Peranan RNA interference pada Embryonic Stem Cell

TINJAUAN PUSTAKA
iPS dan ditransplantasikan kembali untuk
berdiferensiasi sesuai kebutuhan jaringan
resipien tanpa risiko reaksi penolakan jaringan.
Beberapa hal yang perlu diperhatikan sebelum
proses translasi adalah23 1) menghilangkan
genom virus yang terintegrasi 2) menghilangkan risiko terbentuknya tumor 3) protokol
diferensiasi yang efisien, dan terakhir 4) melakukan sequencing DNA koloni sel iPS yang
menjadi kandidat untuk digunakan dalam
terapi. Genom sel hasil induksi lalu dibandingkan dengan genom sel resipien sehingga
mutasi yang terjadi selama proses transduksi
dapat diidentifikasi.24
Sel iPS menjanjikan masa depan yang menarik, baik di bidang penelitian dasar maupun aplikasi klinis. Tidak adanya problem
etika seperti pada sel punca embrional menyebabkan penelitan sel iPS meningkat secara
eksponensial hanya dalam 4 tahun sejak
terobosan oleh Yamanaka pada tahun 2006.
Kendala yang ada menunjukkan teknologi
ini masih pada tahap awal dan membutuhkan
lebih banyak perhatian dari komunitas ilmiah.
TINJAUAN PUSTAKA
DAFTAR PUSTAKA
1. Dimos JT et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor
neurons. Science 2008;321:1218-21.
2. Viczian AS SE, Lyou Y, Zuber ME. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biology 2009;7.
3. Lamba DA, McUsic A, Hirata RK, Wang P-R, Russell D, Reh TA. Generation, purification and transplantation of
photoreceptors derived from human induced pluripotent stem cells. PLoS ONE 2010; 5.
4. Wernig M et al. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and
improve symptoms of rats with Parkinson's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 2008;105:5856-61.
5. Stem Cells Basics. National Institute of Health, 2009
6. Alberio R, Campbell KH, Johnson AD. Reprogramming somatic cells into stem cells. Reproduction 2006;132:709-20.
7. Gurdon JB, Melton DA. Nuclear reprogramming in cells. Science 2008;322:1811-5.
8. Yamanaka S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Trans. Royal Soc. B: Biol.Sci. 2008; 363:2079-87.
9. Suhr ST, Chang EA, Rodriguez RM, Wang K, Ross PJ, Beyhan Z, Murthy S, Cibelli JB. Telomere dynamics in human
cells reprogrammed to pluripotency. PLoS ONE 2009; 4.
10. Eminli S, Utikal J, Arnold K, Jaenisch R, Hochedlinger K. Reprogramming of neural progenitor cells into induced
pluripotent stem cells in the absence of exogenous Sox2 expression. Stem Cells 2008; 26: 2467-74.
11. Geoghegan EBL. Mouse induced pluripotent stem cells. Int.J.Dev.Biol. 2008; 52.
12. Aoi T et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science 2008; 321: 699-702.
13. Freund CD,Gkatzis RP, Ward-van Oostwaard K, D, Mummery CL. The first reported generation of human induced
pluripotent stem cells (iPS cells) and iPS cell derived cardiomyocytes in the Netherlands. Netherlands Heart Journal
2010;18.
14. Tat PA, Sumer H, Jones KL, Upton K, Verma PJ. The efficient generation of induced pluripotent stem (iPS) cells from
adult mouse adipose tissue-derived and neural stem cells. Cell Transplantation 2010.
15. Welstead GG, Brambrink T, Jaenisch R. Generating iPS cells from MEFS through forced expression of Sox-2, Oct-4,
c-Myc, and Klf4. JoVe 2008; 14.
16. Hamilton B, Feng Q, Ye M, Welstead GG. Generation of induced pluripotent stem cells by reprogramming mouse embryonic
fibroblasts with a four transcription factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System. JoVe 2009; 33.
17. Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J, Weir G, Hochedlinger K. Induced pluripotent stem cells generated without viral
integration. Science 2008; 322: 945-9.
18. Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells
without viral vectors. Science 2008;322:949-53.
19. Zhou H et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. 2009; 4: 381-4.
20. Shao L, Wu W-S. Gene-delivery systems for iPS cell generation. Expert Opinion on Biological Therapy 10, 231-42.
21. Sun N, Longaker MT, Wu JC. Human iPS cell-based therapy considerations before clinical applications. Cell Cycle 2010;8.
22. Cohen JB, Krause DS. Understanding the mysteries of iPS cells. Yale J. Biol. Med. 2009;82.
23. Rolletschek A, Wobus AM. Induced human pluripotent stem cells: promises and open questions. Biological Chemistry
2009;390: 845-9.
24. Nakayama M. Cell therapy using induced pluripotent stem (iPS) cells meets next-next generation DNA sequencing
technology. Current Genomics 2009;10.
