enzim adalah biokatalisator

14/01/2014
ENZIM SEBAGAI BIOKATALISATOR
ENZIM ADALAH BIOKATALISATOR
 Enzim : molekul protein tak hidup yang dihasilkan oleh sel
hidup
 Protein enzim melangsungkan ribuan reaksi kimia di dalam
sel.
TUJUAN INSTRUKSIONAL KHUSUS :
•M A H A S I S W A
MAMPU MENJELASKAN
SEBAGAI BIOKATALISATOR
PERAN
ENZIM
 Reaksi kimia yang dikatalisis enzim di dalam sel:
- mengekstrak energi dari lingungam
-mengubah sumber energi menjadi molekul yang bermanfaat
- memperbaiki dan membangun diri sendiri
- melakukan pembuangan hasil samping
- melakukan replikasi diri
SIFAT-SIFAT ENZIM SEBAGAI BIOKATALISATOR
 Katalis yg paling
efisien  mampu
mempercepat reaksi
1020 kali lbh cepat
 Enzim bersifat sangat
spesifik, baik jenis
reaksi maupun
substratnya ,
Trombin
1
14/01/2014
Tiga sifat utama enzim :
 Enzim tidak ikut bereaksi dgn substrat atau produknya
 Aktifitas dapat dikontrol sesuai dengan kebutuhan
organisme itu sendiri
Contoh : enzim yg mengkatalisis reaksi pertama pada
suatu siklus biosintesis biasanya di hambat oleh produk
akhirnya(feedback inhibition)
 Kemampuan katalitiknya
 Spesifisitas
 Kemampuan untuk diatur (regulasi)
 Bbrp enzim disintesis dlm btk tidak aktif, dan akan
diaktifkan oleh kondisi dan waktu yang sesuai (enzim
allosterik) .
 Prekursor yg tidak aktif disebut  zymogen
Bagian-bagian enzim
Bagian-bagian enzim ..............
BM antara 12,000 – 1 juta kDalton
 Holoenzim : enzim aktif lengkap dengan semua
•Holoenzim
 Apoenzim / apoprotein : bagian yang terdiri
komponennya
•Apoenzim/ apoprotein
•Gugus prostetik
•Koenzim
•Kofaktor
dari protein saja pada suatu enzim
 Ada enzim yang tidak membutuhkan molekul
kimiawi lain untuk aktifitasnya, tetapi ada juga
yang membutuhkan
 Senyawa kimia lain yang dibutuhkan enzim :
kofaktor / koenzim
 Fungsi koenzim adalah sebagai karier sementara
dari gugus fungsional yg berperan dalam reaksi
ensimatis tersebut.
2
14/01/2014
Bagian-bagian enzim ............
Tabel 1. Berbagai koenzim yang berasal dari
vitamin
 Kofaktor  ion-ion inorganik yg dibutuhkan enzim
untuk melakukan fungsinya
Vitamin
 Koenzim  molekul organik (komplek) yang
dibutuhkan enziim untuk melakukan fungsinya
 Koenzim atau kofaktor yang terikat sangat kuat
bahkan terikat dengan ikatan kovalen dengan enzim
 gugus prostetik
Tabel 2. Enzim yang membutuhkan ion-ion anorganik
sebagai kofaktor
Kofaktor
Enzim
Fe2+
Sitokrom oksidase, Katalase, Peroksidase
atau
Fe3+
Cu2+
Sitokrom oksidase
Zn2+
Karbonik anhidrase, Alkohol dehidrogenase
Mg2+
Heksokinase, Glukosa-6-pospatase, Piruvat kinase
Mn2+
Arginase, Ribonukleotida reduktase
K+
Piruvat kinase
Ni2+
Urease
Mo
Niditrogenase
Se
Glutation peroksidase
Koenzim
Fungsi enzimatik
Thiamin (B1)
Thiamin pirofosfat
Dekarboksilasi oksidatif
Riboflavin (B2)
Flavin nukleotida
Memindahkan H
Niasin (B5)
Nikotinamid nukleotida
Memindahkan H
Piridoksin (B6)
Piridoksal fosfat
Transaminasi
Asam Pantotenat
Koenzim A
Dekarboksilasi oksidatif,
metabolisme asetil Ko A
Biotin
Biotin
Karboksilasi
Folat
Tetrahidrofolat
Memindahkan 1 karbon
Bagaimana enzim bekerja
 Reaksi tanpa enzim:
