IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Uji Aktivitas Selulolitik 4.1.1 Uji

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Uji Aktivitas Selulolitik
4.1.1 Uji aktivitas selulolitik secara kualitatif
Aktivitas selulolitik beberapa isolat A. niger dan Trichoderma diuji pada
media agar CMC. Adanya aktivitas selulolitik ditandai dengan terbentuknya zona
bening disekeliling koloni cendawan (Gambar 6). Pewarna Congo Red
berinteraksi secara kuat dengan polisakarida yang mengandung ikatan β-(1,4) dan
β-(1,3) glikosidik membentuk kompleks warna-glukan (Teather & Wood 1982).
Zona bening yang terbentuk mengindikasikan tidak adanya kompleks warnaglukan akibat terjadinya hidrolisis ikatan glikosidik CMC. Sedangkan daerah yang
masih berwarna merah mengindikasikan masih adanya kompleks warna-glukan
yang mengindikasikan tidak terjadi hidrolisis substrat CMC.
Rata-rata nisbah selulolitik terbesar ditunjukkan oleh isolat A. niger KB12
sebesar 0.47 dan terkecil ditunjukkan oleh isolat Trichoderma IPB12 sebesar 0.02
(Tabel 3). Besarnya nisbah selulolitik ini seringkali tidak berkorelasi dengan
besarnya aktivitas selulase. Hal ini kemungkinan disebabkan adanya variasi
kecepatan pertumbuhan cendawan.
a
b
Gambar 6 Aktivitas selulolitik yang ditunjukkan dengan terbentuknya zona
bening disekeliling koloni setelah inkubasi 24 jam pada suhu ruang. (a)
A. niger, (b) Trichoderma.
Tabel 3 Nisbah selulolitik A. niger dan Trichoderma setelah 24 jam inkubasi
pada suhu ruang
Isolat
Rata-rata diameter
koloni (cm)
Rata-rata diameter
zona bening (cm)
Aspergillus niger IPB1
A. niger IPB4
A. niger IPB5
A. niger KB12
A. niger TSR12
A. niger TSR13
A. niger TSR52
Trichoderma reesei
Trichoderma IPB2
Trichoderma IPB9
Trichoderma IPB11
Trichoderma IPB12
20.25
19.92
20.17
15.67
18.33
17.58
17.75
29.33
30.00
32.67
24.00
33.17
28.08
23.50
23.83
23.00
25.08
21.33
24.50
30.33
31.00
34.17
25.83
34.00
Rata-rata
nisbah selulolitik
0.37±0,011
0.18±0,078
0.18±0,019
0.47±0,056
0.37±0,042
0.22±0,076
0.38±0,033
0.03±0,001
0.03±0,001
0.05±0,028
0.08±0,007
0.02±0,007
4.1.2 Uji aktivitas enzim endoglukanase secara kuantitatif
Rata-rata aktivitas spesifik tertinggi ditunjukkan oleh isolat A. niger IPB1
sebesar 5.74 U/mg dan terkecil ditunjukkan oleh isolat Trichoderma IPB2 sebesar
1.31 U/mg (Tabel 4). Beberapa isolat A. niger dan Trichoderma, seperti A. niger
IPB1, A. niger TSR52, A. niger IPB5, A niger KB12, A. niger TSR12, A. niger
TSR13 menunjukkan aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan isolat T. reesei
yang merupakan standar aktivitas enzim selulase. Elshafei et al. (1990)
melaporkan bahwa aktivitas enzim endoglukanase A. terreus lebih tinggi
dibandingkan Trichoderma viride yang merupakan standar aktivitas enzim
selulase, sedangkan Pothiraj et al. (2006) melaporkan aktivitas enzim
endoglukanase A. niger lebih tinggi dibandingkan A. terraus. Namun demikian
pembandingan secara langsung hasil ini sulit dilakukan karena banyaknya faktor
yang mempengaruhi, seperti komposisi media dan pemilihan substrat yang dapat
mempengaruhi aktivitas enzim (Sharma et al. 1986).
Banyak faktor terlibat dalam kinerja suatu enzim, seperti suhu dan pH.
Pada penelitian ini digunakan metode yang umum digunakan untuk sistem enzim
selulase T. reesei (Ghose 1987) sehinggga tidak menutup kemungkinan aktivitas
beberapa isolat A. niger pada uji ini belum mencapai aktivitas optimalnya.