Peranan RNA interference pada
Embryonic Stem Cell
Dwi Agustina, Caroline T. Sardjono, Boenjamin Setiawan, Ferry Sandra
Stem Cell and Cancer Institute, Kalbe Pharmaceutical Company, Jakarta 13210, Indonesia
ABSTRAK
Mekanisme diferensiasi embryonic stem cell (ESC) masih terus dipelajari. ESC memungkinkan produksi berbagai jenis sel secara
in vitro untuk pengobatan penyakit degeneratif. Salah satu cara untuk mengembangkan potensi tersebut adalah dengan
pengontrolan pengarahan diferensiasi ESC untuk menghasilkan populasi jenis sel yang spesifik. Berbagai penelitian menunjukkan
berbagai metode untuk memurnikan jenis sel yang akan diarahkan dari ESC, dengan tujuan meningkatkan spesifisitas sel. Tidak
menutup kemungkinan dipakainya metode penekanan terhadap ekspresi gen tertentu sehingga hanya ekspresi gen yang
diinginkanlah yang akan terekspresi. RNA interference (RNAi) merupakan salah satu cara ekspresi gen tertentu dihambat secara
in vitro. RNAi menguraikan double-stranded RNA (dsRNA), paling umum dikenal sebagai short-interfering RNA (siRNA),
menyebabkan penurunan target mRNA yang homolog. Akan dijelaskan peranan RNAi dalam ESC; para peneliti berfokus pada
proses diferensiasi ESC yang melibatkan penurunan ekspresi gen Oct4, yang berperan menjaga tahap undifferentiated dari ESC.
Kata Kunci: Embryonic stem cell, perkembangan, RNA interference, gen Oct4, diferensiasi.
Pendahuluan
Embryonic stem cell (ESC), yang memiliki
kemampuan untuk memperbanyak dirinya
secara terus-menerus dan berdiferensiasi menjadi berbagai jenis sel secara in vitro, sangat
menjanjikan dalam bidang pengobatan penyakit degeneratif. Kunci untuk membuka
potensi ini adalah dengan mengembangkan
metode untuk mengendalikan ekspresi gen
dan, sebagai hasilnya, diferensiasi sel. Sel ini
juga menyediakan suatu sistem untuk mempelajari dasar mekanisme molekular yang mengendalikan awal perkembangan. Tantangan
terbesar saat ini adalah bagaimana mengembangkan metode pengarahan diferensiasi ESC
dengan pengontrolan untuk menghasilkan
populasi individu dari jenis sel yang spesifik.
Pemahaman jalur molekular yang menerangkan pluripotensi ESC, self-renewal, dan diferensiasi sangat penting untuk memecahkan
tantangan tersebut.4,5,9
Beberapa tahun terakhir, RNA interference
(RNAi) merupakan teknik yang sangat berpotensi untuk menghambat ekspresi gen
secara in vitro. Sampai saat ini, beberapa
penelitian menunjukkan bahwa RNAi bekerja
di dalam Planaria, Trypanosoma, lalat, mencit,
dan tumbuhan. Penelitian-penelitian tersebut
dapat dijadikan acuan yang mendasari digunakannya RNAi untuk inaktivasi gen pada
manusia.6
C DK 1 8 6 / Vo l. 38 no. 5/Jul i -A g us tus 2011
331
332
Pemahaman tentang RNAi dapat menjelaskan
proses ketika double-stranded RNA (dsRNA),
paling umum dikenal sebagai short-interfering
atau small-interfering RNA (siRNA), menyebabkan penurunan target mRNA yang homolog.
