. Penuaan (Aging) Penuaan (aging) oleh gerontologis didefinisikan sebagai penurunan struktur dan fungsi molekul, sel, jaringan, organ dan organisme secara gradual, progresif dan berbahaya yang terjadi setelah kematangan seksual tercapai. Penuaan juga didefiniskan sebagai perburukan fungsi secara umum dan progresif yang mengakibatkan hilangnya respon 165 adaptasi terhadap stress dan berkembangnya risiko penyakit terkait penuaan (Colledge , 2006; Martin, 2014). Penuaan merupakan proses multifaktorial dan sangat kompleks yang menyebabkan deteriorasi fungsional secara gradual. Proses ini biasanya terjadi setelah maturitas, mengarah ke disabilitas dan kematian. Bahkan bila para ilmuwan menemukan obat untuk semua penyakit degenerative kronis, usia harapan hidup hanya akan bertambah sekitar 12 tahun dan orang akan tetap meninggal akibat komplikasi proses penuaan. Tanda penuaan akan tampak setelah maturitas ketika kesehatan, kekuatan dan penampilan berada dalam kondisi terbaik. Pada beberapa tahun terakhir stress oksidatif terbukti terlibat dalam berbagai proses, penyakit dan sindrom degeneratif, bahkan mungkin termasuk faktor yang mendasari proses penuaan itu sendiri (Poljsak dan Milisav, 2013). Terdapat banyak teori tentang terjadinya proses penuaan, Denham Harman merupakan orang yang pertama mengajukan teori penuaan terkait dengan radikal bebas pada tahun 1950an, yang meluas ke ide tentang produksi spesies oksigen reaktif oleh mitokondria di tahun 1970an. Selain teori radikal bebas, terdapat beberapa teori penuaan, yaitu hipotesis pemendekan telomere, teori siklus sel reproduksi, teori wear and tear, teori mitohormesis, teori disposable soma dan teori-teori lainnya. Bukti menunjukkan keterkaitan semua teori ini terhadap kerusakan sel merupakan konsekuensi dari paparan spesies oksigen reaktif (Poljsak dan Milisav, 2013). 166 Gambar 2.6. Stres Oksidatif sebagai Demoninator Mayor Teori Penuaan (Poljsak dan Milisav, 2013) Komponen tubuh tidak dapat berkembang setelah mencapai usia dewasa, bahkan terjadi penurunan akibat proses penuaan. Pada umumnya, orang menganggap menjadi tua memang harus terjadi dan sudah ditakdirkan. Padahal terdapat banyak faktor yang menyebabkan orang mengalami proses penuaan, yang kemudian menyebabkan sakit dan akhirnya kematian. Penuaan bukanlah proses intrinsic, karena penuaan terjadi akibat interaksi dengan lingkungan sekitar. Walaupun gen berperan dalam proses penuaan, kontributor utama terletak pada banyaknya kerusakan random yang dibiarkan karena mekanisme housekeeping sel somatic yang tidak efesien (Colledge , 2006; Pangkahila, 2011). Berbagai faktor itu dapat dikelompokkan menjadi faktor internal dan faktor eksternal. Faktor internal meliputi radikal bebas, hormon yang berkurang, glikosilasi, metilasi, apoptosis, sistem kekebalan yang menurun, dan gen. Faktor eksternal yang utama ialah gaya hidup tidak sehat, diet tidak sehat, kebiasaan salah, polusi lingkungan, stres dan kemiskinan (Pangkahila, 2011). Bila faktor penyebab itu dapat dihindari, maka proses penuaan dapat dicegah, diperlambat, bahkan mungkin dihambat, sehingga kualitas hidup dapat dipertahankan. 167 Dengan demikian usia harapan hidup menjadi lebih panjang dengan kualitas hidup yang baik (Pangkahila, 2011). 2.4.1. Tanda Penuaan Penurunan fungsi akibat penuaan akan menimbulkan tanda dan gejala terkait yang pada dasarnya dapat dibagi menjadi dua, yaitu tanda fisik seperti berkurangnya massa otot, peningkatan lemak, kulit berkerut ataupun gangguan fungsi seksual dan tanda psikis, seperti menurunnya gairah hidup, sulit tidur, mudah cemas, mudah tersinggung dan merasa tidak berarti lagi (Pangkahila, 2011). Konsekuensi sistemik dari proses penuaan sangat luas, namun dapat dikelompokkan menjadi 4 kelompok utama, yaitu (Ferrucci dan Studenski, 2014): 1. Komposisi tubuh, perubahan komposisi tubuh mungkin merupakan efek penuaan yang paling nyata dan tidak terhindarkan. Berat badan cenderung meningkat sampai dengan usia pertengahan, kemudian menurun setelah usia 65-70 tahun. Lean body mass menurun setelah dekade ketiga kehidupan dan massa lemak meningkat pada usia pertengahan. Demineralisasi dan modifikasi arsitektur tulang secara progresif yang menurunkan kekuatan tulang terjadi lebih awal pada wanita dibandingkan pria. 2. Keseimbangan antara ketersediaan dan kebutuhan energy, energi yang dibutuhkan tubuh saat istirahat (Resting metabolic rate –RMR) biasanya menurun terkait dengan penuaan hal ini dikarenakan penurunan lean body mass, jaringan yang aktif secara metabolik. Namun pada orang dengan homeostasis yang tidak stabil akibat penyakit biasanya memerlukan energy yang lebih tinggi untuk mekanisme kompensasi. 168 3. Jaringan signaling untuk mempertahankan homeostasis, jalur signaling utama melibatkan hormone, mediator inflamasi dan antioksidan. Level hormone seks menurun seiring dengan penuaan sedangkan perubahan hormone lainnya tidak terlalu terlihat. Pada orang tua ditemukan kondisi pro-inflamasi ringan walaupun ia sehat, yang ditandai dengan peningkatan marker pro-inflamasi (IL-6 dan CRP). Penuaan juga berhubungan dengan peningkatan kerusakan akibat stress oksidatif, yang dikarenakan peningkatan produksi spesies oksigen reaktif ataupun kerja buffer anti oksidan yang kurang efektif. Hormon, mediator inflamasi dan anti oksidan berintegrasi membentuk jaringan signaling kompleks sehingga strategi terapi tunggal terhadap salah satunya saja menjadi tidak efektif bahkan counter-productive. 4. Neurodegenerasi, neuron berhenti bereproduksi saat kelahiran dan jumlahnya menurun sepanjang kehidupan. Atropi otak terjadi setelah usia 60 tahun, hal ini dapat menyebabkan penurunan fungsi kognitif dan motorik. Proses penuaan berlangsung melalui 3 tahap sebagai berikut (Pangkahila, 2011): 1. Tahap Subklinik (Usia 25-35 tahun) Pada tahap ini sebagian besar hormone tubuh mulai menurun dan pembentukan radikal bebas mulai mempengaruhi tubuh. Kerusakan ini biasanya tidak tampak dari luar dan orang merasa dan tampak normal. 2. Tahap Transisi ( Usia 35-45 tahun) Pada tahap ini hormone menurun sampai dengan 25% dan massa otot berkurang 1kg setiap beberapa tahun , sehingga tenaga dan kekuatan terasa hilang. Komposisi lemak tubuh juga bertambah sehingga menyebabkan resistensi insulin dan meningkatnya 169 risiko penyakit jantung dan obesitas. Gejala mulai tampak dan orang mulai merasa tidak muda lagi dan tampak lebih tua. 3. Tahap Klinik (Usia 45 tahun ke atas) Pada tahap ini penurunan kadar hormone terus berlanjut, juga terjadi penurunan penyerapan bahan makanan, penurunan densitas tulang dan massa otot menurun, serta peningktan lemak tubuh dan berat badan. Penyakit kronis menjadi lebih nyata dan sistem organ mulai mengalami kegagalan. 170 2.4.2. Biomarker Penuaan Penuaan dapat diketahui dengan mengukur atau melihat tanda atau perubahan yang terjadi dibandingkan sebelumnya, yang disebut biomarker. Tanda atau perubahan yang terjadi dapat digunakan sebagai parameter. Dalam kaitan dengan penyakit tertentu, biomarker merupakan parameter adanya penyakit atau berat ringannya suatu penyakit (Pangkahila, 2011). Salah satu cara untuk mengetahui biomarker penuaan adalah dengan pemeriksaan biokimia. Pemeriksaan profil lipid termasuk dalam pemerksaan biokimia, meliputi pemeriksaan kadar kolesterol total, kolesterol LDL, trigliserida, dan kolesterol HDL. Pemeriksaan profil lipid dilakukan untuk mengetahui risiko penyakit kardiovaskular (Pangkahila, 2011). Biomarker penuaan berkaitan erat dengan fungsi berbagai organ tubuh yang menunjang aktivitas sehari-hari. Dengan demikian biomarker berkaitan erat juga dengan kualitas hidup. Karena itu pemeriksaan adanya tanda atau perubahan akibat proses penuaan seharusnya dilakukan sebelum muncul keluhan dan gangguan dalam aktivitas hidup seharihari (Pangkahila, 2011). 2.4.3. Hubungan Dislipidemia dan Aging Studi longitudinal menunjukkan bahwa total kolesterol meningkat pada laki-laki setelah pubertas sampai dengan usia 50 tahun, diikuti dengan kondisi plateau sampai dengan usia 70 tahun, kemudian akan menurun secara perlahan-lahan. Pada wanita, serum kolesterol sedikit lebih tinggi dari laki-laki saat usia 20-25 tahun. Antara usia 25-50 tahun serum kolesterol pada wanita meningkat secara lebih lambat dibandingkan pada laki-laki. Level kolesterol pada usia 55-60 tahun sebanding antara wanita dan laki-laki dan pada usia yang 171 lebih tua wanita cenderung memiliki level kolesterol yang lebih tinggi dibandingkan pria (Rosenson, 2015). Kolesterol total diketahui berada pada level tertinggi pada dekade usia keenam, kemudian menurun dengan meningkatnya usia. Pasien diatas usia 65 tahun memiliki prevalensi hiperlipidemia yang tinggi, dengan level total kolesterol diatas 240mg/dL pada sekitar 25% laki-laki dan 42% wanita. Dislipidemia terkait penuaan lebih jelas pada wanita dibandingkan pria, terkait dengan itu angka kejadian penyakit jantung koroner lebih tinggi pada wanita usia 65 tahun ke atas (Shao et al., 2011). Pada pencegahan primer dan sekunder, terapi penurunan kolesterol akan menurunkan kejadian kardiovaskular secara setara baik pada orang tua maupun pada orang yang lebih muda. Orang tua dengan riwayat penyakit jantung dan peningkatan level kolesterol akan mendapatkan penurunan risiko absolut yang lebih besar dengan terapi dibandingkan dengan orang dengan usia yang lebih muda. Berdasarkan beberapa penelitian terbukti bahwa terapi dislipidemia pada orang tua efektif menurunkan risiko kejadian kardiovaskular pada orang dengan risiko sedang dan risiko tinggi (Shao et al., 2011 ). Hubungan antara hiperkolesterolemia dengan penyakit jantung koroner (PJK) pada orang tua laki-laki dan wanita telah terbukti pada banyak penelitian besar. Framingham Heart Study menunjukkan risiko relative berkembangnya gejala PJK ialah 1.5 pada laki-laki dan 2.3 pada wanita dengan level total kolesterol 90 persentil dibandingkan dengan mereka yang level kolesterolnya dibawah 200mg/dL. Level HDL kolesterol yang rendah juga merupakan faktor risiko, risiko relative mortalitas akibat PJK pada kasus HDL kolesterol yang rendah ialah 4.9 pada laki-laki dan 2.0 pada wanita (Rosenson, 2015). 172 Dislipidemia dapat menyebabkan stress oksidatif dalam tubuh, yaitu terjadi peningkatan produksi radikal oksigen oleh sel endotel. Peningkatan kadar radikal oksigen akan menyebabkan degradasi NO serta produksi radikal bebas lainnya. (Winarsi, 2007) Peningkatan radikal bebas pada dislipidemia berkaitan dengan peningkatan oksidasi LDL, glikasi protein dan autooksidasi glukosa. Hal ini akan menimbulkan penumpukan produk peroksidasi lipid lebih lanjut (Rui-Li et al., 2008). Kolesterol plasma meningkat seiring dengan usia sama dengan insiden coronary artery disease (CAD). Pada penuaan terdapat perubahan ultrastruktur dari sel endotel sinusoidal, perubahan postprandial lipemia, resistensi insulin yang diinduksi oleh asam lemak bebas atau free fatty acids (FFA), defisiensi hormon pertumbuhan (growth hormone), penurunan androgen pada pria, serta penurunan peroxisome proliferator-activated receptor 2.5. (PPARs) (Liu et al., 2014). Stevia Rebaudiana Stevia rebaudiana merupakan jenis tanaman asli Amerika Selatan dari famili bunga matahari (Asteraceae) yang sering disebut dengan daun manis ataupun daun gula, tanaman ini berasal dari daerah Brazil dan Paraguay. Diduga lebih dari 80 jenis spesies stevia tumbuh liar di Amerika Utara dan 200 spesies alami di Amerika Selatan. Walaupun terdapat lebih dari 200 macam spesies dari genus stevia, hanya stevia rebaudiana yang memberikan rasa manis. Tanaman ini telah digunakan sejak lebih dari 1500 tahun yang lalu oleh kaum Guarani di Paraguay sebagai pemanis ataupun obat-obatan (Sharma et al., 2009; Raini dan Isnawati, 2011; Gupta et al., 2014). 