 Lambat
 Membutuhkan suhu yang tinggi
 Tekanan yang tinggi
 Reaksi enzimatis
 Enzim memberikan suatu lingkungan yg spesifik di dalam sisi
aktifnya, sehingga reaksi secara energetik dapat lebih mudah
terjadi
3
14/01/2014
 Perbedaan antara energi reaktan (fase awal) dgn
energi produk (fase akhir)  selisih energi bebas
standar (ΔGº)
Agar reaksi berjalan
spontan, bagaimanakah
nilai ΔGº
Enzim  mempercepat reaksi tetapi tidak mengubah
keseimbangan reaksi atau ΔGº
Kesetimbangan reaksi antara Reaktan dan produk
mencerminkan perbedaan energi bebas pada fase awal
Kecepatan reaksi tergantung energi aktifasi ΔGº≠
 suatu pasokan energi dibutuhkan untuk mengawali suatu
reaksi
Energi aktifasi untuk reaksi yg dikatalis dengan enzim < dr
reaksi tanpa enzim
Glukosa + 6 O2  6 CO2 + 6 H2O ΔGº = -2880 kJ/mol
Enzim penting untuk menurunkan energi aktifasi untuk
memulai suatu reaksi
Enzim  mengikat substrat  menciptakan jalan reaksi yg
berbeda yg mempunyai fase transisi lebih rendah dbanding
reaksi tanpa enzim
Inti dr reaksi katalisis  ikatan yg spesifik pd fase transisi
4
14/01/2014
 Substrat terikat  interaksi nonkovalen
E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P
 Kekuatan enzim dalam mengkatalisis suatu reaksi 
kemampuan enzim membawa substrat bersama-sama pd
orientasi yang tepat untuk terjadinya suatu reaksi
 Substrat terikat pd  sisi aktif yaitu cekukan pd
protein yg berisi asam amino yg penting untuk terjadinya
suatu reaksi kimia
Karakteristik sisi aktif enzim




Merupakan bagian kecil dari enzim
Sisi aktif merupakan suatu cekukan yang bersifat 3
dimensi.  memberikan lingkungan mikro yg
sesuai untuk terjadinya suatu reaksi kimia
Substrat terikat pada sisi aktif dengan interaksi /
ikatan yang lemah.
Spesifitas enzim dipengaruhi oleh asam amino yg
menyusun sisi aktif suatu enzim
5
14/01/2014
 Sisi aktif mempunyai 2 bagian yg penting:
 Bagian yang mengenal substrat dan kemudian mengikatnya
 Bagian yang mengkatalisis reaksi, setelah substrat diikat
oleh enzim
 Asam amino yang membentuk kedua bagian
tersebut tidak harus berdekatan dalam urutan
secara linear, tetapi dalam konformasi 3D mereka
berdekatan
Gambar sisi aktif ensim dan asam amino yang
terlibat
Teori untuk menjelaskan kerja enzim:
 Lock and Key analogy
Enzim memiliki struktur sisi spesifik yang cocok dengan
substrat.
Mampu menerangkan spesifitas ensim tetapi tidak dapat
menerangkan stabilitas fase transisi ensim
 Induced Fit theory
mempertimbangkan fleksibilitas protein, sehingga
pengikatan suatu substrat pada enzim menyebabkan sisi
aktif mengubah konformasinya sehingga cocok dengan
substratnya.  dapat menerangkan fase transisi ES
komplek
 Perbandingan model
“induced fit” dan
“kunci dan anak
kunci” pada
pengikatan substrat
oleh enzim?
6
14/01/2014
FAKTOR YANG MEMPENGARUHI KERJA ENZIM
Faktor-faktor yg mempengaruhi kerja enzim
 pH  setiap enzim mempunyai pH optimum utk
bekerja.
contoh : pepsin  pH 2, amylase  pH 7.0
 Suhu  setiap kenaikan suhu 10˚C (sampai 40˚C),
kecepatan reaksi naik 2 x lipatnya dan reaksi
terhambat dan berhenti pada 60˚C.