Beberapa laporan menunjukkan aktivitas enzim endoglukanase A. niger
mempunyai kisaran suhu dan pH yang luas. Suhu optimum aktivitas
endoglukanase A. niger dilaporkan berkisar 40oC (Coral et al. 2002) dan 70oC
(Hong et al. 2001). pH optimum aktivitas enzim endoglukanase A. niger
dilaporkan berkisar 4.5 dan 7.5 (Coral et al. 2002), antara 6.0 dan 7.0 (Akiba et al.
1995), dan 6.0 (Hong et al. 2001).
Tabel 4 Aktivitas enzim endoglukanase A. niger dan Trichoderma pada suhu
50oC yang diukur setelah 7 hari inkubasi
Nama isolat
Rata- rata biomassa (mg)
Rata-rata aktivitas spesifik
(U/mg)
42
48
37
45
51
31
41
38
43
47
35
37
5.74±0.58
5.42±0.67
4.96±0.24
4.83±1.01
4.68±0.46
4.30±0.54
3.03±0.42
3.01±0.26
2.73±0.38
2.53±0.59
2.35±0.94
1.31±0.80
A. niger IPB1
A. niger TSR52
A. niger IPB5
A. niger KB12
A. niger TSR12
Trichoderma IPB11
A. niger TSR13
Trichoderma reseei
A. niger IPB4
Trichoderma IPB9
Trichoderma IPB12
Trichoderma IPB2
4.2 Isolasi Gen eglA A. niger IPB1
4.2.1 Isolasi RNA total
Isolasi RNA total dilakukan pada isolat yang mempunyai aktivitas spesifik
tertinggi, yaitu isolat A. niger IPB1. RNA total berhasil diisolasi dari miselium A.
niger IPB1 yang ditumbuhkan dalam medium induksi CMC. Kuantitas RNA total
yang dihasilkan berdasarkan pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 260 nm adalah 176.4 µg tiap gram miselium. Selanjutnya berdasarkan
nilai rasio OD260/OD280, yaitu sebesar 1.72, maka RNA total yang dihasilkan
mempunyai kemurnian yang cukup tinggi (Tabel 5). Manchester (1996)
menyatakan bahwa kemurnian RNA yang tinggi ditunjukkan dengan nilai rasio
OD260/OD280 antara 1.8 dan 2.0. Hasil elektroforesis menunjukkan RNA total
hasil isolasi mempunyai integritas yang cukup tinggi. Hal ini ditunjukkan dengan
adanya dua pita yang dominan, yaitu RNA ribosomal (rRNA) 28S dan 18S
(Gambar 7).
Tabel 5 Hasil isolasi RNA total
Absorban
Bahan
Miselium A. niger IPB1
λ260
λ280
0.210
0.122
λ260/ λ280
Total RNA
(µg/ g miselium)
1.72
176.4
rRNA 28S
rRNA 18S
Gambar 7 Hasil isolasi RNA total A. niger IPB1 yang diisolasi dari miselium
setelah inkubasi 3 hari yang dideteksi dengan elektroforesis
menggunakan gel agarosa 1% (b/v).
4.2.2 Sintesis cDNA total
Sintesis cDNA dilakukan menggunakan RNA total yang telah diisolasi
sebagai cetakan melalui proses transkripsi balik. Proses ini menggunakan primer
oligo(dT) sehingga hanya mRNA yang akan disintesis menjadi cDNA karena
adanya ekor poli(A) pada ujung 3’. Sebagai kontrol keberhasilan sintesis cDNA,
dilakukan amplifikasi terhadap gen aktin menggunakan primer spesifik (ActF dan
ActR2).
Hasil amplifikasi gen aktin dengan cDNA sebagai cetakan menghasilkan
satu pita DNA yang berukuran 123 bp (Gambar 8). Hasil ini menunjukkan bahwa
sintesis cDNA total telah berlangsung dengan baik. Selain itu, hasil ini juga
menunjukkan RNA yang dihasilkan tidak terkontaminasi oleh DNA genom.
Adanya kontaminasi oleh DNA akan ditunjukkan dengan adanya dua pita DNA
yang dihasilkan, yaitu pita berukuran 123 bp yang menunjukkan hasil amplifikasi
cDNA dan pita berukuran 223 bp yang menunjukkan hasil amplifikasi DNA
genom. Pada DNA genom terdapat intron antara ekson1 dan ekson2 sehingga
fragmen yang dihasilkan lebih besar.