Dalam lintasan tersebut, siRNA untai ganda
(double stranded) dipercaya bertemu dengan
suatu rangkaian protein, dikenal sebagai RNAinduced silencing complex (RISC), yang mengatur hibridisasi urutan antisense siRNA ke
urutan target komplementernya dan memulai pembelahan mRNA target. Walaupun
RNAi sangat menjanjikan sebagai alat untuk
mempelajari dasar biologi stem cell atau untuk
mengarahkan diferensiasi dengan cara spesifik,
penghambat efisiensi gen peredam dapat
membatasi kegunaan RNAi. Efisiensi transfeksi yang tinggi memerlukan identifikasi
urutan siRNA yang aktif dan spesifik, yang
hingga saat ini masih menjadi tantangan bagi
peneliti stem cell yang menggunakan teknik
RNAi.4
RNAi dapat dimanfaatkan untuk memanipulasi pemberian lintasan sinyal spesifik dalam
waktu tertentu; hal tersebut akan mempengaruhi pemilihan lintasan spesifik diferensiasi
stem cell yang pluripoten. Untuk menyelidiki
kemungkinan tersebut, RNAi telah digunakan
untuk menentukan apakah faktor transkripsi
Oct4 diperlukan untuk menjaga tahap tidak
berdiferensiasi ESC dan apakah penekanan
ekspresi Oct4 dapat menyebabkan diferensiasi ke arah trophectoderm. ESC mencit
menunjukkan adanya ketergantungan akan
tingkat ekspresi Oct4 untuk menjaga agar
stem cell tidak berdiferensiasi, termasuk tidak
terjadinya diferensiasi ke arah trophectoderm.5
RNA interference
Asam ribonukleat (ribonucleic acid, RNA)
adalah bahan genetik yang memainkan peran
utama dalam ekspresi genetik. Dalam dogma
pokok genetika molekular, RNA merupakan
perantara informasi yang dibawa DNA dan
ekspresi fenotipik yang diwujudkan dalam
bentuk protein.8
RNA hadir di alam dalam berbagai wujud atau
tipe. Sebagai bahan genetik, RNA berwujud
sepasang pita (dsRNA). Dalam genetika molekular klasik, telah dikenal tiga tipe RNA
yang terlibat dalam proses sintesis protein:14
1. RNA-kurir (messenger-RNA, mRNA), yang
berfungsi menyandi urutan asam amino
pada polipeptida;
2. RNA-ribosom (ribosomal-RNA, rRNA), yang
-- bersama protein ribosomal -- berfungsi
membentuk ribosom sebagai tempat
sintesis protein;
3. RNA-transfer (transfer-RNA, tRNA), yang berfungsi membawa asam amino ke ribosom
pada saat translasi.
C D K 1 8 6 / V o l . 3 8 n o . 5 / J u l i- Ag u s t u s 2 0 1 1
TINJAUAN PUSTAKA
Pada tahun 2006, Mello dan Fire menerima
Nobel untuk penelitian mereka yang dimulai
sejak tahun 1998, ketika bersama SiQun Xu,
Mary Montgomery, Stephen Kostas, dan Sam
Driver mempublikasikan tulisan ilmiah yang
menceritakan bagaimana potongan kecil RNA
menghancurkan mRNA (RNA-kurir) sebelum
dapat memproduksi protein. Hal ini dapat
menghilangkan dampak gen tertentu, dan
memungkinkan manusia untuk memerangi
penyakit, seperti AIDS dan kanker.15
Pada akhir abad ke-20 dan awal abad ke-21,
diketahui RNA hadir dalam berbagai bentuk
dan terlibat dalam proses pasca-translasi.
Dalam pengaturan ekspresi genetik, kini dikenal RNA-mikro (miRNA), yang terlibat dalam
"peredaman gen" atau gene silencing, dan
siRNA, yang terlibat dalam proses pertahanan
terhadap serangan virus. siRNA berperan
menghapuskan mRNA target, sedangkan
miRNA biasanya mengontrol tingkat transkripsi mRNA target dan, dengan demikian,
menghalangi proses translasi protein.11,14,15
Dicer mengandung dua daerah RNase III dan
satu daerah PAZ (Piwi Argonaute Zwille
domain). Perbedaan molekul kedua bagian
tersebut ditentukan dari panjang dan sudut
connector helix, yang menentukan panjang
siRNA yang akan diproduksi.13
Pada mamalia, dsRNA yang panjang akan
mengaktifkan protein kinase R (PKR) dan
RNaseL, yang berperan sebagai kunci lintasan
sinyal interferon, yang akan menyebabkan tidak
spesifiknya efek yang diinginkan; sementara
itu, siRNA cukup pendek untuk melewati
bagian tersebut. Di dalam RNAi, potongan
kecil RNA untai ganda (siRNA; small interfering
RNA) disintesis secara kimiawi dan langsung
masuk ke sel, atau diekspresikan dari vektorvektor DNA. Di dalam sel, siRNA dapat mendorong penurunan messenger RNA (mRNA)
yang berisi urutan tepat siRNA. mRNA adalah
produk transkripsi DNA, yang secara normal
dapat diterjemahkan ke dalam protein.
Penurunan mRNA akibat induksi siRNA
merupakan proses rumit yang melibatkan beberapa tahapan, dimulai dengan penempelan
siRNA pada RISC (RNA-induced silencing
complex), diikuti aktivasi RISC, yang menghasilkan pengenalan terhadap mRNA target,
dan akhirnya terjadi penurunan mRNA target.