173 Gambar 2.7. Stevia Rebaudiana (Lemus-Mondaca et al., 2012) Pada tahun 1887 seorang ahli botani bernama Moises Santiago Bertoni menemukan tanaman stevia dan menamakannya Eupatorium rebaudianum Bertoni, kemudian dimasukkan dalam genus stevia pada tahun 1905. Dan pada tahun 1931, ahli kimia bernama M. Bridel dan R. Levielle mengisolasi stevioside dan rebauside yang memberikan rasa manis pada daun ini (Lemus-Mondaca et al., 2012; Anonim, 2015). Daun stevia mengandung pemanis alami dan mampu menghasilkan rasa manis 70400 kali dari manisnya gula tebu. Stevia telah digunakan di banyak negara di dunia sebagai pemanis non-kalori. Sebagai ekstrak ia memiliki potensi yang sama dengan rasa manis larutan sukrosa 10%, aspartame dan juga sakarin. Stevia lebih unggul dibandingkan pemanis buatan karena ia stabil pada temparatur tinggi dan pH 3-9. Steviosida, salah satu glikosida stevia, lebih manis sekitar 300 kali dari sakarosa (Goyal et al., 2010; Raini dan Isnawati, 2011). 174 Saat ini stevia rebaudiana telah dibudidayakan dan digunakan sebagai pemanis makanan di Asia timur, termasuk Cina (sejak 1084), Korea, Taiwan, Thailand, dan Malaysia. Tanaman ini juga dapat ditemukan di Saint Kitts dan Nevis, Brazil, Kolombia, Paraguay, Uruguay dan Israel. Sekarang, stevia menjadi sangat popular di Jepang dan digunakan sebagai pemanis secara komersial dengan pasar di atas 50%. Stevia digunakan sebagai pemanis mulai dari saus kedelai, sayur–sayuran hingga minuman ringan. Sebagai pemanis tanpa kalori, tanpa penambahan bahan kimia dan tanpa menimbulkan efek samping yang serius, stevia cepat populer si seluruh dunia (Anonim, 2015). 2.5.1 Kandungan Stevia Rebaudiana Bagian yang berguna dari tumbuhan ini adalah daunnya. Komposisi kimia spesies stevia secara lengkap belum tersedia, namun beberapa varietas spesies stevia telah diperiksa. Dari 100 spesies stevia yang diperiksa untuk rasa manisnya, hanya 18 spesies yang memiliki karakteristik ini. Pemanis natural dari daun stevia disebut glikosida steviol yang diisolasi dan diindentifikasikan sebagai dulkosida A, rebausida A, B, C, D, E, steviolbiosida, dan steviosida (Goyal et al., 2010). Stevia rebaudiana bertoni merupakan spesies yang paling manis, mengandung semua 8 komponen glikosida ini pada daunnya dengan steviosida sebagai komponen yang terbanyak. Glikosida adalah senyawa yang mengandung karbohidrat (gula) yang terikat ke bagian non-karbohidrat, terutama ditemukan pada tanaman dan dapat diubah menjadi gula dan komponen non gula (aglikon) oleh pembelahan hidrolitik. Stevioside dideskripsikan sebagai glikosida yang terdiri dari 3 molekul glukosa yang melekat pada aglikon 175 (C38H60O18). Steviol adalah tulang punggung aglikon dari glikosida stevia (Goyal et al., 2010; Lemus-Mondaca et al., 2012). Gambar 2.8. Steviol, Blok Bangunan Dasar dari Glikosida Manis Stevia (Anonim, 2015) Sejumlah penelitian telah menemukan bahwa selain rasa manis yang dimiliki, steviosida, bersama dengan senyawa lainnya termasuk rebausida A, steviol, dan isosteviol, juga memiliki kelebihan terapeutik sebagai anti-hiperglikemia, anti-hipertensi, anti-inflamasi, anti-tumor, anti-diare, diuretic, dan efek immunomodulator (Lemus-Mondaca et al., 2012). Pada daun dan akar stevia ditemukan inulin fruktooligosakarida, yang memiliki fungsi terkait sebagai prebiotik, serat diet, metabolism lemak dan control diabetes. Pada daun stevia terindentifikasi 9 asam amino, yaitu asam glutamat, asam aspartat, lisin, serin, isoleusin, alanin, prolin, tirosin dam metionin, bahkan ditemukan sampai dengan 17 macam asam amino termasuk arginin dan hanya triptofan yang tidak ada dari keseluruhan asam amino esensial. Mineral yang merupakan trace element esensial, meliputi potassium, kalsium, magnesium, sodium, zinc dan zat besi, ditemukan pada daun stevia dalam jumlah yang cukup (Lemus-Mondaca et al., 2012). 176 Enam asam lemak terindentifikasi dari minyak daun stevia, meliputi asam palmitat dan asam linolenat sebagai yang terbanyak, asam palmitoleat, asam stearat, asam oleat dan asam linoleat. Kandungan asam linolenat yang tinggi dapat membantu mempertahankan rasio asam lemak ideal dalam diet. Vitamin utama yang ditemukan pada ekstrak daun stevia ialah asam folat dan vitamin C (Lemus-Mondaca et al., 2012). Tabel 2.5. Kandungan nutrisional dari ekstrak daun stevia rebaudiana (Lemus-Mondaca et al., 2012) Mishra et al. (2010) Goyal et al. (2010) Serio (2010) Savita et al. (2004) Abou-Arab et al. (2010) Tadhani and Subhash (2006a) Moisture 7 4.65 ND 7 5.37 ND 7.7 Protein 10 11.2 11.2 9.8 11.40 20.4 12 Fat 3 1.9 5.6 2.5 3.73 4.34 2.7 Ash 11 6.3 ND 10.5 7.41 13.1 8.4 Carbohydrate 52 ND 53 52 61.9 35.2 ND Crude fibre 18 15.2 15 18.5 15.5 ND ND Kaushik et al. (2010) 177 Tabel 2.6. Perkiraan Komposisi Stevia Rebaudiana Bertoni (Goyal et al., 2010) No Konstituen Jumlah (%) 1 Aluminium 0.0072 2 Mangan 0.0147 3 Abu 6.3000 4 Fosfor 0.3180 5 B-karoten 0.0075 6 Potasium 1.7800 7 Kalsium 0.5440 8 Protein 11.200 9 Kromium 0.0039 10 Selenium 0.0025 11 Kobal 0.0025 12 Silikon 0.0132 13 Lemak 1.9000 14 Sodium 0.0892 15 Serat 15.200 16 Timah 0.0015 17 Zat besi 0.0039 18 Vitamin 0.0110 19 Magnesium 0.3490 178 20 Air 82.300 Fitokomia yang dapat ditemukan pada stevia rebaudiana meliputi austroinulin, beta karoten, dulkosida, nilasin, oksida rebaudi, riboflavin, steviol, steviosida dan tiamin. Stevia rebaudiana bertoni juga mengandung stigmasterol, b-sitosterol, campesterol, sterebin A-H, minyak volatil, asam askorbat, mineral, elektrolit, vitamin dan juga flavonoid (Goyal et al., 2010; Lemus-Mondaca et al., 2012). Fungsi obat dari tanaman terletak pada beberapa zat kimia yang menghasilkan kerja fisiologis pada tubuh manusia, terutama ditemukan pada alkaloid, flavonoid, tannin, dan senyawa fenol. Skrining fitokimia terhadap bubuk daun stevia rebaudiana menunjukkan kandungan yang terbanyak adalah tannin dan alkaloid, diikuti oleh glikosida jantung, saponin, sterol, triterpen dan antrakuinon. Tannin dilaporkan memiliki kemampuan menangkap radikal bebas dan aktifitas antioksidan. Saponin dapat menstimulasi pertumbuhan otot, meningkatkan level testosterone, dan juga menunjukkan kemampuan anti-bakteri, antidiabetes dan fungsi imunologis (Lemus-Mondaca et al., 2012). Analisis fitokimia terhadap daun stevia yang dilakukan di laboratorium Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana menunjukkan hasil sebagai berikut: (Lampiran 2) 179 Tabel 2.7. Tabel Hasil Analisis Ekstrak Daun Stevia Ekstrak daun stevia Tanin Kap. Antioksidan Flavonoid Fenol (%TAE) (% GAEAC) (% QE) (% GAE) 54.97 44.47 20.01 2.49 Keterangan: Kap. Antioksidan : Kapasitas antioksidan TAE : Tannic acid equivalent GAEAC : Gallic acid equivalent antioxidant capacity QE : Quarcetin equivalent GAE : Gallic acid equivalent 180 Tabel 2.8. Tabel Hasil Skrining Fitokimia Ekstrak Daun Stevia rebaudiana Partitionates Saponin Tannins Triterpines Alkaloids Flavonoids Glycosides Pet-ether + + + + + + Ethyl acetate + + + - + + Chloroform + + - + + + (Kujur et al., 2010; Hossain et al., 2011) Keterangan: A. E. : Aqueous extract 181 E. E. : Ether extract M. E. : Methanol extract 2.5.2. Efek Antioksidan Stevia Rebaudiana Literatur ilmiah menunjukkan bahwa daun stevia mengandung antioksidan dengan peran biokimia yang berbeda-beda, terdiri dari asam askorbat, senyawa fenol, termasuk flavonoid dan tannin. Aktivitas antioksidan dan pencegahan kerusakan oksidatif DNA dilaporkan terjadi secara in vitro oleh ekstrak methanol dan etil asetat daun stevia (Bender et al., 2015). Metode yang didasarkan pada penangkapan radikal stabil 1,1 -diphenyl-2picrylhydrazyl (DPPH) telah digunakan secara luas untuk memprediksi aktivitas antioksidan pada tanaman. Jahan, et al. menilai aktivitas DPPH, total fenol dan total flavonoid dari ekstrak stevia pada konsentrasi yang berbeda dan didapatkan bahwa ekstrak daun stevia dalam etanol 80% memiliki aktivitas antioksidan yang signifikan sehingga ia berpotensi sebagai antioksidan natural. Penelitian Bender et al. (2015) melalui pemeriksaan oxygen radical absorbance capacity (ORAC) dan cellular antioxidant activity (CAA) menemukan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak daun stevia lebih tinggi dibandingkan ekstrak batangnya, dan kapasitas steviosida dan rebausida A murni jauh lebih rendah. Juga ditemukan tidak ada aktivitas antioksidan dari pemeriksaan CAA pada steviosida, hal ini menunjukkan bahwa glikosida steviol sulit diserap di sel hati sehingga antivitas antioksidannya tidak melibatkan level 182 intraselular. Kandungan polifenol di dalam ekstrak stevia tidak berhubungan secara signifikan dengan ORAC dan CAA. Ekstrak daun stevia memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi dan dilaporkan menghambat pembentukan hidroksi peroksida di minyak sarden, lebih kuat dibandingkan dengan teh hijau dan alfa tokoferol. Aktivitas antioksidan dari ekstrak daun stevia dikaitkan dengan penangkapan elektron radikal bebas dan superoksid (Lemus-Mondaca et al., 2012). Penelitian oleh Vasko, et al. melaporkan pemberian ekstrak stevia tidak memberikan efek yang signifikan terhadap aktivitas superoksid dismutase, enzim antioksidan penting. Sehingga mekanisme kerja kapasitas antioksidan dari stevia diduga melalui kemampuannya menurunkan radikal bebas teroksidasi secara langsung, dibandingkan melalui modulasi sistem enzimatik endogen antioksidan. 