1
2
310 bp
194 bp
118 bp
123 bp
Gambar 8 Hasil amplifikasi gen aktin dengan PCR yang dideteksi dengan
elektroforesis menggunakan gel agarosa 3% (b/v). Lajur 1. Penanda
ΦX174RF DNA/HaeIII Fragments; 2. Gen aktin
4.2.3 Isolasi gen eglA
Hasil sintesis cDNA selanjutnya digunakan sebagai cetakan untuk
mengisolasi gen eglA. Isolasi gen eglA dilakukan dengan amplifikasi
menggunakan PCR dengan primer spesifik EAF dan EAR. Amplifikasi gen eglA
A. niger IPB1 menghasilkan pita sekitar 750 bp sesuai dengan hasil prediksi dari
database (Gambar 9).
1
1000 bp
750bp
2
750 bp
Gambar 9 Hasil amplifikasi eglA dengan PCR yang dideteksi dengan
elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v). Lajur 1. Penanda 1
kb; 2. eglA hasil PCR
4.2.4 Pengklonan gen eglA
Gen eglA hasil isolasi disisipkan dalam plasmid pGEM-T Easy, ditengah
gen lacZ dengan bantuan enzim ligase. Hasil ligasi kemudian diintroduksikan ke
dalam E. coli galur DH5α yang selanjutnya ditumbuhkan dalam media seleksi
yang mengandung ampisilin, X-gal dan IPTG. Keberhasilan pengklonan gen eglA
dapat diketahui dengan terbentuknya koloni putih (Gambar 10).
Koloni E. coli galur DH5α yang dapat tumbuh pada media yang
mengandung ampisilin adalah koloni yang mengandung plasmid pGEM-T Easy.
Plasmid ini mempunyai gen resistensi ampisilin yang mengekspresikan β-
lactamase yang merusak cincin β-lactame sehingga bakteri yang mengandung
plasmid ini dapat hidup dalam media yang mengandung ampisilin. Adanya gen
eglA yang menyisip ke dalam gen lacZ dibuktikan dengan warna koloni yang
putih. Gen lacZ merupakan gen yang menyandi β-galaktosidase yang mengubah
substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru. Adanya penyisipan
gen eglA pada gen lacZ mengakibatkan ekspresi gen lacZ terganggu dan βgalaktosidase tidak diekspresikan, sehingga tidak ada perubahan warna pada
substrat X-gal dan koloni yang dihasilkan berwarna putih.
Koloni putih
Koloni biru
1 ml
Gambar 10 Koloni E. coli hasil transformasi yang ditumbuhkan dalam media
selektif yang mengandung ampisilin, X-gal dan IPTG.
1
1000 bp
750 bp
2
750 bp
Gambar 11 Hasil amplifikasi eglA dengan PCR yang dideteksi dengan
elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v). Lajur 1. Penanda
1 kb; 2. eglA hasil PCR
4.2.5 Verifikasi pengklonan gen eglA
Untuk memastikan bahwa sisipan pada gen lacZ adalah gen eglA maka
dilakukan verifikasi dengan menggunakan PCR-koloni menggunakan primer
spesifik eglA maupun pemotongan DNA plasmid dengan enzim EcoRI. PCRkoloni pada koloni putih menghasilkan pita yang berukuran sekitar 750 bp yang
sesuai dengan ukuran eglA (Gambar 11).
DNA plasmid dari koloni putih diisolasi dan selanjutnya di potong dengan
menggunakan EcoRI. Enzim ini dipilih karena situs pemotongannya mengapit
sisipan sehingga diharapkan pemotongan akan menghasilkan dua pita, yaitu DNA
sisipan dan vektor pembawanya. Hasil pemotongan DNA plasmid menunjukkan
adanya dua pita yang berukuran sekitar 3000 bp dan 750 bp (Gambar 12). Ukuran
sekitar 3000 bp sesuai dengan ukuran pGEM-T Easy, yaitu sebesar 3015 bp,
sedangkan ukuran sekitar 750 bp sesuai dengan ukuran produk amplifikasi eglA.
Dari dua hasil verifikasi ini dapat dipastikan bahwa DNA yang menyisip dalam
gen lacZ plasmid pGEM-T Easy adalah gen eglA A. niger IPB1.
1
2
3
3000 bp
1000 bp
750 bp
vektor
sisipan
Gambar 12 Hasil pemotongan DNA plasmid rekombinan dengan EcoRI yang
dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v).