Teknik siRNA sangat disukai karena mampu
mengganggu fungsi gen tertentu tanpa mempengaruhi gen lain yang terkait. Pada mamalia, bagian kecil dsRNA memiliki panjang
kurang dari 30 pasang basa dan direkrut oleh
RNA yang akan menginduksi peredaman
yang kompleks, mendorong ke arah pecahnya
RNA yang homolog dalam suatu proses yang
dikenal sebagai RNA interference (RNAi).2,3,17,19
RNAi telah menjadi suatu alat penting untuk
menganalisis fungsi suatu gen melalui penekanan terhadap produk gen tertentu, dan
telah digunakan secara luas dalam penelitianpenelitian pada Caenorhabditis elegans. Pada
tahun 1998, ditemukan bahwa injeksi dsRNA
pada C. elegans lebih efektif dalam menekan
ekspresi gen dibanding single-stranded antisense RNA. Baru-baru ini, RNAi telah terbukti
bermanfaat dalam studi pada sistem mamalia, termasuk ESC dari mencit dan manusia.
Tantangan utama teknik siRNA adalah meningkatkan efisiensi masuknya dsRNA ke sel
mamalia yang hanya terjadi dalam jangka
waktu pendek (bersifat sementara).6,15,16,20
RNAi merupakan gen yang sangat spesifik.
dsRNA meliputi sedikitnya sekitar 300 bp
urutan penyandian yang homolog; ukuran
dan jumlah urutan penyandian spesifik yang
harus ada sampai saat ini belum dipahami.
Proses ini dapat berjalan jika terdapat introns
pada RNAi yang diharapkan.1 Secara alami,
RNAi diaktifkan oleh dsRNA, yang sebelumnya dibelah oleh suatu enzim ribonuclease
III yang dikenal dengan sebutan “Dicer”
(Gambar 1). Enzim Dicer akan memotongmotong dsRNA menjadi siRNA dengan panjang sekitar 20-26 nukleotida.
C DK 1 8 6 / Vo l. 38 no. 5/Jul i -A g us tus 2011
TINJAUAN PUSTAKA
Urutan spesifik RNAi telah ditunjukkan dalam
embrio mencit tahap preimplantasi dan dalam
oosit melalui penyuntikan dsRNA. Ketika dimasukkan ke zigot mencit, dsRNA terbukti
efektif menekan GFP (green fluorescent protein)
selama tahapan blastosit sampai E6.5. Hasil
penelitian terbaru menunjukkan bahwa ESC
yang dijaga dalam tahap tidak berdiferensiasi
atau tahap diferensiasi juga dapat merespons
dsRNA untuk "peredaman gen" (gene silencing).
Dalam penelitian lain, dsRNA digunakan untuk
menekan ekspresi PU.1 dan C/EBPα dalam sel
CD34+ pada EB. PU.1 merupakan pengatur
pusat seluruh garis keturunan hematopoietik
dan aktivitas stem cell. Sementara itu, C/EBP
α (CCAAT/enhancer binding protein alpha)
merupakan salah satu faktor transkripsi
spesifik dari garis keturunan hematopoietik.
Akibatnya, tingkatan ekspresi reseptor sel
M-CSF (CD115), target PU.1, dan C/EBPα
menurun selama 2-3 hari setelah transfeksi.
Dengan keberhasilan RNAi menekan gen pada
ESC dan penemuan terbaru yang memasukkan siRNA ke sel mamalia, RNAi mungkin
efektif sebagai alat untuk mempelajari diferensiasi ESC dan untuk terapi gen.16
RNA interference dalam ESC
RNAi dapat digunakan pula sebagai metode
untuk menguji fungsi suatu gen, yaitu dengan
mengurangi ekspresi gen yang diinginkan
(Gambar 2). Alasannya terutama karena RNAi
dapat bekerja secara efisien di dalam sel somatik, ditambah dengan beberapa kemajuan
dalam penerapan teknologi ini pada ESC.17
Kemampuan menghasilkan ESC yang stabil
lewat upaya modifikasi secara genetik membuka pemahaman baru mengenai diferensiasi dan self-renewal ESC. Sebagai contoh,
gen-gen pelapor dapat digunakan untuk mengikuti ekspresi protein yang telah ditentukan
selama diferensiasi, ekspresi dapat ditingkatkan,
dan siRNA dapat dimasukkan ke dalam sel
untuk menurunkan ekspresi protein tersebut.4
Gambar 1. Sel dapat menggunakan protein Dicer untuk memotong dsRNA, membentuk siRNA. Suatu siRNA
dapat diproses pada single strand anti-sense RNA dan digunakan untuk menghancurkan mRNA. Beberapa
protein (berbentuk oval dan berwarna) diperlukan untuk efisiensi RNAi. Proses tersebut dikenal sebagai
RNA-induced silencing complex (RISC).15
333
Penelitian Matin et al. (2004), Hay et al. (2004),
Gerrard et al. (2005), Zaehres et al. (2005),
dan Hough et al. (2006) menunjukkan bahwa
RNAi efektif untuk menurunkan regulasi gen
yang diinginkan pada ESC. Gen target adalah
Oct4 dan Nanog; kedua faktor transkripsi ini
berfungsi sebagai pengatur utama pluripotensi dan self-renewal pada ESC.4,5,7,10,18
334
Gambar 2. Penggunaan RNAi untuk modifikasi stem cell.17
Telah diketahui sebelumnya bahwa tingkatan
ekspresi Oct4 menentukan arah perkembangan
ESC. Pada mESCs, peningkatan regulasi berhubungan dengan komitmen ke arah extraembryonic endoderm dan mesoderm, sedangkan penurunan regulasi ke arah pembentukan
trophectoderm. Penggunaan RNAi menghambat Oct4 dalam mESCs dan human embryonic stem cell (hESC) menandai peranan
Oct4 dalam menjaga pluripotensi dengan
mencegah terjadinya diferensiasi ke arah
extraembryonic lineages. 4,10
Tidak seperti Oct4, overekspresi Nanog dapat
mengesampingkan kebutuhan leukemia inhibitory factor (LIF) untuk menjaga tahap pluripoten dalam kultur mESC. Dari penelitian tersebut, diketahui bahwa senyawa RNAi dapat
digunakan untuk menurunkan regulasi ekspresi
Nanog atau Oct4 secara spesifik dan efektif,
mendorong ke arah perubahan fenotip yang
berhubungan dengan diferensiasi ke arah
extraembryonic lineages.4,10
Waktu optimal RNAi dalam mempengaruhi
ekspresi Oct4 telah dilaporkan oleh Matin dkk.