2.5.3. Stevia Rebaudiana dan Dislipidemia Penelitian oleh Sharma et al. (2007) mengamati pemberian ekstrak stevia pada 20 wanita hiperkolesterol, ditemukan bahwa konsumsi ekstrak stevia menurunkan level kolesterol, trigliserida dan LDL kolesterol secara signifikan dan peningkatan HDL kolesterol, sesuai dengan yang diharapkan. Jadi dapat disimpulkan bahwa ekstrak stevia memiliki efek hipolipidemik yang menurunkan risiko penyakit kardiovaskular di masa yang akan datang. Pemberian isosteviol selama 7 hari, asam hidrosilat dari stevioside, pada tikus dengan diet tinggi lemak menunjukkan penurunan total kolesterol dan LDL kolesterol serta peningkatan HDL kolesterol (Xu et al., 2012). Dua studi pada tikus diabetes serta satu studi pada tikus dengan diet tinggi lemak yang menunjukkan penurunan level serum lipid dengan 183 pemberian ekstrak daun stevia. Aktivitas antihiperlipidemik dari stevia rebaudiana diduga dikarenakan adanya flavonoid, asam askorbat dan bahan lainnya (Park dan Cha, 2010; Hossain et al., 2011; Singh et al., 2013). Studi pemberian ekstrak akar stevia selama 21 hari menunjukkan perbaikan status lipid pada tikus diabetes, juga terjadi normalisasi dari penurunan antioksidan enzimatik dan konsentrasi antioksidan non enzimatik (Singh dan Garg, 2014). Penelitian oleh Savita dkk terhadap pemberian ekstrak stevia pada penderita hipertensi dan diabetes menunjukkan perbaikan profil lipid, namun tidak bermakna (Savita et al., 2004). Penelitian lainnya menunjukkan pemberian stevioside, komponen aktif stevia, secara double–blind pada penderita hipertensi menunjukkan tidak terdapat perubahan yang bermakna pada profil lipid dengan pemberian stevioside (Chan et al., 2000). Kerja antihiperlipidemik dari stevia diduga terkait dengan kandungan konstituen di dalamnya, meliputi flavonoid, saponin, tannin, triterpin dan alkaloid. Flavonoid telah diketahui memiliki aktivitas biologisnya yang luas termasuk aktivitas hipolipidemik dari kerja antioksidannya. Kapasitas penurunan lipid dari tanaman ini diperkirakan berasal dari konstituennya yang bekerja menghambat enzim hydroxyl-methyl-glutaryl-CoA reductase yang berperan dalam biosintesis kolesterol secara de novo (Hossain et al., 2011). Penelitian oleh Elekofehinti et al.(2013) menunjukkan bahwa saponin dapat memperbaiki profil lipid. Penurunan trigliserida yang terjadi diduga melibatkan banyak faktor, diantaranya: penurunan sintesis asam lemak, peningkatan reseptor LDL, aktivasi Lecithin-cholesterol acyl transferase (LCAT) and lipase dan penghambatan acetyl-CoA carboxylase. Penurunan total kolesterol dapat dikarenakan penurunan absorbsi kolesterol dari 184 usus, melalui ikatan asam empedu, dan peningkatan ekskresi asam empedu feses. Mekanisme lain yang diduga terlibat ialah supresi sintesis kolesterol dengan menurunnya aktivitas 3hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase). Flavonoid, yang meningkatkan resistensi tubuh terhadap oksidasi LDL kolesterol, diyakini dapat menghambat aterosklerosis. HDL kolesterol menunjukkan aktivitas dari lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT), yang memegang peranan penting dalam metabolisme lipoprotein dan berkontribusi terhadap pengaturan lipid dalam darah. Flavonoid meningkatkan rasio HDL-C/LDL-C sehingga mempercepat pembuangan kolesterol dari jaringan perifer ke hati untuk katabolisme dan ekskresi (Chen dan Li, 2007) Penelitian oleh Niu et al.(2015) menemukan bahwa flavonoid mencegah penghambatan adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) dan bahkan meningkatkan fosforilasi AMPK dan ACC sebanyak dua kali lipat pada hati tikus diabetes, hal yang sama ditemukan pada sel hati manusia (Hepatosit HepG2) yang terpapar glukosa yang tinggi. Hal ini akan menyebabkan penurunan ACC dan lipid hepar. Pada akhirnya aktivasi AMPK akan menurunkan sintesis lipid dan meningkatkan oksidasi asam lemak. Penelitian oleh Park dan Cha (2010) menemukan bahwa suplementasi ekstrak stevia meningkatkan ACO, PPAR α, dan level mRNA ACC di hati, sehingga meningkatkan level ACS dan CPT-I mRNA di hati. Penelitian ini menemukan bahwa ekstrak stevia menyebabkan up-regulation proses kode gen enzim pada oksidasi asam lemak di hati melalui aktivasi PPAR, sehingga didapatkan bahwa ekstrak stevia mencegah obesitas dan gejala terkait obesitas, termasuk hyperlipidemia dan penyakit kardiovaskular. Hasil yang hampir serupa ditemukan pada Xu et al. (2012), yaitu terjadi peningkatan 185 ekspresi PPAR α di hati. PPAR bertanggung jawab dalam pengambilan, katabolisme dan homeostasis lemak di berbagai jaringan termasuk di hati. Aktivasi PPAR α dapat menurunkan toksisitas lipid melalui biogenesis mitokondrial, peningkatan oksidasi asam lemak, penurunan akumulasi diasilgliserol dan seramid pada jaringan, down-regulation komplek protein terkait adaptor 1 dan aktivasi NFkB. Efek anti-apotosis dan antiinflamasi dari isosteviol diduga turut berperan dalam perbaikan profil lipid. PPAR α diaktivasi oleh asam lemak alami dan ligan sintetik, seperti fibrat, dan memediasi gen yang mengatur pengambilan asam lemak dan katabolisme oksidatif. Penelitian sebelumnya mengindikasikan bahwa komponen fenol dari berbagai tanaman adalah aktivator PPAR α, yang mengontrol ekspresi banyak gen yang terlibat dalam oksidasi asam lemak. Hasil penelitian menunjukkan level mRNA PPAR di hati ditemukan paling tinggi pada grup dengan suplementasi stevia. Hasil ini mengindikasikan bahwa stevia bisa jadi merupakan ligan / activator alami PPAR α, sehingga terjadi peningkatan gen yang terlibat dalam oksidasi asam lemak (Park dan Cha, 2010). Pada studi ini juga ditemukan bahwa konsentrasi asil karnitin/ karnitin bebas meningkat di hati setelah pemberian ekstrak stevia, yang kemungkinan dikarenakan peningkatan biosintesis karnitin di hati. Karnitin mentranspor asam lemak ke mitokondria, dimana asam lemak mengalami oksidasi beta, sehingga ia memiliki peranan vital dalam mengaktifkan oksidasi asam lemak di jaringan. Karnitin yang rendah akan memperlambat oksidasi beta dan meningkatkan serum lipid. Suplemetasi stevia meningkatkan acid-insoluble acylcarnitine (AIAC), yang artinya ekstrak stevia dapat memperbaiki fungsi metabolik seperti oksidasi asam lemak dan ketogenesis (Park dan Cha, 2010). 186 Stevioside, kandungan aktif stevia rebaudiana, memperbaiki adipogenesis dan pengambilan glukosa di jaringan adipose visceral, yang dibuktikan dengan adanya ekspresi Lxr α (Liver-X-receptor-α), Fabp 4 dan Glut 4 yang tinggi. Induksi Lxr α di jaringan adipose pada pemeberian ekstrak stevia mendukung peningkatan ekspresi Glut 4, yang memperbaiki ambilan glukosa dan Fabp 4, yang memperbaiki metabolisme asam lemak. Stevioside juga memperbaiki pertahanan antioksidan melalui peningkatan ekspresi SOD, yang berhubungan dengan penurunan akumulasi LDL teroksidasi di sirkulasi dan pembuluh darah (Geeraert, 2010). 2.5.4. Toksisitas Stevia Rebaudiana Studi toksikologis menunjukkan bahwa steviosida tidak memiliki efek mutagenik, teratogenik, ataupun karsinogenik. Belum pernah ditemukan reaksi alergi terhadap penggunaannya sebagai pemanis. Studi terbaru pada toksisitas rebausida A secara umum dan terhadap reproduksi memperkuat studi sebelumnya pada pada steviol murni, menunjukkan keamanannya pada asupan dalam jumlah besar (LemusMondaca et al., 2012). Kematian merupakan kriteria yang ambigu, tes toksisitas akut ditentukan pada keadaan dimana setengah dari binatang coba mati (lethal dose 50% - LD50). Steviosida dan steviol memiliki toksisitas akut oral yang rendah pada tikus, yang artinya nilai LD50 nya tinggi. Steviosida sampai dengan 15g/kgBB tidak bersifat letal terhadap tikus ataupun hamster. Nilai LD50 pada hamster adalah 5.2 dan 6.1 g/kg BB pada jantan dan betina. Pada tikus nilai LD50 steviol lebih tinggi dari 15g/kgBB pada kedua jenis kelamin (Geuns, 2002). 187 LD50 oral untuk ekstrak stevia ialah 17g/kgBB (20% dari steviosida) dan 15g/kgBB untuk steviosida murni (kemurnian 93.5%). Pada tikus LD50 steviosida dengan pemberian oral ialah 8.2g/kgBB dan dengan pemberian intraperitoneal 2.99g/kgBB. Karena steviosida 300 kali lebih manis dari gula, maka LD 50 pada angka 8.2g/kgBB setara dengan 2.5kg/kg BB gula (Geuns, 2002). 2.6 Hewan Percobaan Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus (Rattus norvegicus) Wistar jantan. Klasifikasi taksonomi dari tikus putih (Kusumawati, 2004): Kingdom : Animalia Phylum : Chordata Subphylum : Vertebrata Class : Mammalia Order : Rodentia Family : Muridae Genus : Rattus Species : norvegicus Tikus digunakan untuk penelitian karena kesamaannya dengan manusia dalam fisiologi, anatomi, nutrisi, patologi, dan metabolismenya. Sifat-sifat yang dimiliki 188 tikus antara lain mudah dipelihara, ukurannya cukup besar untuk diamati dan relatif sehat, sehingga memenuhi kriteria sebagai hewan percobaan. Usia tikus 2-3 bulan memiliki persamaan dengan manusia usia dewasa muda dan belum mengalami proses penuaan intrinsik (Malole and Pramono, 1989; Harini and Astrin, 2009). Tikus jantan dapat memberikan hasil penelitian yang lebih stabil karena tidak dipengaruhi oleh siklus menstruasi dan kehamilan seperti pada tikus putih betina. Tikus jenis jantan juga mempunyai kecepatan metabolisme obat yang lebih cepat dan kondisi biologis tubuh yang lebih stabil dibanding tikus betina (Ngatidjan, 2006). Ada dua sifat yang membedakan tikus putih dari hewan percobaan, yaitu bahwa tikus putih tidak dapat muntah karena struktur anatominya yang tidak lazim di tempat esofagus bermuara ke dalam lambung dan tikus putih tidak mempunyai kandung empedu (Smith and Mangkoewidjojo, 1988; Krinke, 2000). Strain tikus yang paling popular digunakan sebagai standar penelitian terhadap nutrisi, penuaan ataupun kelaianan metabolik adalah wistar adan spraguedawley. Sebuah studi yang membandingkan tikus wistar dan tikus sprague-dawley menunjukkan bahwa tikus wistar lebih rentan terhadap obesitas, resistensi insulin dan kelainan terkait lainnya, yang dibuktikan dengan penambahan berat badan yang lebih cepat and nyata pada pemberian diet tinggi lemak. Serupa dengan sindrom metabolik pada manusia, tikus wistar yang diberikan diet tinggi lemak tidak memanfaatkan asam lemak secara luas dan menyebabkan akumulasi lemak dan terjadinya resistensi 189 insulin. Nilai RQ yang tinggi pada tikus Wistar menunjukkan bahwa mereka meningkatkan oksidasi karbohidrat dan lipogenesis dengan mengorbankan katabolisme lipid (Jun and Fehn, 2006). Kadar kolesterol normal pada tikus putih galur wistar adalah 40-130 mg/dl dan trigliserida darah normal 26-145mg/ dl. Jika dianalogikan dengan manusia, tikus mengalami hiperkolesterolemia bila konsentrasi darahnya meningkat 20%. Peningkatan kolesterol plasma dipengaruhi oleh jenis lemak yang ada dalam diet. (Malole and Pramono, 1989). 190 BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN 3.1. Kerangka Berpikir Dislipidemia adalah kelainan metabolisme lipid yang ditandai dengan peningkatan maupun penurunan fraksi lipid dalam plasma. Kelainan lipid yang paling utama adalah kenaikan kadar kolesterol total, kolesterol LDL, trigliserida serta penurunan kadar HDL. Dislipidemia adalah faktor risiko mayor dan primer dari penyakit jantung koroner, bahkan mungkin merupakan salah satu persyaratan terjadinya penyakit jantung koroner sebelum faktor risiko mayor lainnya mulai berperan. Kadar kolesterol tinggi dalam darah disebabkan oleh faktor eksogen dan faktor endogen. Intervensi dilakukan pada faktor eksogen yang meliputi pola makan, aktifitas fisik, gaya hidup, suplementasi, dan obat-obatan, karena intervensi pada faktor endogen yang meliputi fisiologi, hormonal, genetik, stres, umur, dan lain-lain sulit dilakukan. Pengobatan dislipidemia memegang peranan penting dalam pencegahan primer dan sekunder terhadap penyakit kardiovaskular. Tujuan utama terapi pada dislipidemia adalah untuk mencegah penyakit kardiovaskular dan komplikasinya Penilaian faktor risiko absolut, pengobatan faktor risiko yang dapat dimodifikasi dan optimalisasi gaya hidup, terutama diet dan olah raga, adalah yang utama dalam 191 penanganan dislipidemia. Terapi farmakologis ialah penggunaan obat-obatan untuk mengontrol level kolesterol dalam darah. Pada beberapa penelitian sebelumnya dan literatur pada daun stevia ditemukan berbagai antioksidan, termasuk flavonoid dan tannin, serta glikosida yang memberikan rasa manis pada daun ini. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa pemberian ekstrak daun stevia dapat memperbaiki profil lipid. Kemungkinan hal ini terkait dengan kandungan antioksidan di dalamnya, salah satunya dengan penghambatan enzim hydroxyl-methyl-glutaryl-CoA (HMG CoA) reductase. Penelitian ini ditujukan untuk mempelajari pemberian ekstrak daun stevia yang diketahui memiliki kandungan antioksidan yang tinggi, maka diharapkan ekstrak daun stevia dapat memperbaiki profil lipid serta aman untuk dikonsumsi pada tikus yang diberikan diet tinggi kolesterol. 192 3.2. Konsep Penelitian Berdasarkan rumusan masalah dan tinjauan pustaka, maka disusun konsep penelitian sebagai berikut : - Ekstrak etanol daun stevia Faktor endogen: Fisiologi Hormonal Genetik Status gizi 5. Umur Faktor eksogen: 1. 2. 3. 4. 1. Pola makan 2. Aktivitas fisik 3. Obat-obatan Tikus yang diberikan diet tinggi kolesterol - Keterangan: Diteliti Tidak diteliti Total kolesterol LDL kolesterol HDL kolesterol Trigliserida 193 3.3. Hipotesis Penelitian Hipotesis dalam desain penelitian ini dapat dirumuskan sebagai berikut : 1. Pemberian ekstrak etanol daun stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kgBB secara oral mencegah peningkatan kadar kolesterol total serum tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol. 2. Pemberian ekstrak etanol daun stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kgBB secara oral mencegah peningkatan kadar LDL kolesterol tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol. 3. Pemberian ekstrak etanol daun stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kgBB secara oral mencegah peningkatan kadar trigliserida tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol. 4. Pemberian ekstrak etanol daun stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kgBB secara oral mencegah penurunan kadar HDL kolesterol serum tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol. 194 BAB IV METODE PENELITIAN 4.1. Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan menggunakan Post Test Only Control Group Design (Marczyk et al., 2005). Rancangan penelitian adalah tikus dibagi menjadi 2 (dua) kelompok. Perlakuan pada kedua kelompok adalah sama kecuali terhadap pemberian ekstrak daun stevia dan plasebo. Skema rancangan penelitian adalah sebagai berikut: P0 O1 P S R P1 O2 Bagan 4.1. Rancangan Penelitian Keterangan : P = Populasi S = Sampel R = Randomisasi P0 = Perlakuan pada Kelompok Kontrol yang diberikan diet tinggi kolesterol serta plasebo (akuades 1cc). 195 P1 = Perlakuan pada Kelompok Perlakuan 1 yang diberikan diet tinggi kolesterol serta ekstrak daun stevia rebaudiana (dosis 300mg/kg berat badan). O1 = Kolesterol total, kolesterol LDL, trigliserida dan kolesterol HDL pada kelompok kontrol. O2 = Kolesterol total, kolesterol LDL, trigliserida dan kolesterol HDL pada kelompok perlakuan 1 4.2. Waktu dan Tempat Penelitian 4.2.1. Tempat Penelitian Pembuatan dan analisis ekstrak daun stevia dilakukan di Laboratorium Teknik Pascapanen Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana. Penelitian ini dilakukan di Laboratory Animal Unit Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana. Pemeriksaan darah dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada Yogyakarta 4.2.2. Waktu Penelitian Penelitian dilakukan selama 36 hari: 1. Tujuh hari untuk aklimatisasi. 2. Dua puluh delapan hari untuk perlakuan. 3. Satu hari untuk pengambilan sampel darah untuk pemeriksaan kolesterol total, kolesterol LDL, trigliserida, dan kolesterol HDL. 196 4.3. Populasi dan Sampel Penelitian 4.3.1 Populasi Penelitian Populasi penelitian adalah sekelompok subjek atau data dengan karakteristik tertentu. Populasi dalam penelitian ini adalah tikus (Rattus norvegicus) galur wistar jantan umur 3-4 bulan dengan berat 180-200 gram. 4.3.2 Sampel 4.3.2.1. Kriteria Inklusi 1. Tikus (Rattus norvegicus) Galur Wistar Jantan 2 Sehat . 3 Umur 3-4 bulan. 4. Berat tikus 180-200 gram. 4.3.2.2. Kriteria Dropout Tikus mati atau tikus sakit ketika sedang penelitian. 4.3.3. Penentuan Besar Sampel Besar sampel yang diperlukan dalam penelitian ini didasarkan pada rumus Federer (2008) (n-1) x (t-1) ≥ 15 Keterangan : n = jumlah replikasi t = jumlah perlakuan Pada penelitian ini jumlah perlakuan ada 2, maka (n-1) (2-1) ≥ 15 n = 16 197 Untuk penelitian digunakan sampel 16 (enam belas) ekor per kelompok, dan untuk cadangan bila terjadi kematian atau sakit pada saat dilakukan penelitian, maka jumlah sampel ditambah minimal 10 persen, menjadi 17.6 dibulatkan menjadi 18 (Delapan belas). Maka total tikus yang digunakan adalah 36 (tiga puluh enam ) ekor. 4.4. Variabel Penelitian 4.4.1 Klasifikasi Variabel Variabel bebas a. Ekstrak daun stevia rebaudiana Variabel tergantung a. Kadar kolesterol total b. Kadar kolesterol LDL (Low Density Lipoprotein) c. Kadar Trigliserida d. Kadar kolesterol HDL (High Density Lipoprotein) Variabel kendali meliputi: a. Suhu, kelembaban, nutrisi b. Berat badan c. Umur hewan coba 198 d. Aktivitas e. Diet tinggi kolesterol , terdiri dari: kuning telur, lemak hewan, minyak goreng dan makanan standar 4.4.2. Definisi Operasional Variabel a. Ekstrak etanol daun stevia rebaudiana adalah crude extract (rendemen) daun stevia yang menggunakan pelarut etanol 96% b. Kadar kolesterol total adalah kadar kolesterol total dalam darah yang diukur dengan metode GOD PAP. Diukur sesudah perlakuan. Darah diambil melalui medial canthus sinus orbitalis. c. Kadar kolesterol LDL adalah kadar kolesterol LDL dalam darah yang diukur dengan metode GOD PAP. Diukur sesudah perlakuan. Darah diambil melalui medial canthus sinus orbitalis. d. Kadar kolesterol HDL adalah kadar kolesterol HDL dalam darah yang diukur dengan metode GOD PAP. Diukur sesudah perlakuan. Darah diambil melalui medial canthus sinus orbitalis. e. Kadar Trigliserida adalah kadar trigliserida dalam darah yang diukur dengan metode GOD PAP. Diukur sesudah perlakuan. Darah diambil melalui medial canthus sinus orbitalis. f. Profil lipid adalah kadar kolesterol total, kolesterol LDL, kolesterol HDL dan kadar trigliserida darah. 199 g. Makanan tinggi kolesterol adalah makanan yang meningkatkan kadar kolesterol darah tikus yang komposisinya terdiri dari kuning telur, lemak hewan, minyak goreng dan makanan standar h. Plasebo adalah akuades yang diberikan pada tikus personde 1x sehari selama 28 hari. i. Tikus putih jantan jenis Wistar adalah hewan percobaan yang berupa tikus galur Wistar. 4.5. Bahan Penelitian Bahan daun stevia rebaudiana adalah daun stevia rebaudiana dari kemasan daun stevia kering yang diproduksi oleh UD. Taman Medis, Denpasar, Bali, Indonesia. 4.6. Instrumen Penelitian a. Timbangan gram b. Sonde untuk pemberian pemberian placebo dan ekstrak etanol daun stevia rebaudiana pada tikus c. Tabung mikrokapiler untuk pengambilan darah d. Tabung kontainer darah 200 4.7. Prosedur Penelitian 1. Diambil 36 ekor tikus putih jantan galur Wistar yang berumur 3 – 4 bulan dengan berat sekitar 180-200 gram. 2. Tikus diadaptasikan selama 1 minggu dan diberikan makanan standar yang berupa HBS pelet 11 secara ad libitum. 3. Tikus dipelihara dalam kandang individual yang berukuran 30x20x20 cm. 4. Setelah itu tikus dibagi menjadi 2 kelompok secara random. 5. Diberikan perlakuan : a. P0 : Perlakuan pada kelompok kontrol yang diberi makanan tinggi kolestrol dan plasebo berupa akuades 1cc selama 28 hari. b. P1 : Perlakuan pada kelompok uji yang diberi makanan tinggi kolesterol dan ekstrak etanol daun stevia rebaudiana (dosis 300mg/kg BB tikus) personde selama 28 hari. Pemberian makanan tinggi kolesterol diberikan selama 28 hari untuk memastikan kolesterol darah meningkat dibandingkan normal. 6. Setelah diberikan perlakuan, diperiksa kadar kolesterol total, kolesterol LDL, Trigliserida dan kolesterol HDL sebagai post test. Prosedur pembuatan ekstrak etanol daun stevia rebaudiana: 1. Daun stevia rebaudiana kering dilarutkan dengan menggunakan pelarut etanol 96% dengan perbandingan 1:5 2. Dilanjutkan dengan proses maserasi manual selama 24 jam 201 3. Kemudian larutan disaring dan dievaporasi sampai pelarut tidak menetes lagi 4. Didapatkan 100% crude extract (rendemen) dari daun stevia rebaudiana Prosedur pengambilan darah tikus setelah perlakuan 1. Tikus diambil dari kandang 2. Kemudian diberikan suntikan anestesi dengan ketamine (Dosis: 40mg/kg berat badan) dan xylazine (Dosis: 10mg/kg berat badan) 3. Setelah tikus mengalami penurunan kesadaran, dilakukan pengambilan sampel darah melalui medial canthus sinus orbitalis dengan menggunakan tabung mikrokapiler sebanyak 1.2 ml 4. Sampel darah dimasukkan ke dalam tabung EDTA Prosedur pemeriksaan darah setelah perlakuan 1. Dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit terhadap sampel darah 2. Didapatkan serum darah sebanyak 0.6 ml 3. Serum darah kemudian dipak dan dikirimkan ke Laboratorium Biokimia Universitas Gajah Mada 4. Pemeriksaan profil lipid dilakukan dengan metode GOD PAP 202 4.8. Alur Penelitian Tikus (36 ekor) Adaptasi (7 hari) Kelompok P0 Kelompok P1 (18 ekor) (18 Ekor) Placebo Ekstrak Stevia rebaudiana + Perlakuan + Makanan tinggi kolesterol (28 hari) Makanan tinggi kolesterol Sisa makanan dan berat badan Sisa makanan dan berat badan Setiap hari (28 hari) Puasa 18 jam Total Kolesterol, Trigliserida, LDL Kolesterol, HDL Kolesterol Analisis data Laporan Posttest (Hari ke 29) 203 4.9. Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis dengan langkah sebagai berikut : 4. Analisis Deskriptif Analisis deskriptif disajikan dalam bentuk tabel dan grafik, dilakukan sebagai dasar untuk statistik analitis (uji hipotesis) dan untuk mengetahui karakteristik data mean kadar kolesterol total, kolesterol LDL, trigliserida dan kolesterol HDL. 5. Uji normalitas Uji normalitas diuji dengan Shapiro Wilk test karena jumlah sampel kurang dari 50. Data dinyatakan berdistribusi normal dengan p > 0.05. 6. Uji homogenitas Uji homogenitas diuji dengan Levene’s Test. Varian data dinyatakan homogen dengan p >0,05 7. Analisis Komparasi: Karena data berdistribusi normal maka untuk uji komparasi antar kelompok dilakukan dengan uji T independen. 204 BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan menggunakan post test only kontrol group design yang menggunakan 36 ekor tikus putih galur Wistar (Rattus norvegicus) jantan berumur 3-4 bulan, dengan berat badan 180-200 gram, diberikan diet tinggi kolesterol, terbagi menjadi 2 (dua) kelompok masing-masing berjumlah 18 ekor tikus, yaitu kelompok kontrol (P0) yang diberikan diet tinggi kolesterol dan plasebo berupa aquades dan kelompok perlakuan (P1) yang diberikan diet tinggi kolesterol dan ekstrak stevia rebaudiana (dosis 300 mg/kg berat badan tikus). Hasil penelitian ini kemudian dianalisis dan disajikan menggunakan hasil analisis deskriptif, normalitas data, homogenitas data dan uji komparabilitas. 