Lajur 1. Penanda 1 kb; 2. Plasmid rekombinan yang dipotong; 3.
Plasmid rekombinan yang tidak dipotong
4.3 Pengurutan dan Karakterisasi Gen eglA A. niger IPB1
4.3.1 Pengurutan gen eglA dan deduksi asam aminonya
Pengurutan gen eglA A. niger IPB1 pada pGEM-T Easy dilakukan
menggunakan ABI Prism 3100 versi 3.7 dengan primer sp6 dan T7 (Lampiran 4).
Dari hasil pengurutan diperoleh gen eglA A. niger IPB1 sebesar 720 bp yang
menyandi 239 asam amino (Gambar 13).
Sequence ID : EglA_niger
atgaagctccccgtgacacttgctatgcttgcggccaccgccatgggccagacgatgtgc
M K L P V T L A M L A A T A M G Q T M C
tctcaatatgacagtgcctcgagccccccatattcagtgaaccagaacctctggggcgag
S Q Y D S A S S P P Y S V N Q N L W G E
taccaaggcaccggcagccagtgtgtatatgtcaacaaactctccagcagtggtgcatcc
Y Q G T G S Q C V Y V N K L S S S G A S
tggcacaccgaatggacctggagcggtggtgagggaacagtgaaaagctactctaactct
W H T E W T W S G G E G T V K S Y S N S
ggcgttacatttaacaagaagctcgtgagtgatgtatcaagcatccccacctcggtggaa
G V T F N K K L V S D V S S I P T S V E
tggaagcaggacaacaccaacgtcaacgccgatgtcgcgtatgatcttttcaccgcagcg
W K Q D N T N V N A D V A Y D L F T A A
aatgtggaccatgctacttctagcggtgactatgaactgatgatttggcttgcccgctac
N V D H A T S S G D Y E L M I W L A R Y
ggcaacatccagcccattggcaagcaaattgccacggccacagtgggaggcaagtcctgg
G N I Q P I G K Q I A T A T V G G K S W
gaggtgtggtatggcagcaccacccaggccggtgcggagcagaggacatacagcttcgtg
E V W Y G S T T Q A G A E Q R T Y S F V
tcggaaagccctatcaactcatacagtggggccatcaatgcatttttcagctatctcact
S E S P I N S Y S G A I N A F F S Y L T
cagaaccaaggctttcccgccagctctcagtacttgatcaatctgcagtttggaactgag
Q N Q G F P A S S Q Y L I N L Q F G T E
gcgttcaccgggggcccggcaaccttcacggttgacaactggaccgccagtgtcaactag
A F T G G P A T F T V D N W T A S V N -
Nuk
60
AA
20
120
40
180
60
240
80
300
100
360
120
420
140
480
160
540
180
600
200
660
220
720
239
Gambar 13 Urutan nukleotida eglA A. niger IPB1 dan deduksi asam aminonya
4.3.2 Analisis kesejajaran urutan nukleotida dan asam amino eglA A. niger
IPB1 dengan database di GenBank
Analisis kesejajaran urutan nukleotida dan asam amino eglA A. niger IPB1
dengan database di GenBank dilakukan menggunakan program BLAST (Basic
Local Alignment Search Tool). Hasil penyejajaran nukleotida
menunjukkan
sekuen eglA A. niger IPB1 mempunyai kemiripan 99% dengan sekuen 14 dari
paten WO2004018662 (E-value 3.7e-152 ), 98% dengan sekuen 1 dari paten
WO9713853 (E-value 1.7e-151 ), WO9713862 (E-value 1.7e-151 ), US6190890 (E-
value 1.7e-151 ), US6306635 (E-value 1.7e-151 ), dan 97% dengan sekuen 13 dari
paten WO2004018662 (E-value 4.5e-149) dan eglA Aspergillus niger CBS 513.88
(E-value 1.1e-148) yang semuanya merupakan gen endoglukanase dari Aspergillus
niger. Sementara itu hasil penyejajaran urutan asam amino menunjukkan urutan
eglA mempunyai kemiripan 99% dengan endoglukanase A atau eglA dari
Aspergillus niger A. niger (E-value 7.1e-127) , 87% dengan endoglukanase A atau
cekA dari Aspergillus kawachi (E-value 1.9e-126 ), 81% dengan endoglukanase A
dari Aspergillus terreus (E-value 6.9e-113) dan 75% dengan endoglukanase atau
celA dari Aspergillus oryzae (E-value 4.8e-105) (Lampiran 5 dan 6).