pada tahun 2004. Pada penelitian tersebut,
sel-sel 2102Ep diberi perlakuan dengan Oct4
dan β2M siRNA, kemudian ekspresi Oct4
dianalisis dengan western blot pada hari ke-3,
ke-5, dan ke-7 setelah RNAi.
Tingkatan ekspresi protein Oct4 terlihat konstan pada kultur yang diberi perlakuan siRNA
pada β2M. Sebagai pembanding, terjadi penurunan regulasi pada hari ke-3 dan ke-5
setelah perlakuan dengan Oct4 siRNA, dan
nilai tersebut mulai dipulihkan dalam 7 hari
(Gambar 3).5
Gambar 3. siRNA diarahkan untuk menurunkan
regulasi ekspresi protein Oct4. Uji western blot menunjukkan ekspresi Oct4 pada sel 2102Ep yang diberi siRNA, begitu juga dengan β2M (jalur 1, 3, dan
5) atau Oct4 (jalur 2, 4, dan 6) setelah 3 hari (jalur 1,
2), 5 hari (jalur 3, 4), dan 7 hari (jalur 5, 6).5
Selain gen Oct4 dan Nanog, faktor transkripsi
lain yang juga menjaga pluripotensi adalah
Sox2 dan Stat3. Dalam penelitian Wegmüller
dkk. pada tahun 2007, dilakukan penekanan
Stat3 pada CCS ESC yang menyebabkan teramatinya penanda morfologis dan biokimiawi
untuk tahapan diferensiasi. Selain itu, dilakukan pula induksi RNAi spesifik terhadap posttranscriptional regulator Brf1 (Zfp36L1) yang
C D K 1 8 6 / V o l . 3 8 n o . 5 / J u l i- Ag u s t u s 2 0 1 1
TINJAUAN PUSTAKA
Pada tahun 2006, Mello dan Fire menerima
Nobel untuk penelitian mereka yang dimulai
sejak tahun 1998, ketika bersama SiQun Xu,
Mary Montgomery, Stephen Kostas, dan Sam
Driver mempublikasikan tulisan ilmiah yang
menceritakan bagaimana potongan kecil RNA
menghancurkan mRNA (RNA-kurir) sebelum
dapat memproduksi protein. Hal ini dapat
menghilangkan dampak gen tertentu, dan
memungkinkan manusia untuk memerangi
penyakit, seperti AIDS dan kanker.15
Pada akhir abad ke-20 dan awal abad ke-21,
diketahui RNA hadir dalam berbagai bentuk
dan terlibat dalam proses pasca-translasi.
Dalam pengaturan ekspresi genetik, kini dikenal RNA-mikro (miRNA), yang terlibat dalam
"peredaman gen" atau gene silencing, dan
siRNA, yang terlibat dalam proses pertahanan
terhadap serangan virus. siRNA berperan
menghapuskan mRNA target, sedangkan
miRNA biasanya mengontrol tingkat transkripsi mRNA target dan, dengan demikian,
menghalangi proses translasi protein.11,14,15
Dicer mengandung dua daerah RNase III dan
satu daerah PAZ (Piwi Argonaute Zwille
domain). Perbedaan molekul kedua bagian
tersebut ditentukan dari panjang dan sudut
connector helix, yang menentukan panjang
siRNA yang akan diproduksi.13
Pada mamalia, dsRNA yang panjang akan
mengaktifkan protein kinase R (PKR) dan
RNaseL, yang berperan sebagai kunci lintasan
sinyal interferon, yang akan menyebabkan tidak
spesifiknya efek yang diinginkan; sementara
itu, siRNA cukup pendek untuk melewati
bagian tersebut. Di dalam RNAi, potongan
kecil RNA untai ganda (siRNA; small interfering
RNA) disintesis secara kimiawi dan langsung
masuk ke sel, atau diekspresikan dari vektorvektor DNA. Di dalam sel, siRNA dapat mendorong penurunan messenger RNA (mRNA)
yang berisi urutan tepat siRNA. mRNA adalah
produk transkripsi DNA, yang secara normal
dapat diterjemahkan ke dalam protein.