5.1 Hasil Penelitian 5.1.1 Analisis Deskriptif Hasil analisis deskriptif kadar kolesterol total, trigliserida, kolesterol HDL dan kolesterol LDL setelah 28 hari perlakuan (post-test) pada masing-masing kelompok disajikan pada Tabel 5.1. 205 Tabel 5.1 Hasil Analisis Deskriptif Profil Lipid Variabel Kelompok Mean n Subyek Kolesterol Total Minimum Maksimum (mg/dl) (mg/dl) SD (mg/dl) Kontrol (P0) 18 218,70 8,53 203,88 232.18 Perlakuan (P1) 18 112,12 5,91 102,19 123.14 Kontrol (P0) 18 149,46 7,73 135,92 162.81 Perlakuan (P1) 18 95,00 6,99 84,88 110.32 Kontrol (P0) 18 26,66 2,29 23,87 30.36 Perlakuan (P1) 18 39,07 1,73 36,07 43.28 Kontrol (P0) 18 67,46 4,08 60,73 77.42 Perlakuan (P1) 18 38,95 4,32 32,04 46.17 Trigliserida Kolesterol HDL Kolesterol LDL 5.1.2 Uji Normalitas Data Kadar kolesterol total, trigliserida, kolesterol HDL dan kolesterol LDL setelah 28 hari perlakuan pada masing-masing kelompok diuji normalitasnya dengan uji Shapiro-Wilk. 206 Hasilnya menunjukkan bahwa data berdistribusi normal (p>0,05), seperti yang disajikan pada tabel 5.2. 207 Tabel 5.2 Hasil Uji Normalitas Data Antar Kelompok Variabel Kelompok Subyek n p Keterangan Kontrol (P0) 18 0,218 Normal Perlakuan (P1) 18 0,548 Normal Kontrol (P0) 18 0,298 Normal Perlakuan (P1) 18 0,107 Normal Kontrol (P0) 18 0,065 Normal Perlakuan (P1) 18 0,256 Normal Kontrol (P0) 18 0,379 Normal Perlakuan (P1) 18 0,183 Normal Kolesterol Total Trigliserida Kolesterol HDL Kolesterol LDL n = jumlah sampel; p = taraf signifikansi 5.1.3 Uji Homogenitas Data antar Kelompok Kadar kolesterol total, trigliserida, kolesterol HDL dan kolesterol LDL setelah 28 hari perlakuan pada masing-masing kelompok diuji homogenitasnya dengan menggunakan Levene’s test. Hasil menunjukkan bahwa varian data hasil penelitian variable kadar 208 kolesterol total, trigliserida, kolesterol HDL dan kolesterol LDL homogen (p>0,05). Data disajikan pada Tabel 5.3. 209 Tabel 5.3 Hasil Uji Homogenitas Data Antar Kelompok Variabel n p Keterangan Kolesterol Total 36 0,376 Homogen Trigliserida 36 0,907 Homogen Kolesterol LDL 36 0,069 Homogen Kolesterol HDL 36 0,479 Homogen N = jumlah sampel; p = taraf signifikansi 5.1.4 Uji Komparabilitas Analisis komparabilitas ini bertujuan untuk membandingkan rerata kadar kolesterol total, trigliserida, kolesterol HDL dan kolesterol LDL antar kelompok sesudah perlakuan selama 28 hari. Hasil analisis kemaknaan diuji dengan uji T independen. Hasil analisis kemaknaan rerata kadar kolesterol total antar kelompok setelah perlakuan disajikan pada Tabel 5.4. Tabel 5.4 Rerata Nilai Kolesterol Total antar Kelompok Sesudah Perlakuan 210 Kelompok n Rerata (mg/dl) SB Kontrol 18 218,70 8,53 t 43,597 Perlakuan 18 112,12 p 0,000 5,91 SB = Simpangan Baku; t = t-test; p = signifikansi Tabel 5.4 menunjukkan rerata kadar kolesterol total sesudah 28 hari perlakuan kelompok kontrol (P0) adalah 218,70 ± 8,53mg/dl dan kelompok P1 adalah 112,12 ± 5,91mg/dl. Analisis kemaknaan dengan uji T independen menunjukkan bahwa nilai t = 43,597 dan nilai p = 0,000. Hal ini menunjukkan bahwa kadar kolesterol total antar kedua kelompok setelah perlakuan berbeda sangat bermakna (p<0,01). Rerata Total Kolesterol mg/dl 218,70 ± 8,53 250 200 p<0.01 112,12 ± 5,91 Total Kolesterol 150 100 50 0 Kelompok Kontrol (P0) Kelompok Perlakuan (P1) Gambar 5.1 Grafik Perbandingan Rerata Total Kolesterol Antar Kelompok Setelah Perlakuan 211 Hasil analisis kemaknaan rerata kadar kolesterol total antar kelompok setelah perlakuan disajikan pada Tabel 5.5. 212 Tabel 5.5 Rerata Nilai Trigliserida antar Kelompok Sesudah Perlakuan Kelompok n Rerata (mg/dl) SB Kontrol 18 149,46 7,73 Perlakuan 18 95,00 t p 22,171 0,000 6,99 SB = Simpangan Baku; t = t-test; p = signifikansi Tabel 5.5 menunjukkan rerata kadar trigliserida sesudah 28 hari perlakuan kelompok kontrol (P0) adalah 149,46 ± 7,73mg/dl dan kelompok P1 adalah 95,00 ± 6,99mg/dl. Analisis kemaknaan dengan uji T independen menunjukkan bahwa nilai t = 22,171 dan nilai p = 0,000. Hal ini menunjukkan bahwa kadar trigliserida antar kedua kelompok setelah perlakuan berbeda sangat bermakna (p<0,01). 213 Rerata Trigliserida 149,46 ± 7,73 mg/dl p<0.01 160 95,00 ± 6,99 140 120 100 Trigliserida 80 60 40 20 0 Kelompok Kontrol (P0) Kelompok Perlakuan (P1) Gambar 5.2 Grafik Perbandingan Rerata Trigliserida Antar Kelompok Setelah Perlakuan Hasil analisis kemaknaan rerata kadar kolesterol total antar kelompok setelah perlakuan disajikan pada Tabel 5.6. Tabel 5.6 Rerata Nilai Kolesterol HDL antar Kelompok Sesudah Perlakuan Kelompok n Rerata (mg/dl) SB Kontrol 18 26,66 2,29 Perlakuan 18 39,07 SB = Simpangan Baku; t = t-test; p = signifikansi 1,73 t p -18,360 0,000 214 Rerata kadar kolesterol HDL ditunjukkan pada tabel 5.6 yang menunjukkan hasil kelompok kontrol (P0) adalah 26,66 ± 2,29mg/dl dan kelompok P1 adalah 39,07 ± 1,73mg/dl. Analisis kemaknaan dengan uji T independen menunjukkan bahwa nilai t = 18,360 dan nilai p = 0,000. Hal ini menunjukkan bahwa kadar kolesterol HDL antar kedua kelompok setelah perlakuan berbeda sangat bermakna (p<0,01). 215 Rerata Kolesterol HDL 39,07±1,73 mg/dl p<0.01 40 26,66±2,29 35 30 25 Kolesterol HDL 20 15 10 5 0 Kelompok Kontrol (P0) Kelompok Perlakuan (P1) Gambar 5.3 Grafik Perbandingan Rerata Kolesterol HDL Antar Kelompok Setelah Perlakuan Hasil analisis kemaknaan rerata kadar kolesterol total antar kelompok setelah perlakuan disajikan pada Tabel 5.7. Tabel 5.7 Rerata Nilai Kolesterol LDL antar Kelompok Sesudah Perlakuan Kelompok n Rerata (mg/dl) SB Kontrol 18 67,46 4,08 Perlakuan 18 38,95 SB = Simpangan Baku; t = t-test; p = signifikansi 4,32 t p 20,366 0,000 216 Tabel 5.7 menujukkan rerata kadar kolesterol LDL kelompok kontrol (P0) adalah 67,46±4,08mg/dl dan kelompok P1 adalah 38,95±4,32mg/dl. Analisis kemaknaan dengan uji T independen menunjukkan bahwa nilai t= 20,366 dan nilai p= 0,000. Hal ini menunjukkan bahwa kadar kolesterol LDL antar kedua kelompok setelah perlakuan berbeda sangat bermakna (p<0,01). Rerata Kolesterol LDL mg/dl 67,46±4,08 p<0.01 70 60 38,95±4,32 50 40 Kolesterol LDL 30 20 10 0 Kelompok Kontrol (P0) Kelompok Perlakuan (P1) Gambar 5.4 Grafik Perbandingan Rerata Kolesterol LDL Antar Kelompok Setelah Perlakuan Hal ini berarti rerata kadar kolesterol total, trigliserida, kolesterol HDL dan kolesterol LDL sesudah perlakuan selama 28 hari antar kelompok kontrol (P0) dan kelompok perlakuan (P1) berbeda sangat bermakna (p<0,01). 5.2 Pembahasan 5.2.1 Subyek Penelitian 217 Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan rancangan post test only control group design, menggunakan hewan sebagai subyek penelitian yaitu 36 ekor tikus putih (Rattus norvegicus) galur wistar jantan yang berusia 2-3 bulan dengan berat 180-200 gram. Subyek penelitian dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok kontrol yang diberikan plasebo berupa aquadest 1 cc dan kelompok perlakuan yang diberikan ekstrak stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kg berat badan secara oral per sonde selama 28 hari. Hewan coba berupa tikus putih (Rattus norvegicus) galur wistar sering digunakan dalam berbagai penelitian karena mudah dipelihara dan ukurannya relatif cukup besar untuk diobservasi. Sebuah studi yang membandingkan tikus wistar dan tikus sprague-dawley menunjukkan bahwa tikus wistar lebih rentan terhadap obesitas, resistensi insulin dan kelainan terkait lainnya (Jun and Fehn, 2006; Ngatijan, 2006). Ada dua sifat yang membedakan tikus putih dari hewan percobaan yang lain, yaitu bahwa tikus putih tidak dapat muntah karena struktur anatominya yang tidak lazim di tempat esofagus bermuara ke dalam lambung dan tikus putih tidak mempunyai kandung empedu (Smith and Mangkoewidjojo, 1988; Krinke, 2000). 218 Tikus yang digunakan pada penelitian ini berusia 3-4 bulan yang artinya tikus masi muda sekitar usia 18 tahun. Usia ini dipilih karena sebuah studi longitudinal menunjukkan bahwa total kolesterol akan mulai meningkat sejak usia pubertas sampai dengan usia 50 tahun (Sengupta, 2013; Rosenson, 2015). Pada penelitian ini subyek penelitian dibagi menjadi dua kelompok, yaitu kelompok kontrol yang diberikan diet tinggi kolesterol dan kelompok perlakuan yang diberikan diet tinggi kolesterol serta ekstrak etanol daun stevia rebaudiana selama 28 hari, setelah dilakukan aklimatisasi selama 7 (tujuh) hari. Penelitian dilakukan selama 28 hari sesuai dengan prosedur penelitian dibutuhkan waktu 28 hari untuk merangsang terjadinya dislipidemia pada tikus. 5.2.2 Dosis dan Pelarut Ekstrak Daun Stevia Rebaudiana Stevia rebaudiana merupakan jenis tanaman asli Amerika Selatan dari famili bunga matahari (Asteraceae) yang sering disebut dengan daun manis ataupun daun gula. Saat ini stevia rebaudiana telah dibudidayakan dan banyak digunakan sebagai pemanis makanan . 219 Sejumlah penelitian telah menemukan bahwa selain rasa manis yang dimiliki, ia juga memiliki kelebihan terapeutik. Literatur ilmiah menunjukkan bahwa daun stevia mengandung antioksidan dengan peran biokimia yang berbeda-beda, termasuk flavonoid dan tannin. Fungsi obat dari tanaman ini terletak pada beberapa zat kimia yang menghasilkan kerja fisiologis pada tubuh manusia (Bender et al., 2015; Gupta et al., 2014; Lemus-Mondaca et al., 2012). Pada penelitian ini kelompok perlakuan diberikan diet tinggi kolesterol dan ekstrak etanol daun stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kgBB, dosis ini mengacu pada penelitian pendahuluan yang membandingkan efektivitas pemberian stevia rebaudiana dengan dosis 150mg/kg berat badan dan 300mg/ kg berat badan, ditemukan bahwa dosis 300mg/ kg berat badan memberikan hasil yang lebih baik dalam perbaikan profil lipid pada tikus putih galur wistar jantan (Surya, 2016). Ekstrak daun stevia rebaudiana pada penelitian ini menggunakan pelarut etanol mengacu pada jurnal yang menyebutkan bahwa pelarut yang paling sesuai untuk mengikat antioksidan pada ekstrak tanaman antara lain etanol, metanol, aseton, dan etil asetat. Pelarut pelarut tersebut mampu untuk mengikat komponen antioksidan lebih baik daripada air (Sultana et al., 2009). Jahan, et al. (2010) menilai aktivitas DPPH, total fenol dan total flavonoid dari ekstrak stevia pada konsentrasi yang berbeda dan didapatkan bahwa ekstrak daun stevia dalam etanol 80% memiliki aktivitas antioksidan yang signifikan. 