BLAST merupakan program pencari similaritas suatu urutan nukleotida
atau asam amino dengan database yang berbasis local alignment, yaitu
penyejajaran pada suatu segmen sekuen yang lebih pendek dengan derajat
similaritas yang sangat tinggi. Similaritas mengindikasikan homologi suatu gen
atau protein. Jika kedua urutan gen atau protein homolog maka dapat dikatakan
bahwa keduanya mempunyai leluhur, fungsi dan struktur yang sama. Dua gen atau
fragmen DNA dikatakan homolog jika 70% urutan nukleotidanya atau 25% urutan
asam aminonya identik (panjang urutan minimal 100) (Claviere & Notredame
2003). Berdasarkan hal diatas maka dapat dipastikan bahwa eglA merupakan gen
eglA dari Aspergillus niger.
Gambar 14 Peta situs pemotongan eglA dengan menggunakan program NEBcutter
4.3.3 Analisis situs pemotongan gen eglA
Analisis situs pemotongan enzim restriksi endoglukanase digunakan untuk
membuat peta situs pemotongan enzim restriksi (peta restriksi) pada suatu gen
atau fragmen DNA. Peta restriksi ini bermanfaat dalam menentukan enzim-enzim
restriksi apa saja yang dapat digunakan dalam kegiatan manipulasi suatu gen atau
fragmen DNA. Pada analisis peta pemotongan gen eglA terlihat tidak terdapat
situs pemotongan EcoRI yang digunakan untuk mengeluarkan DNA sisipan dari
plasmid pGEM-T Easy sebagai vektornya (Gambar 14). Hasil ini sekaligus dapat
digunakan untuk verifikasi keberhasilan pengklonan gen eglA pada plasmid
pGEM-T Easy. Selain itu terdapat beberapa situs pemotongan yang terdapat pada
gen eglA dan situs pengklonan (MCS) pGEM-T Easy, seperti ApaI, NcoI, PstI
dan NsiI, sehingga enzim-enzim ini tidak dapat digunakan untuk mengeluarkan
DNA sisipan dari plasmid, karena akan memotong DNA sisipan juga (Gambar
14).
A. niger (Glyco hydro 12: 82-239)
T. reesei (Glyco hydro 12: 81-234)
S. lividans (Glyco hydro 12: 111-261; CBM 2 : 279-378)
B. licheniformis (Glyco hydro 12: 104-261)
Gambar 15 Perbandingan domain EglA dari berbagai organisme berdasarkan
database pfam
4.3.4 Analisis domain EglA
Analisis
domain
EglA
dilakukan
menggunakan
program
Pfscan
berdasarkan database Pfam. EglA memiliki katalitik domain yang termasuk dalam
kelompok Glikosida hidrolase famili 12 (GH12) pada posisi asam amino ke-82
sampai asam amino ke-239 (Gambar 15). Arsitektur EglA A. niger ini sama
dengan arsitektur beberapa anggota famili GH12 lainnya, seperti Cel12A T. reesei
dan Cel12A B. Licheniformis. Arsitektur jenis ini hanya mengandung katalitik
domain dan tidak mengandung carbohydrate binding moduls (CBM).
Secara umum, kelompok glikosida hidrolase terdiri dari dua domain
utama, yaitu katalitik domain dan carbohydrate binding moduls (CBM) yang
dihubungkan oleh suatu linker yang kaya akan prolin (Gambar 16). Posisi domain
katalitik maupun domain CBM dapat terdapat pada C-terminal maupun Nterminal. Posisi ini tidak menentukan spesifisitas suatu enzim (Gilkes et al. 1991).
Peran domain CBM pada enzim sampai saat ini masih belum jelas. Namun
demikian Hashimoto (2006) menyatakan peran utama CBM meningkatkan
efisiensi fungsi katalisis enzim-enzim karbohidrase walaupun dengan mekanisme
yang belum jelas.
CBM
linker
Catalytic domain
Gambar 16 Domain umum selulase yang terdiri dari domain katalitik dan CBM
yang dihubungkan oleh daerah penghubung (linker)
GH12 merupakan salah satu famili glikosida hidrolase yang mempunyai
aktivitas endoglukanase dan xyloglukan hidrolase. Mekanisme katalisisnya adalah
retaining dengan Glutamat (Glu) sebagai basa nukleofil maupun donor protonnya.