Penurunan mRNA akibat induksi siRNA
merupakan proses rumit yang melibatkan beberapa tahapan, dimulai dengan penempelan
siRNA pada RISC (RNA-induced silencing
complex), diikuti aktivasi RISC, yang menghasilkan pengenalan terhadap mRNA target,
dan akhirnya terjadi penurunan mRNA target.
Teknik siRNA sangat disukai karena mampu
mengganggu fungsi gen tertentu tanpa mempengaruhi gen lain yang terkait. Pada mamalia, bagian kecil dsRNA memiliki panjang
kurang dari 30 pasang basa dan direkrut oleh
RNA yang akan menginduksi peredaman
yang kompleks, mendorong ke arah pecahnya
RNA yang homolog dalam suatu proses yang
dikenal sebagai RNA interference (RNAi).2,3,17,19
RNAi telah menjadi suatu alat penting untuk
menganalisis fungsi suatu gen melalui penekanan terhadap produk gen tertentu, dan
telah digunakan secara luas dalam penelitianpenelitian pada Caenorhabditis elegans. Pada
tahun 1998, ditemukan bahwa injeksi dsRNA
pada C. elegans lebih efektif dalam menekan
ekspresi gen dibanding single-stranded antisense RNA. Baru-baru ini, RNAi telah terbukti
bermanfaat dalam studi pada sistem mamalia, termasuk ESC dari mencit dan manusia.
Tantangan utama teknik siRNA adalah meningkatkan efisiensi masuknya dsRNA ke sel
mamalia yang hanya terjadi dalam jangka
waktu pendek (bersifat sementara).6,15,16,20
RNAi merupakan gen yang sangat spesifik.
dsRNA meliputi sedikitnya sekitar 300 bp
urutan penyandian yang homolog; ukuran
dan jumlah urutan penyandian spesifik yang
harus ada sampai saat ini belum dipahami.
Proses ini dapat berjalan jika terdapat introns
pada RNAi yang diharapkan.1 Secara alami,
RNAi diaktifkan oleh dsRNA, yang sebelumnya dibelah oleh suatu enzim ribonuclease
III yang dikenal dengan sebutan “Dicer”
(Gambar 1). Enzim Dicer akan memotongmotong dsRNA menjadi siRNA dengan panjang sekitar 20-26 nukleotida.
C DK 1 8 6 / Vo l. 38 no. 5/Jul i -A g us tus 2011
TINJAUAN PUSTAKA
Urutan spesifik RNAi telah ditunjukkan dalam
embrio mencit tahap preimplantasi dan dalam
oosit melalui penyuntikan dsRNA. Ketika dimasukkan ke zigot mencit, dsRNA terbukti
efektif menekan GFP (green fluorescent protein)
selama tahapan blastosit sampai E6.5. Hasil
penelitian terbaru menunjukkan bahwa ESC
yang dijaga dalam tahap tidak berdiferensiasi
atau tahap diferensiasi juga dapat merespons
dsRNA untuk "peredaman gen" (gene silencing).
Dalam penelitian lain, dsRNA digunakan untuk
menekan ekspresi PU.1 dan C/EBPα dalam sel
CD34+ pada EB. PU.1 merupakan pengatur
pusat seluruh garis keturunan hematopoietik
dan aktivitas stem cell. Sementara itu, C/EBP
α (CCAAT/enhancer binding protein alpha)
merupakan salah satu faktor transkripsi
spesifik dari garis keturunan hematopoietik.
Akibatnya, tingkatan ekspresi reseptor sel
M-CSF (CD115), target PU.1, dan C/EBPα
menurun selama 2-3 hari setelah transfeksi.