5.2.3 Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Daun Stevia Rebaudiana terhadap Perbaikan 220 Profil Lipid Bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun stevia rebaudiana kering produksi UD. Taman Medis, Denpasar, Bali, Indonesia. Kemudian dilarutkan dengan etanol 96% dengan perbandingan 1:5, dilanjutkan dengan proses maserasi manual selama 24 jam. Larutan lalu disaring dan dievaporasi sampai pelarut tidak menetes lagi dan didapatkan 100% crude extract (rendemen). Pemeriksaan profil lipid tikus diukur dengan tikus sebelumnya dipuasakan selama 18 jam, sampel darah diambil melalui medial canthus sinus orbitalis dengan menggunakan tabung mikro kapiler sebanyak 1.2 ml setiap ekor. Kemudian diperiksa profil lipid darahnya dengan menggunakan metode GOD PAP. Hasil penelitian dan analisis data profil lipid darah pada kedua kelompok yaitu kelompok kontrol (P0) dan kelompok perlakuan (P1) menunjukkan bahwa data berdistribusi normal (Uji normalitas dengan Shapiro Wilk) dan homogen (Uji homogenitas dengan Levene’s test) dengan nilai p>0.05. Uji komparabilitas rerata kadar profil lipid antar kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dilakukan dengan uji t-independent. Didapatkan hasil rerata kadar kolesterol total sesudah 28 hari perlakuan kelompok kontrol (P0) adalah 218,70 ± 8,53mg/dl dan kelompok perlakuan (P1) adalah 112,12 ± 5,91mg/dl. Analisis kemaknaan dengan uji tindependence menunjukkan bahwa nilai t= 43,597 dan nilai p= 0,000. Rerata kadar trigliserida kelompok kontrol (P0) adalah 149,46 ± 7,73mg/dl dan kelompok perlakuan (P1) adalah 95,00 ± 6,99mg/dl. Analisis kemaknaan dengan uji t-independence menunjukkan 221 bahwa nilai t= 22,171 dan nilai p= 0,000. Rerata kadar kolesterol HDL kelompok kontrol (P0) adalah 26,66 ± 2,29mg/dl dan kelompok perlakuan (P1) adalah 39,07 ± 1,73mg/dl. Analisis kemaknaan dengan uji t-independence menunjukkan bahwa nilai t= -18,360 dan nilai p= 0,000. Rerata kadar kolesterol LDL kelompok kontrol (P0) adalah 67,46 ± 4,08mg/dl dan kelompok perlakuan (P1) adalah 38,95 ± 4,32mg/dl. Analisis kemaknaan dengan uji tindependence menunjukkan bahwa nilai t= 20,366 dan nilai p= 0,000. Hal ini berarti rerata kadar kolesterol total, trigliserida, kolesterol HDL dan kolesterol LDL sesudah perlakuan selama 28 hari antar kelompok kontrol (P0) dan kelompok perlakuan (P1) berbeda sangat bermakna (p<0,01). Berdasarkan hasil di atas didapatkan bahwa kelompok perlakuan (P1) menunjukkan hasil profil lipid yang lebih baik dibandingkan dengan kelompok kontrol (P0). Level total kolesterol antara kedua kelompok menunjukkan perbedaan yang sangat signifikan, yaitu kelompok perlakuan (P1) menunjukkan hasil 48.73% (p<0,01) lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol (P0). Level kolesterol LDL antara kedua kelompok menunjukkan perbedaan yang sangat signifikan, yaitu kelompok perlakuan (P1) menunjukkan hasil 42.26% (p<0,01) lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol (P0). Juga ditemukan hal yang serupa pada level trigliserida, yaitu kelompok perlakuan (P1) menunjukkan hasil yang 36.44 % (p<0,01) lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol (P0). Dan level kolesterol HDL antara kedua kelompok berbeda secara signifikan, yaitu kelompok perlakuan (P1) menunjukkan hasil 46.55% (p<0,01) lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol (P0). 222 Dari evaluasi terhadap berat badan dan sisa pakan didapatkan bahwa berat badan tikus pada kedua kelompok meningkat pada akhir penelitian dan sisa pakan pada kedua kelompok menurun pada akhir penelitian. Berdasarkan analisis komparasi antara kedua kelompok setelah perlakuan didapatkan bahwa tidak terdapat perbedaan bermakna antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dari segi berat badan dengan nilai p= 0.981. Juga didapatkan tidak terdapat perbedaan bermakna antara kedua kelompok setelah perlakuan dari segi sisa pakan, dengan nilai p= 0.563. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa pemberian ekstrak etanol daun stevia rebaudiana memperbaiki profil lipid tanpa dipengaruhi oleh asupan makanan ataupun berat badan. Pada kelompok kontrol (P1) didapatkan rata-rata total kolesterol 218,70 ± 8,53 mg/dl, yang artinya tikus pada kelompok kontrol menderita dislipidemia (Total kolesterol >200mg/dL), sedangkan tikus pada kelompok perlakuan rata-rata total kolesterolnya berada dalam batas normal (112,12 ± 5,91 mg/dl). Sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol daun stevia rebaudiana mencegah dislipidemia pada tikus putih galur wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol. Hasil penelitian ini menunjukkan hasil yang sejalan dengan penelitian sebelumnya oleh Sharma et al. (2007) yang mendapatkan bahwa konsumsi ekstrak stevia menurunkan level kolesterol trigliserida dan LDL kolesterol pada 20 wanita hiperkolesterol secara signifikan, juga didapatkan peningkatan HDL kolesterol sesuai dengan yang diharapkan. 223 Penelitian oleh Xu et al. (2012) pada tikus dengan diet tinggi lemak yang diberikan suplemetasi isosteviol, glikosida dari stevia rebaudiana, selama 7 hari dan dua studi lainnya yang dilakukan pada tikus diabetes juga menunjukkan efek positif yang serupa. Literatur ilmiah menunjukkan bahwa daun stevia mengandung antioksidan dengan peran biokimia yang berbeda-beda, terdiri dari asam askorbat, senyawa fenol, flavonoid dan tannin. Aktivitas antioksidan dari ekstrak daun stevia dikaitkan dengan penangkapan elektron radikal bebas dan superoksid, pencegahan kerusakan oksidatif DNA dilaporkan terjadi secara in vitro oleh ekstrak methanol dan etil asetat daun stevia (Bender et al., 2015; Lemus-Mondaca et al., 2012). Analisis fitokimia yang dilakukan di Laboratorium Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana pada 19 Oktober 2015 menunjukkan beberapa komponen ekstrak etanol daun stevia rebaudiana, yaitu tannin sebesar 54.97% TAE, flavonoid sebesar 20.01% QE (Quercetin Equivalent) dan fenol sebesar 2.49% GAE, serta memiliki kapasitas antiokidan sebesar 44.47% GAEAC (Gallic Acid Equivalent Antioxidant Capacity). Hasil analisis dicantumkan di Lampiran 2. Hasil analisis ini tidak dapat memperlihatkan komposisi ekstrak secara keseluruhan, dikarenakan keterbatasan bahan pembanding laboratorium untuk analisis bahan. Aktivitas anti-hiperlipidemik dari stevia rebaudiana diduga karena kandungan konstituen di dalamnya, meliputi glikosida dan berbagai antioksidan yang terdapat di dalamnya. Kandungan yang terdapat dalam daun stevia rebaudiana yang dapat menurunkan 224 kadar kolesterol dan mencegah dislipidemia adalah steviosida, isosteviol , flavonoid, saponin, tannin dan senyawa fenol. Flavonoid diketahui memiliki aktivitas biologisnya yang luas termasuk aktivitas hipolipidemik dari kerja antioksidannya, diperkirakan berasal dari konstituennya yang bekerja menghambat enzim hydroxyl-methyl-glutaryl-CoA reductase yang berperan dalam biosintesis kolesterol secara de novo. Penghambatan enzim tersebut akan menyebabkan hambatan sintesis kolesterol dan akhirnya penurunan produksi kolesterol (Hossain et al., 2011). Flavonoid dapat meningkatkan resistensi tubuh terhadap oksidasi LDL kolesterol, yang diyakini dapat menghambat aterosklerosis. Flavonoid juga meningkatkan rasio kolesterol HDL/ kolesterol LDL sehingga mempercepat pembuangan kolesterol dari jaringan perifer ke hati untuk katabolisme dan ekskresi. Flavonoid mencegah penghambatan adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) dan bahkan meningkatkan fosforilasi AMPK dan ACC sebanyak dua kali lipat pada hati tikus diabetes, hal yang sama ditemukan pada sel hati manusia (Hepatosit HepG2) yang terpapar glukosa yang tinggi. Hal ini akan menyebabkan penurunan acetyl-CoA carboxylase (ACC) dan lipid hepar dan akhirnya aktivasi AMPK akan menurunkan sintesis lipid serta meningkatkan oksidasi asam lemak. (Chen dan Li, 2007; Niu et al., 2015) Penelitian oleh Elekofehinti et al.(2013) menunjukkan bahwa saponin , yang juga ditemukan pada ekstrak stevia, dapat memperbaiki profil lipid. Penurunan trigliserida yang terjadi diduga melibatkan banyak faktor, diantaranya: penurunan sintesis asam lemak, 225 peningkatan reseptor LDL, aktivasi Lecithin-cholesterol acyl transferase (LCAT) and lipase dan penghambatan acetyl-CoA carboxylase (ACC). Penurunan total kolesterol dikarenakan oleh penurunan absorbsi kolesterol dari usus, melalui ikatan asam empedu, dan peningkatan ekskresi asam empedu feses. Mekanisme lain yang diduga terlibat ialah supresi sintesis kolesterol dengan menurunnya aktivitas 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase). PPAR bertanggung jawab dalam pengambilan, katabolisme dan homeostasis lemak di berbagai jaringan termasuk di hati. Komponen fenol dari berbagai tanaman adalah aktivator PPAR α., sehingga aktivasi PPAR α dapat menurunkan toksisitas lipid melalui biogenesis mitokondrial, peningkatan oksidasi asam lemak, penurunan akumulasi diasilgliserol dan seramid pada jaringan, down-regulation komplek protein terkait adaptor 1 dan aktivasi NFkB. Hasil penelitian menunjukkan level mRNA PPAR di hati ditemukan paling tinggi pada grup dengan suplementasi stevia. Hasil ini mengindikasikan bahwa stevia bisa jadi merupakan ligan / activator alami PPAR α, sehingga terjadi peningkatan gen yang terlibat dalam oksidasi asam lemak (Park dan Cha, 2010). Konsentrasi asil karnitin/ karnitin bebas meningkat di hati setelah pemberian ekstrak stevia, kemungkinan hal ini dikarenakan peningkatan biosintesis karnitin di hati. Karnitin mentranspor asam lemak ke mitokondria, dimana asam lemak mengalami oksidasi beta, sehingga ia memiliki peranan vital dalam mengaktifkan oksidasi asam lemak di jaringan. Karnitin yang rendah akan memperlambat oksidasi beta dan meningkatkan serum lipid. Suplemetasi stevia meningkatkan acid-insoluble acylcarnitine (AIAC), yang artinya 226 ekstrak stevia dapat memperbaiki fungsi metabolik seperti oksidasi asam lemak dan ketogenesis (Park dan Cha, 2010). Stevioside, kandungan aktif stevia rebaudiana, memperbaiki adipogenesis dan pengambilan glukosa di jaringan adipose visceral, yang dibuktikan dengan adanya ekspresi Lxr α (Liver-X-receptor-α), Fabp 4 dan Glut 4 yang tinggi. Induksi Lxr α di jaringan adipose pada pemeberian ekstrak stevia mendukung peningkatan ekspresi Glut 4, yang memperbaiki ambilan glukosa dan Fabp 4, yang memperbaiki metabolisme asam lemak. Stevioside juga memperbaiki pertahanan antioksidan melalui peningkatan ekspresi SOD, yang berhubungan dengan penurunan akumulasi LDL teroksidasi di sirkulasi dan pembuluh darah (Geeraert, 2010). Penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol stevia rebaudiana memiliki kandungan yang bermanfaat dalam kontrol hiperlipidemia, yang diduga sebagai akibat adanya efek antioksidan dan glikosida dari ekstrak etanol stevia rebaudiana, yang secara keseluruhan berkontribusi dalam efek perbaikan profil lipid tikus yang diberikan diet tinggi kolesterol. Namun hasil penelitian ini belum dapat menggambarkan efeknya pada manusia dan mekanisme pasti perlindungan ekstrak etanol stevia rebaudiana terhadap profil lipid darah, sehingga diperlukan penelitian yang lebih lanjut. Penelitian ini juga tidak dapat menunjukkan apakah salah satu dari masing-masing komponek aktif yang terkandung di dalam ekstrak etanol daun stevia rebaudiana yang berperan utama dalam perbaikan profil lipid yang terjadi. 227 Dengan demikian, diharapkan nantinya ekstrak etanol stevia rebaudiana dapat dijadikan sebagai suatu preventive agent dan lebih lanjutnya dapat diekstraksi komponen aktifnya untuk kemudian digunakan sebagai terapi adjuvant terhadap penyakit dislipidemia. 