Sampai saat ini GH12 mempunyai sekitar 151 anggota dengan 7 arsitektur yang
berbeda. Sebagian besar anggota mempunyai arsitektur tanpa domain CBM.
Sementara itu arsitektur dengan kombinasi antara katalitik domain dan domain
CBM, seperti pada Cel2B S. lividans hanya sedikit.
Berdasarkan
perbandingan
struktur
homolog
dengan
struktur
endoglukanase lain yang sudah diketahui, residu-residu yang berperan dalam
fungsi katalitik EglA A.niger IPB1 maupun pengikatan substratnya dapat
dideduksikan (Gambar 17). Glu116 diprediksi berperan sebagai nukleofil dan
Glu204 diprediksi berperan sebagai donor proton. Pada famili GH12, posisi
nukleofil ini berdekatan dengan dua residu yang sangat terkonservasi, yaitu Asp99
dan Met118 (Zechel et al. 1998; Sandgreen et al. 2003).
Situs pengikatan glikosil diprediksikan tersusun atas beberapa residu
dengan rantai samping aromatik, seperti Trp, Tyr dan Phe (Sandgreen et al. 2003).
Mengacu pada beberapa residu yang terlibat dalam pengikatan substrat pada
famili GH 12 (Goegedebuur et al 2002), residu Trp (posisi 22, 49, 51, 85, 120,
144), Tyr (61, 98, 115) dan Phe (163, 179) pada A. niger IPB1 diprediksi berperan
dalam pengikatan substrat glikosil.
A.niger
B.licheniformis
T.reesei
S.lividans
1
10
20
30
40
50
|
|
|
|
|
|
GQ-TMCSQYDSAS-SPPYSVNQNLWGEYQGTGS-QCVYVNKLSSSGASWHTEWTWSGGEG
SS-SNPSDKLYFK-NKKYYIFNNVWGADQVSGWWQTIYHN--SDSDMGW--VWNWPSNTS
AQ-TSCDQWATFT-GNGYTVSNNLWGASAGSGF-GCVTAVSL-SGGASWHADWQWSGGQN
ADTTICEPFGTTTIQGRYVVQNNRWG---STAP-QCVTATDTGFRVTQADGSAPTNGAPK
A.niger
B.licheniformis
T.reesei
S.lividans
60
70
80
90
100
|
|
|
|
|
TVKSYSN------------SGVTF-NKKLVSDVSSIPTSVEWKQDNTNVNADVAYDLFTA
TVKAYPSIVSGWHWTEGYTAGSGF-PTRL-SDQKNINTKVSYSI-SANGTYNAAYDIWLH
NVKSYQN------------SQIAIPQKRTVNSISSMPTTASWSYSGSNIRANVAYDLFTA
SYPS---VFNGCHYTN---CSPGTDLPVRLDTVSAAPSSISYGFVDGAV-YNASYDIWLD
A.niger
B.licheniformis
T.reesei
S.lividans
110
120
130
140
150
160
|
|
|
|
|
|
ANVDHAT--SSGDYELMIWLARYGNIQPIGKQIATATVGGKSWEVWYGSTTQAGAE-QRT
-NTNKASWDSAPTDEIMIWLNNT-NAGPAGSYVETVSIGGHSWKVYKGYIDAGGGKGWNV
ANPNHVT--YSGDYELMIWLGKYGDIGPIGSSQGTVNVGGQSWTLYYGYN----GA-MQV
PTA-RT--DGVNQTEIMIWFNRVGPIQPIGSPVGTASVGGRTWEVWSGGN----GS-NDV
A.niger
B.licheniformis
T.reesei
S.lividans
170
180
190
200
210
|
|
|
|
|
YSFVSESPINSYSGAINAFFSYLTQNQGFPASSQYLINLQFGTEAFTGGPATFTVDNWTA
FSFIRTANTQSANLNIRDFTNYLADSKQWLSKTKYVSSVEFGTEVF-GGTGQINISNWDV
YSFVAQTNTTNYSGDVKNFFNYLRDNKGYNAAGQYVLSYQFGTEPFTGS-GTLNVASWTA
LSFVAPSAISGWSFDVMDFVRA-TVARGLAENDWYLTSVQAGFEPWQNG-AGLAVNSFSS
Gambar 17 Kesejajaran urutan asam amino empat enzim GH 12. Posisi residu
nukleofil dan donor proton ditunjukkan dengan tanda anak panah
hitam dan putih secara berturut-turut.