Dengan keberhasilan RNAi menekan gen pada
ESC dan penemuan terbaru yang memasukkan siRNA ke sel mamalia, RNAi mungkin
efektif sebagai alat untuk mempelajari diferensiasi ESC dan untuk terapi gen.16
RNA interference dalam ESC
RNAi dapat digunakan pula sebagai metode
untuk menguji fungsi suatu gen, yaitu dengan
mengurangi ekspresi gen yang diinginkan
(Gambar 2). Alasannya terutama karena RNAi
dapat bekerja secara efisien di dalam sel somatik, ditambah dengan beberapa kemajuan
dalam penerapan teknologi ini pada ESC.17
Kemampuan menghasilkan ESC yang stabil
lewat upaya modifikasi secara genetik membuka pemahaman baru mengenai diferensiasi dan self-renewal ESC. Sebagai contoh,
gen-gen pelapor dapat digunakan untuk mengikuti ekspresi protein yang telah ditentukan
selama diferensiasi, ekspresi dapat ditingkatkan,
dan siRNA dapat dimasukkan ke dalam sel
untuk menurunkan ekspresi protein tersebut.4
Gambar 1. Sel dapat menggunakan protein Dicer untuk memotong dsRNA, membentuk siRNA. Suatu siRNA
dapat diproses pada single strand anti-sense RNA dan digunakan untuk menghancurkan mRNA. Beberapa
protein (berbentuk oval dan berwarna) diperlukan untuk efisiensi RNAi. Proses tersebut dikenal sebagai
RNA-induced silencing complex (RISC).15
333
Penelitian Matin et al. (2004), Hay et al. (2004),
Gerrard et al. (2005), Zaehres et al. (2005),
dan Hough et al. (2006) menunjukkan bahwa
RNAi efektif untuk menurunkan regulasi gen
yang diinginkan pada ESC. Gen target adalah
Oct4 dan Nanog; kedua faktor transkripsi ini
berfungsi sebagai pengatur utama pluripotensi dan self-renewal pada ESC.4,5,7,10,18
334
Gambar 2. Penggunaan RNAi untuk modifikasi stem cell.17
Telah diketahui sebelumnya bahwa tingkatan
ekspresi Oct4 menentukan arah perkembangan
ESC. Pada mESCs, peningkatan regulasi berhubungan dengan komitmen ke arah extraembryonic endoderm dan mesoderm, sedangkan penurunan regulasi ke arah pembentukan
trophectoderm. Penggunaan RNAi menghambat Oct4 dalam mESCs dan human embryonic stem cell (hESC) menandai peranan
Oct4 dalam menjaga pluripotensi dengan
mencegah terjadinya diferensiasi ke arah
extraembryonic lineages. 4,10
Tidak seperti Oct4, overekspresi Nanog dapat
mengesampingkan kebutuhan leukemia inhibitory factor (LIF) untuk menjaga tahap pluripoten dalam kultur mESC. Dari penelitian tersebut, diketahui bahwa senyawa RNAi dapat
digunakan untuk menurunkan regulasi ekspresi
Nanog atau Oct4 secara spesifik dan efektif,
mendorong ke arah perubahan fenotip yang
berhubungan dengan diferensiasi ke arah
extraembryonic lineages.4,10
Waktu optimal RNAi dalam mempengaruhi
ekspresi Oct4 telah dilaporkan oleh Matin dkk.
pada tahun 2004. Pada penelitian tersebut,
sel-sel 2102Ep diberi perlakuan dengan Oct4
dan β2M siRNA, kemudian ekspresi Oct4
dianalisis dengan western blot pada hari ke-3,
ke-5, dan ke-7 setelah RNAi.
Tingkatan ekspresi protein Oct4 terlihat konstan pada kultur yang diberi perlakuan siRNA
pada β2M. Sebagai pembanding, terjadi penurunan regulasi pada hari ke-3 dan ke-5
setelah perlakuan dengan Oct4 siRNA, dan
nilai tersebut mulai dipulihkan dalam 7 hari
(Gambar 3).5
Gambar 3. siRNA diarahkan untuk menurunkan
regulasi ekspresi protein Oct4. Uji western blot menunjukkan ekspresi Oct4 pada sel 2102Ep yang diberi siRNA, begitu juga dengan β2M (jalur 1, 3, dan
5) atau Oct4 (jalur 2, 4, dan 6) setelah 3 hari (jalur 1,
2), 5 hari (jalur 3, 4), dan 7 hari (jalur 5, 6).5
Selain gen Oct4 dan Nanog, faktor transkripsi
lain yang juga menjaga pluripotensi adalah
Sox2 dan Stat3. Dalam penelitian Wegmüller
dkk. pada tahun 2007, dilakukan penekanan
Stat3 pada CCS ESC yang menyebabkan teramatinya penanda morfologis dan biokimiawi
untuk tahapan diferensiasi. Selain itu, dilakukan pula induksi RNAi spesifik terhadap posttranscriptional regulator Brf1 (Zfp36L1) yang
C D K 1 8 6 / V o l . 3 8 n o . 5 / J u l i- Ag u s t u s 2 0 1 1
TINJAUAN PUSTAKA
menghasilkan cardiomyocyte saat pembentukan EB. Hal ini menunjukkan bahwa Brf1
merupakan regulator yang berpotensi untuk
pembentukan cardiomyocyte dari ESC.10.12
DAFTAR PUSTAKA
1.
2.
3.