228 BAB VI SIMPULAN DAN SARAN 6.1 Simpulan Berdasarkan hasil penelitian pemberian ekstrak etanol ekstrak etanol stevia rebaudiana pada tikus putih galur wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol selama 28 hari dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut: 1. Pemberian ekstrak etanol stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kgBB secara oral mencegah peningkatan kadar kolesterol total serum tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol. 2. Pemberian ekstrak etanol stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kgBB secara oral mencegah peningkatan kadar LDL kolesterol tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol. 3. Pemberian ekstrak etanol stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kgBB secara oral mencegah peningkatan kadar trigliserida tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol. 4. Pemberian ekstrak etanol stevia rebaudiana dengan dosis 300mg/kgBB secara oral mencegah penurunan kadar HDL kolesterol serum tikus wistar jantan yang diberikan diet tinggi kolesterol. 229 6.2 Saran Sebagai saran dalam penelitian ini adalah : 1. Perlu dilakukan ekstraksi kandungan zat aktif dari ekstrak etanol daun stevia rebaudiana sehingga dapat diketahui zat aktif yang berperan dalam memperbaiki profil lipid. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan komponen zat aktif stevia rebaudiana untuk mengkaji efektivitasnya dalam memperbaiki profil lipid 3. Perlu dilakukan penelitian lanjutan terhadap ekstrak etanol daun stevia rebaudiana dengan menggunakan subyek penelitian yang berbeda dan atau variabel lainnya kemudian dilanjutkan dengan clinical trial. 230 DAFTAR PUSTAKA Anonim. 2015. Stevia Rebaudiana. October. [cited 2015 Oct. 30]. Available at: URL: https://en.wikipedia.org/wiki/Stevia_rebaudiana Barosso, E., Serrano-Marco, L., Salvado, L., Palomer, X., Vazguez-Carrera, M. 2012. Peroxisome Proliferator-Activated Receptor β/δ (PPAR β/δ) as a Potensial Therapeutic Target for Dyslipidemia. In: Kelishadi, R., editor. Dyslipidemia – From Prevention to Treatment. 1st edition. InTech Baynes, J., Dominiczak, M. 2005. Medical Biochemistry. 2nd Edition. Edinburgh: Elsevier Mosby Bender, C., Graziano, S., Zimmermann, B. F. 2015. Study of Stevia rebaudiana Bertoni antioxidant activities and cellular properties. Int J Food Sci Nutr. 66(5). 553–558. Blood Cholesterol Levels of Hypercholesterolemic Rat (Rattus norvegicus) after VCO Treatment. Nusantara Bioscience, 1(2). Bloomfield, P., Bradbury, A., Grubb, N. R., Newby, D. E. 2006. Cardiovascular disease. In: Boon, N. A., Colledge, N. R., Walker, B.R., Hunter, J. A. A., editors. Davidson’s Principle & Practice of Medicine. 20th edition. Toronto: Churcill Livingstone . Elsevier. P. 581-601. Chan, P., Tomlison, B., Chen, Y. J., Liu, J. C., Hsieh, M. H., Cheng, J. T. 2000. A Double-Blind Placebo-Controlled Study of the Effectiveness and Tolerability of Oral Stevioside in Human Hypertension. British Journal of Clinical Pharmacology, 50(3). 215-220. Chen, J., Li, X. 2007. Hypolipidemic effect of flavonoids from mulberry leaves in triton WR1339 induced hyperlipidemic mice. Asia Pacific Journal Clinical Nutrition. 16 (1). P: 290-294. Colledge, N. R. 2006. Ageing and Disease. In: Boon, N. A., Colledge, N. R., Walker, B.R., Hunter, J. A. A., editors. Davidson’s Principle & Practice of Medicine. 20th edition. Toronto: Churcill Livingstone . Elsevier. P. 159-171. Elekofehinti, O. O., Kamdem, J. P., Kade, I. J., Rocha, J. B. T., Adanlawo, I.G. 2013. Hypoglycemic, antiperoxidative and antihyperlipidemic effects of saponins from Solanum anguivi Lam. fruits in alloxan-induced diabetic rats. South African Journal of Botany. 88. P: 56–61. 231 Fakhrzadeh, H., Tabatabaei, O. 2012. Dyslipidemia and Cardiovascular Disease. In: Kelishadi, R., editor. Dyslipidemia – From Prevention to Treatment. 1st edition. InTech Federer, W. 2008. Statistics and society: Data collection and interpretation. Second Edition. New York: Marcel Dekker. Ferrucci, L., Studenski, S. 2014. Clinical Problems of Aging. In: Longo, D. L., Fauci, A., Kasper, D., Hauser, S., Jameson, J. L., Loscalzo, J., editors. Harrison’s Principle of Internal Medicine. 18th edition. New York: McGraw-Hill. p. 570-585. Field, M.J., Burnett, L., Sullivan, D.R., Steward, P. 2006. Clinical Biochemistry and Metabolism. In: Boon, N. A., Colledge, N. R., Walker, B.R., Hunter, J. A. A., editors. Davidson’s Principle & Practice of Medicine. 20th edition. Toronto: Churcill Livingstone . Elsevier. P. 443-451. Gawel-Beben, K., Bujak, T., Niziol-Lukaszewska, Z., Antosiewicz, B., Jacubczyk, A., Karas, M., Rybczynska, K. 2015. Stevia Rebaudiana Bert. Leaf Extracts as a Multifunctional Source of Natural Antioxidants. (serial online), March. [cited 2015 September. 20]. Available from: URL: http://www.mdpi.com/1420-3049/20/4/5468 Geeraert, B., Crombe, F., Hulsmans, M., Benhabiles, N., Geuns, J. M., Hoelvet, P. 2010. Stevioside inhibits atherosclerosis by improving insulin signaling and antioxidant defense in obese insulin-resistant mice. International Journal of Obesity, 34. P: 569577. Geuns, J. M. C. 2002. Safety Evaluation of Stevia and Stevioside. Studies on Natural Product Chemistry. 27. P: 299-319. Giada, M. D. L. R. 2013. Food Phenolic Compounds: Main Classes, Sources, and Their Antioxidant Power. In: Morales-Gonzalez, J. A., editor. Oxidative Stress and Chronic Degenerative Disease – A Role for Antioxidants. 1st edition. InTech Golberg, A. C. 2015. Dyslipidemia (Hyperlipidemia). August 2015, [cited 2015 Oct. 30]. Available from: http://www.merckmanuals.com/professional/endocrine-andmetabolic-disorders/lipid-disorders/dyslipidemia Goyal, S. K., Samsher, Goyal, R. K. 2010. Stevia (Stevia rebaudiana) a bio-sweetener: a review. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 61:1, 1-10. 232 Grundy, S. M. 2006. Nutrition in the Management of Disorder of Serum Lipids dan Lipoprotein. In Modern Nutrition in Health dan Disease. 10th Ed. p 1076-1094. Lippincott Williams dan Wilkins, Baltimore. Grundy, S.M., Becker, D., Clark, L.T., Cooper, R. C., Denke, M. A., Howard, W. J.., Hunninghake, D. B., Illingworth, D. R., Luepker, R. V., McBride, P., Mckenney, J. M., Pternak, R. C., Stone, N. J., Horn, L. V. 2002. Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III) Final Report, December., [cited 2015 Oct. 25] Available from: URL: http://circ.ahajournals.org/content/106/25/3143.full.pdf Gupta, R., Yadav, V.,Rastogi, M. 2014. A Review on Importance of Natural Sweetener, A Zero Calorie Plant – Stevia – Having Medicinal and Commercial Importance. International Journal of Food and Nutritional Sciences, 3(3), 90-94. Guyton and Hall. 2007. Lipid Metabolism. Textbook of Medical Physiology. Eleventh Edition. Philadelphia: Elsevier Saunders. Halim, H. Majalah Kedokteran. Damianus. V(01), No.3 September 2006. Harini, M., Astirin, O.P. 2009. Hossain, M. S., Alam, M. B., Asadujjaman, M., Islam, M. M., Rahman, M. A., Islam, M. A., Islam, A. 2011. Antihyperglycemic and Antihyperlipidemic Effect of Different Fraction of Stevia Rebaudiana Leaves in Alloxan Induced Diabetic Rat. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 2(7). 1722-1729. Illingworth, D. R. 2002. Lipid Lowering Drugs : An Overview of Indications dan Optimum Theraupeutic Use. Drugs. 33. P: 259-79 Jahan, I. A., Mostafa, M., Hossain, H., Nimmi, I., Sattar, A., Alim, A., Moeiz, S. M. I. 2010. Antioxidant Activity of Stevia Rebaudiana Bert. Leaves from Bangladesh. Bangladesh Pharmaceutical Journal, 13 (2), P: 67-75. Jellinger, P. S., Smith, D. A., Mehta, A. E., Ganda, O., Handelsman. Y., Rodbard, H. W., Shepherd. M. D., Seibel, J. A. 2012. American Association of Clinical Endocrinologist Guidelines for Management of Dyslipidemia and Prevention of Atherosclerosis. (serial online), March/April., [cited 2015 Oct. 10]. Available from: URL: https://www.aace.com/files/lipid-guidelines.pdf 233 Jun, L., Fehn, R. 2006. High-fat diet induced insulin resistance is more robust and reliable in Wistar than Sprague-Dawley Rats. Department of Biology California State University, San Bernardino Kanter, M. M., Kris-Etherton, P. M., Fernandes, M. L., Vickers, K. C., Katz, D. L. 2012. Exploring the Factor That Affect Blood Cholesterol and Heart Disease Risk: Is Dietary Cholesterol as Bad for You as History Leads Us to Believe?. Advances in Nutrition. 3. P: 711-717. Kathleen, M., Botham, P., Peter, A., Mayes, P. D. DS. 2006. Oxidation of Fatty Acids. In Harper’s Illustrated Biochemistry. 27th Ed. p 194-198. McGraw Hill. New York King, M. W. 2016. The Medical Biochemistry Page. May 2016, [cited 2016 Jul. 13]. Available from: http://themedicalbiochemistrypage.org/cholesterol.php Koolman, J., Roehm, K. H. 2005. Color Atlas of Biochemistry. 2nd Edition. New York: Thieme. P:162-173. Krinke, G. J. 2000. The Laboratory Rat. The Handbook of Experimental Animals. Academic Press. p. 3-56. Kujur, R. S., Singh, V., Ram, M., Yadava, H. N., Singh, K. K., Kumari, S., Roy, B.K. 2010. Antidiabetic activity and phytochemical screening of crude extract of Stevia rebaudiana in alloxan-induced diabetic rats. Pharmacognosy Research. 2(4). P: 258263. Kusumawati, D. 2004. Bersahabat dengan Hewan Coba. Yogyakarta: Gadjahmada University Press. Lemus-Mondaca, R., Vega-Galves, A., Zura-Bravo, L., Ah-Hen, K. 2012. Stevia rebaudiana Bertoni, source of a high-potency natural sweetener: A comprehensive review on the biochemical, nutritional and functional aspects. Food chemistry, 132 (3). 1121–1132. Lichtenstein, A. H., Jones, P. J. H. 2001. Lipids Absorption and Transport. Present Knowledge in Nutrition. 8th Ed. Washington DC: ILSI Press. P: 93-103. Madan, S., Ahmad, S., Singh, G. N., Kohli, K., Kumar, Y., Singh, R., Garg, M. 2010. Stevia rebaudiana (Bert.)-A Review. Indian Journal of Natural Product and Resources. 1(3). 267-286. 234 Malole, M. B. M., Pramono, U. S. C. 1989. Penggunaan Hewan-Hewan Percobaan di Laboratorium. Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Mangkoewidjojo, S. 1988. Pemeliharaan, Pembiakan dan Penggunaan Hewan Percobaan di Daerah Tropis. UI Press. Hal 37-38 Marczyk, G., Matteo, D., and Festinger, D. 2005. Essentials of Research Design and Methodology. New Jersey: John Wiley and Sons. Page.105. Mark, D. B., Mark, A. D., Smith, C. M. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar. Jakarta: EGC. Martin, GM. 2014. The Biology of Aging. In: Longo, D. L., Fauci, A., Kasper, D., Hauser, S., Jameson, J. L., Loscalzo, J., editors. Harrison’s Principle of Internal Medicine. 