4.3.5 Analisis hidrofobisitas EglA
Analisis hidrofobisitas dilakukan untuk mengetahui profil hidrofobisitas
dari suatu urutan asam amino. Analisis ini digunakan untuk untuk menentukan
apakah suatu protein termasuk protein yang larut dalam air atau protein membran
(Zhao & London 2006). Profil hidrofobisitas berdasarkan skala Kyte & Doolittle
menunjukkan secara keseluruhan EglA mempunyai nilai hidrofobisitas yang
relatif negatif (hidrofilik) sehingga diprediksi kuat merupakan protein yang larut
dalam air (Gambar 18). Selain itu terlihat adanya satu segmen transmembran pada
N terminal (berdasarkan nilai kepercayaan yang direkomendasikan pada skala
Kyte & Doolittle, yaitu 1.6). Adanya satu segmen transmembran pada daerah Nterminal mengindikasikan bahwa protein tersebut disekresikan (Clavarie &
Notredame 2003). Hasil ini dikuatkan dengan analisis menggunakan TMHMM
(Gambar 19) yang menyimpulkan bahwa EglA A. niger IPB1 merupakan protein
di luar sel.
Gambar 18 Profil hidrofobisitas menggunakan skala Kyte & Doolittle (Protscale)
Gambar 19 Prediksi segmen transmembran (TMHMM)
4.3.6 Kekerabatan EglA A.niger IPB1 dengan endoglukanase anggota
famili GH12 lainnya berdasarkan struktur asam aminonya.
Analisis filogenetik dilakukan untuk menggambarkan hubungan kedekatan
gen eglA A. niger IPB1 dengan gen-gen endoglukanase famili GH 12 lainnya.
Analisis ini dilakukan dengan membandingkan gen eglA A. niger IPB1 dengan
gen lainnya berdasarkan nilai kesamaan sekuennya. Analisis kesamaan EglA
A.niger IPB1 berdasarkan urutan asam aminonya dilakukan terhadap beberapa
endoglukanase dari anggota famili GH12. EglA A. niger IPB1 mempunyai
kesamaan tertinggi, 99%, dengan endoglukanase A A. niger database. EglA juga
menunjukkan kesamaan yang tinggi dengan endoglukanase kelompok Aspergillus
lainnya, yaitu 63% dengan A.aculaetus dan 60% dengan A. kawachi. Sementara
itu kesamaan eglA A. niger IPB1 dengan kelompok bakteri dan archaea adalah
kecil. A. niger IPB1 mempunyai kesamaan 18% dengan S .lividans dan 15%
dengan P. furiosus. Kesamaan antar anggota famili GH12 ini merupakan hasil
penyejajaran keseluruhan urutan gen GH12 yang meliputi daerah dengan
similaritas tinggi dan daerah beragam. Hasil penyejajaran menunjukkan daerah
yang mempunyai similaritas tinggi terletak pada domain katalitik sedangkan
diluar domain katalitik sangat bervariasi (Lampiran 7).
Pohon
filogenetik
yang
menggambarkan
tingkat
kekerabatan
endoglukanase beberapa anggota famili GH12 dikonstruksi menggunakan
program PHYLIP berdasarkan hasil multiple sequence alignment famili GH12
dengan program T-COFFEE yang mempunyai tingkat akurasi tinggi (Edgar &
Badzoglou
2006).
Secara
garis
besar,
gen-gen
endoglukanase
terlihat
mengelompok sesuai dengan taksonnya, yaitu bakteri, cendawan dan archaea
(Gambar 20). Kelompok cendawan terbagi menjadi tiga subfamili, yaitu
subfamili1 yang terdiri dari kelompok Ascomycetes (A. aculeatus, A. kawachi, A.
niger, Fusarium equiseti, Bionectrica ochroleuca, T. viride, T. reesei), subfamili2
yang terdiri dari beberapa kelompok Ascomycetes (A. oryzae dan A. nidulans) dan
Oomycetes (Phytophthora sojae dan Phytophthora ramomum), dan subfamili3
terdiri dari kelompok Basidiomycetes (Phanerochaete crhysosporium dan
Polyporus arcularius).
*
Ascomycetes
Fungi
Ascomycetes
& Oomycetes
Basidiomycetes
Bakteri
Archaea
Gambar 20 Pohon filogenetik beberapa endoglukanase anggota famili GH12