SIMPULAN
Beberapa penelitian menunjukkan bahwa RNAi
secara spesifik dapat digunakan untuk menurunkan regulasi ekspresi gen pada ESC,
dengan konsekuensi pada perilaku sel. Dengan
meningkatnya pemahaman mekanisme genetik
yang mengontrol diferensiasi secara selular,
pengaturan aktivitas gen oleh RNAi membuktikan manfaatnya untuk memanipulasi
diferensiasi ESC. Hasil penelitian lain memperlihatkan bahwa, berlawanan dengan peranan
LIF, faktor transkripsi lain, Oct4, terlihat memainkan peranan yang sama pada ESC manusia dan murine. Dari penelitian-penelitian tersebut, diharapkan akan berkembang suatu
metode pengontrolan pengarahan diferensiasi ESC untuk menghasilkan populasi jenis
sel yang spesifik. Hal ini dapat terwujud tidak
hanya dengan memberikan sesuatu yang
dapat meningkatkan kespesifikan sel, tetapi
juga dengan menekan ekspresi gen tertentu,
sehingga hanya ekspresi gen yang diinginkanlah yang akan terekspresi dan menghasilkan protein-protein yang dapat mengarahkan ESC menjadi sel yang spesifik.
C DK 1 8 6 / Vo l. 38 no. 5/Jul i -A g us tus 2011
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Anonim. Double-Stranded RNA Interference with Gene Expression: RNAi. 2007. http://avery.rutgers.edu/ WSSP/
StudentScholars/project. 15 Januari 2007.
Denning C, Priddle H. New frontiers in gene targeting and cloning: success, application and challenges in domestic
animals and human embryonic stem cells. Reproduction. 2003; 126: 1-11.
Gong W, Ren Y, Xu Q, et al. Integrated siRNA design based on surveying of features associated with high RNAi
effectiveness. BMC Bioinformatics. 2006; 7: 516.
Hough SR, Clements I, Welch PJ, et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells after RNA interferencemediated silencing of Oct4 and Nanog. Stem Cells. 2006; 24: 1467-75.
Matin MM, Walsh JR, Gokhale PJ, et al. Specific knockdown of Oct4 and β2-microglobulin expression by RNA
interference in human embryonic stem cells and embryonic carcinoma cells. Stem Cells. 2004; 22: 659-68.
Milhavet O, Gary DS, Mattson MP. RNA interference in biology and medicine. Pharmacological Rev. 2003; 55:
629-48.
Moore JC, van Laake LW, Braam SR, et al. Human embryonic stem cells: Genetic manipulation on the way to
cardiac cell therapies. Reproductive Toxicology. 2005; 20: 377-91.
Newsrx. Genomics and genetics weekly: RNA interference aids in inhibiting cell proliferation and gene expression.
http://newsrx.com/newsletters/Genomics-and-Genetics-Weekly/2006-09-08.html. (15 Januari 2007).
National Institutes of Health. Stem cells: Scientific progress and future research directions. 2001; http://www.nih.gov/
news/stemcell/scireport.htm. (1 Maret 2003).
Pan G, Thomson JA. Nanog and transcriptional networks in embryonic stem cell pluripotency. Cell Research. 2007;
17: 42-9.
Shivdasani RA. MicroRNAs: regulators of gene expression and cell differentiation. Blood. 2006; 108: 3646-3653.
Wegmüller D, Raineri I, Gross B, Oakeley EJ, Moroni C. A cassette system to study ES cell differentiation by inducible
RNA interference. Stem Cells published online Jan 11, 2007.
Wikipedia. Dicer. 2007; http://en.wikipedia.org/wiki/Dicer. 14 Januari 2007.
Wikipedia. RNA. 2007; http://en.wikipedia.org/wiki/RNA. 14 Januari 2007.
Wikipedia. RNA interference. 2007; http://en.wikipedia.org/wiki/RNA interference. 14 Januari 2007.
Wobus AM and Boheler KR. Embryonic stem cells: Prospects for developmental biology and cell therapy. Physiol
Rev. 2005; 85: 635-78.
Yu J, Thomson JA. Regenerative Medicine 2006: 1. Embryonic stem cells. 2006; http://www.nih.gov. 14 Januari
2007.
Zaehres H, Lensch MW, Daheron L, et al. High-efficiency RNA interference in human embryonic stem cells. Stem
Cells. 2005; 23: 299-305.
Zhang X-N, Xiong W, Wang J-D, Hu Y-W, et al. siRNA-mediated inhibition of HBV replication and expression.
World J Gastroenterol. 2004; 10(20): 2967-71.
Zheng GD, Hidaka K, Morisaki T. Stable and uniform gene suppression by site-specific integration of siRNAexpression
cassette in murine embryonic stem cells. Stem Cells. 2005; 23: 1028-34.
335
IKLAN
FIXEF