18th edition. New York: McGraw-Hill. p. 565-569. Mayes, P. A. 2003a. Lipid yang Memiliki Makna Fisiologis. In: Murray R. K., Granner, D. K., Mayes, P. A., Rodwell, V. W. Biokimia Harber. Edisi 25, Jakarta: EGC. P: 148-159. Mayes, P. A. 2003b. Pengangkutan dan Penyimpanan Lipid. In: Murray R. K., Granner, D. K., Mayes, P. A., Rodwell, V. W. Biokimia Harber. Edisi 25, Jakarta: EGC. P: 254-269. Mayes, P. A. 2003c. Sintesis, Pengangkutan dan Ekskresi Kolesterol. In: Murray R. K., Granner, D. K., Mayes, P. A., Rodwell, V. W. Biokimia Harber. Edisi 25, Jakarta: EGC. P: 270-281. Mayes, P. A. 2003d. Oksidasi Asam Lemak: Ketogenesis. In: Murray R. K., Granner, D. K., Mayes, P. A., Rodwell, V. W. Biokimia Harber. Edisi 25, Jakarta: EGC. P: 225-235. Mc Carty, A. D., Lai, A. M., McCarty, S.D., Singh, S. 2012. Analysis of Nutritive Value and Shelf Life of Products Prepared from Stevia Powder. Elixir Food Science, 48. P: 9538-9541. Muray, D.V.J. The inter-relationship of hypertension, dyslipidemia and atherosclerosis, the important role of the endothelium. J.Drug Dev. 1991;4 (suppl) 3,7. Ngatidjan. 2006. Metode Laboratorium dalam Toksikologi. Metode Uji Toksisitas, p 86. Niu, H., Li, K., Ma, L., Gong, W., Huang, W. 2015. Molecular Mechanism of Action for the Geranyl Flavonoid to Counter Dyslipidemia in Diabetic Milieu. Journal of Food and Nutrition Research. 3 (6). P: 371-378. Pangkahila, W. 2007. Anti Aging Medicine : Memperlambat Penuaan, Meningkatkan Kualitas Hidup. Cetakan ke-1. Jakarta : Penerbit Buku Kompas. Halaman : 8-17. 235 Pangkahila, W. 2011. Anti Aging Medicine : Tetap Muda dan Sehat. Cetakan ke-1. Jakarta : Penerbit Buku Kompas. Halaman: 1-3, 9-10, 36-40. Park, J. E., Cha, Y. S. 2010. Stevia Rebaudiana Bertoni Extract Supplementation Improves Lipd and Carnitine Profiles in C57BL/6J Mice Fed a High-fat Diet. J Sci Food Agric, 90. 1099-1105. Perhimpunan Dokter Spesialis Kardiovaskular Indonesia (PERKI). 2013. Pedoman Tata Laksana Dislipidemia. Edisi 1. Centra Communications. Jakarta Poljsak, B., Milisav, I. 2013. Aging, Oxidative Stress and Antioxidant, In: Morales-Gonzalez, J. A., editor. Oxidative Stress and Chronic Degenerative Disease – A Role for Antioxidants. 1st edition. INTECH Rader, D.J., Hobbs, H. H. 2014. Disorder of Lipoprotein Metabolism. In: Longo, D. L., Fauci, A., Kasper, D., Hauser, S., Jameson, J. L., Loscalzo, J., editors. Harrison’s Principle of Internal Medicine. 18th edition. New York: McGraw-Hill. p. 3145-3161. Raini, M., Isnawati, A. 2011. Kajian: Khasiat dan Keamanan Stevia sebagai Pengganti Gula. Media Litbang Kesehatan, 21 (4). 145-156. Rosenseon, R. S. 2012. Screening guidelines for dyslipidemia. In Freeman, M. W., Rind, D. M., editors. April 2015, [cited 2015 Oct. 30]. Available from: http://www.uptodate.com/contents/screening-guidelines-for-dyslipidemia Rosenson, R. S., Treatment of Dyslipidemia in the Older Adult. May 7th 2015, [cited 2015 Oct. 30]. Available from: URL: http://www.uptodate.com/contents/treatment-ofdyslipidemia-in-the-older-adult Rui-Li, Y., Yong-Hui, S., Gang, H., Wu, L., Guo-Wei, L. 2008. Increasing Oxidative Stress with Progressive Hyperlipidemia Human: Relation between Malondialdehyde and Atherogenic Index. J. Clin. Biochem. Nutr. 43: 154-158. Savita, S. M., Sheela, K., Sunanda, S., Shankar, A. G., Ramakrishna, P., Sakey, S. 2004. Health Implication of Stevia Rebaudiana. J. Hum. Ecol., 15(3). 191-194. Sengupta, P. 2013. The Laboratory Rat: Relating Its Age With Human’s. Int J Prev Med. 4(6). P: 624–630 Shao, H., Chen, L. Q., Xu, J. 2011. Treatment of Dyslipidemia in the Elderly. Journal of Geriatric Cardiology. 8. 55-64. 236 Sharma, N., Mogra, R., Upadhyay, B. 2009. Effect of Stevia Extract Intervention on Lipid Profile. Studies on Ethno-Medicine, 3(2), 137-140. Singh, S., Garg, V. 2014. Antidiabetic, Antidyslipidemic and Antioxidative Potensial of Methanolic Root Extract of Stevia Rebaudiana (Bertoni) on Alloxan Induced Diabetic Mice. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences , 3(7). 1859-1872. Singh, S., Garg, V., Yadav, D. 2013. Antihyperglycemic and Antioxidative Ability of Stevia Rebaudiana (Bertoni) Leaves in Diabetic Induced Mice. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 5(2). 297-302. Smith, J. B., Mangkoewidjojo, S. 1988. Pemeliharaan, Pembiakan dan Penggunaan Hewan Percobaan di Daerah Tropis. Jakarta: Penerbit Universitas Indonesia (UI Press), halaman 30 - 32 , 43-44, 54,57. Sultana B., Anwar F., Ashraf M. 2009. Effect of extraction solvent/technique on the antioxidant activity of selected medicinal plant extracts. Molecules 14, 2167-2180 Surya, S. Y. 2015. Perbandingan Efek Ekstrak Etanol Stevia Rebaudiana 150mg/kg BB dengan 300mg/kg BB terhadap Profil Lipid pada Tikus Putih yang Diberikan Diet Tinggi Kolesterol. Penelitian Pendahuluan. Vasko, L., Vaskova, J., Fejercakova, A., Mojzisova, G., Poracova, J. 2014. Comparison of some antioxidant properties of plant extracts from Origanum vulgare, Salvia officinalis, Eleutherococcus senticosus and Stevia rebaudiana. In Vitro Cell Dev Biol Anim 50:614–622. Welsh, J. A., Sharma, A., Abramson, J. L., Vaccarino, V., Gillespie, C., Vos, M. B. 2010. Caloric Sweetener Consumption and Dyslipidemia Among US Adult. Journal of the American Medical Association. 303 (15). P: 1490-1497. Winarsi, H. 2007. Antioksidan alami dan Radikal Bebas: Potensi dan Aplikasinya dalam Kesehatan. Yogyakarta: Kanisius. P: 49-60. Xu, D., Xu, M., Lin, L., Rao, S., Wang, J., Davey, A. K. 2012. The effect of isosteviol on hyperglycemia and dyslipidemia induced by lipotoxicity in rats fed with high-fat emulsion. Life Sciences. 90. P: 30-38. 237 Lampiran 1 238 Lampiran 2 239 Lampiran 3 ANALISIS DESKRIPTIF Report Kolesterol Total (mg/dl) Kelompok N Mean Std. Deviation Median Minimum Maximum P0 18 218.7000 8.52511 219.8950 203.88 232.18 P1 18 112.1228 5.90691 111.4350 102.19 123.14 Total 36 165.4114 54.52575 163.5100 102.19 232.18 Report Trigliserida (mg/dl) Kelompok N Mean Std. Deviation Median Minimum Maximum P0 18 149.4578 7.72881 150.1250 135.92 162.81 P1 18 95.0039 6.98924 97.2150 84.88 110.32 Total 36 122.2308 28.55219 123.1200 84.88 162.81 Report HDL (mg/dl) 240 Kelompok N Mean Std. Deviation Median Minimum Maximum P0 18 26.6650 2.28741 26.0900 23.87 30.36 P1 18 39.0689 1.72720 38.6550 36.07 43.28 Total 36 32.8669 6.59950 33.2150 23.87 43.28 Report LDL (mg/dl) Kelompok N Mean Std. Deviation Median Minimum Maximum P0 18 67.4633 4.08119 68.0550 60.73 77.42 P1 18 38.9528 4.31513 40.2500 32.04 46.17 Total 36 53.2081 15.03840 53.4500 32.04 77.42 Lampiran 4 UJI NORMALITAS DATA Kolmogorov-Smirnov Kelompok Kolesterol Total (mg/dl) Trigliserida (mg/dl) Statistic df a Shapiro-Wilk Sig. Statistic df Sig. * .933 18 .218 18 .093 .957 18 .548 .199 18 .059 .941 18 .298 .168 18 .194 .915 18 .107 P0 .148 18 P1 .188 P0 P1 .200 241 HDL (mg/dl) LDL (mg/dl) P0 .192 18 P1 .166 18 P0 .144 P1 .158 a. Lilliefors Significance Correction *. This is a lower bound of the true significance. .079 .894 18 .065 .200 * .937 18 .256 18 .200 * .947 18 .379 18 .200 * .929 18 .183 242 Lampiran 5 UJI HOMOGENITAS DATA Levene Statistic Kolesterol Total (mg/dl) Trigliserida (mg/dl) HDL (mg/dl) LDL (mg/dl) df1 df2 Sig. Based on Mean .804 1 34 .376 Based on Median .542 1 34 .467 Based on Median and with adjusted df .542 1 24.630 .468 Based on trimmed mean .778 1 34 .384 Based on Mean .014 1 34 .907 Based on Median .002 1 34 .965 Based on Median and with adjusted df .002 1 33.590 .965 Based on trimmed mean .027 1 34 .870 Based on Mean 3.539 1 34 .069 Based on Median 2.019 1 34 .164 Based on Median and with adjusted df 2.019 1 33.638 .165 Based on trimmed mean 3.436 1 34 .072 Based on Mean .511 1 34 .479 Based on Median .333 1 34 .568 Based on Median and with adjusted df .333 1 33.990 .568 Based on trimmed mean .460 1 34 .502 243 244 Lampiran 6 ANALISIS KOMPARASI Independent Samples Test Levene's Test for Equality of Variances t-test for Equality of Means 95% Confidence Interval of the Difference F Kolesterol Equal variances Sig. .804 .376 t 43.597 df Sig. (2- Mean Std. Error tailed) Difference Difference Lower Upper 34 .000 106.57722 2.44460 101.60920 111.54524 43.597 30.265 .000 106.57722 2.44460 101.58652 111.56792 22.171 34 .000 54.45389 2.45610 49.46249 59.44529 22.171 33.662 .000 54.45389 2.45610 49.46064 59.44714 34 .000 -12.40389 .67558 -13.77684 -11.03094 -18.360 31.630 .000 -12.40389 .67558 -13.78064 -11.02714 .000 28.51056 1.39993 25.66555 31.35556 Total (mg/dl) assumed Equal variances not assumed Trigliserida Equal variances (mg/dl) assumed .014 .907 Equal variances not assumed HDL (mg/dl) Equal variances 3.539 .069 -18.360 assumed Equal variances not assumed LDL (mg/dl) Equal variances assumed .511 .479 20.366 34 245 Equal variances not assumed 20.366 33.895 .000 28.51056 1.39993 25.66523 31.35588 246 Lampiran 7 Hasil Pemeriksaan Profil Lipid Setelah Perlakuan 247 Lampiran 8 Data Berat Badan Tikus Data BB 18 K18 185 199 No BB awal BB akhir 19 P1 190 205 1 K1 170 181 20 P2 176 187 2 k2 190 200 21 P3 183 193 3 K3 180 189 22 P4 180 193 4 K4 175 185 23 P5 178 190 5 K5 183 193 24 P6 190 201 6 K6 185 197 25 P7 193 203 7 K7 195 210 26 P8 178 190 8 K8 179 193 27 P9 173 187 9 K9 176 186 28 P10 175 189 10 K10 187 200 29 P11 180 194 11 K11 186 200 30 P12 192 204 12 K12 196 206 31 P13 190 203 13 K13 179 192 32 P14 187 198 14 K14 181 195 33 P15 189 200 15 K15 176 188 34 P16 174 186 16 K16 193 204 35 P17 180 192 17 K17 181 193 36 P18 186 197 116 Lampiran 9 Data Sisa Pakan tikus Hari ke 19 P1 10 11 10 8 7 1 2 26 27 28 20 P2 12 8 8 11 8 1 K1 12 14 8 9 7 21 P3 9 8 7 12 8 2 k2 11 10 8 12 8 22 P4 11 10 9 8 9 3 K3 10 11 9 13 6 23 P5 10 8 8 9 8 4 K4 11 12 8 11 8 24 P6 10 12 7 5 6 5 K5 10 11 8 7 9 25 P7 9 12 7 9 11 6 K6 10 11 9 8 7 26 P8 10 11 7 8 6 7 K7 10 5 7 8 9 27 P9 11 12 9 8 7 8 K8 9 12 9 8 7 28 P10 11 12 7 8 7 9 K9 10 12 11 9 9 29 P11 11 8 5 8 9 10 K10 10 8 9 8 7 30 P12 10 8 9 7 8 11 K11 11 8 7 9 8 31 P13 11 8 7 9 8 12 K12 10 8 5 13 7 32 P14 11 9 8 8 7 13 K13 11 8 9 5 8 33 P15 10 6 8 7 10 14 K14 10 6 7 6 8 34 P16 11 8 9 7 8 15 K15 11 8 8 9 8 35 P17 10 11 7 6 8 16 K16 10 8 8 9 7 36 P18 11 7 9 6 7 17 K17 11 9 6 5 7 18 K18 10 11 5 8 8 Lampiran 10 ANALISIS KOMPARASI BB POST TEST DAN RERATA SISA PAKAN 3 HARI TERAKHIR Group Statistics Kelompok BB Pakan N Mean Std. Deviation Std. Error Mean Kontrol (P0) 18 195.06 7.689 1.812 Perlakuan (P1) 18 195.11 6.398 1.508 Kontrol (P0) 18 8.0741 .90428 .21314 Perlakuan (P1) 18 7.9074 .80688 .19018 Independent Samples Test t-test for Equality of Means Levene's Test for Equality of Variances F BB Equal variances assumed .245 Sig. .624 Equal variances not assumed Pakan Equal variances assumed .006 .940 95% Confidence Interval of the Difference t Sig. (2Mean tailed) Difference df Std. Error Difference Lower Upper -.024 34 .981 -.056 2.358 -4.847 4.736 -.024 32.912 .981 -.056 2.358 -4.852 4.741 .583 34 .563 .16667 .28565 -.41385 .74719 116 Independent Samples Test t-test for Equality of Means Levene's Test for Equality of Variances F BB Equal variances assumed .245 Sig. .624 Equal variances not assumed Pakan Equal variances assumed Equal variances not assumed BB p = 0,981 .006 .940 95% Confidence Interval of the Difference t Sig. (2Mean tailed) Difference df Std. Error Difference Lower Upper -.024 34 .981 -.056 2.358 -4.847 4.736 -.024 32.912 .981 -.056 2.358 -4.852 4.741 .583 34 .563 .16667 .28565 -.41385 .74719 .583 33.568 .563 .16667 .28565 -.41413 .74746 Pakan p=0,563 Kesimpulan: Pakan dan berat badan tikus tidak berbeda antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan cx