 [S] dan atau [E]
Konsentrasi Substrat
pH dan suhu
PENGARUH pH dan suhu
 Protein memiliki banyak gugus ionik  perubahan pH akan




mempengaruhi sisi katalitik dari enzim
Aktivitas enzim max terjadi pada kisaran pH tertentu  pH
opt 4,5 – 8,0
Beberapa enzim memiliki pH optimum yang ekstrim, misal
: pepsin 0H 1,8 dan arginase pH 10,0
Pada kisaran pH ekstrim, asam dan basa mengalami
inaktivasi yang irreversible, sedang diluar itu terjadi
inaktivasi yang reversible
Enzim yang sama tapi asalnya berbeda bisa mempunyai pH
opt yang berbeda, misal : metil esterase dari kapang pH opt
nya 5,0, sedangkan dari kacang merah pH opt 8,5.
 Jika suhu meningkat maka laju reaksi enzimatis
akan semakin meningkat, tetapi laju denaturasi
thermal juga meningkat  perlu dibuat suhu opt
 Pengaruh suhu terhadap reaksi katalitik enzim dan
denaturasi dinyatakan dengan Per Arrhenius :
k = Ae-E/RT
k = konstanta laju reaksi
A = konstanta Arrhenius
E = energi aktivasi
R = konstanta ketetapan gas
T = suhu absolut
7
14/01/2014
KINETIKA ENZIM
Tabel. Berbagai faktor yang mempengaruhi kecepatan reaksi enzim
No.
 Cabang enzimologi yang membahas faktor-faktor yang
mempengaruhi kecepatan reaksi enzimatis
 Interaksi antara molekul enzim dan lingkungan terjadi
pada tingkat intensitas beragam.
 Faktor2 yang mempengaruhi aktivitas enzim :
 Konsentrasi enzim
 Substrat
 Senyawa inhibitor dan aktivator
 pH
 Jenis pelarut pada lingkungan
 Kekuatan ion
 suhu
a.
b.
Gambar. a. Hubungan antara kecepatan awal reaksi enzim (v) dengan konsentrasi
substrat (S)
b. Hubungan antara konsentrasi enzim (E), kompleks enzim substrat (ES),
Substrat (S) dan produk hasil reaksi (P)
Faktor yang mempengaruhi
kecepatan reaksi
Jenis
Keterangan yang dapat diperoleh
Faktor
1.
Konsentrasi
Konsentrasi enzim,
substrat, produk,
inhibitor, aktivator
Mekanisme reaksi, Parameter kinetika
(Km, V, Ki)
2.
Faktor luar
Suhu
Parameter termodinamika dan
perubahannya (G, H, S, Ea
pH
pH golongan fungsional (asam amino
yang penting dalam pengikatan
substrat)
Konstanta dielektrik
dan kekuatan ion
Jenis ikatan dan muatan protein enzim
Struktur substrat,
Produk dan Efektor
Sifat2 interaksi dengan enzim, golongan
fungsional pada lokasi aktif enzim
Struktur enzim
Sifat biologis enzim, asam amino yang
berperan pada lokasi aktif
3.
Faktor dalam
• Perhatikan Gambar (a) : Sebelum tercapai V max, kecepatan
awal reaksi enzim (v) dipengaruhi oleh konsentrasi susbtrat
• Gambar (b) :
 Keadaan setimbang : kecepatan pembentukan ES dari E
dan S = kecepatan penguraiannya = kecepatan max reaksi
enzim yang dicapai pada konsentrasi substrat tertentu.
 Pada keadaan pra setimbang : terjadi S dan E dan P dan
ES.
 Pada keadaan setimbang : [ ] ES mencapai max  semua
molekul enzim berubah menjadi ES  kecepatan
pembentukan ES diatur oleh k1, sedang kecepatan
penguraian ES diatur oleh k1 dan k2  pada fase ini [ ] ES
per satuan waktu tetap (konstan)
8
14/01/2014
Pengukuran Parameter Reaksi Enzim
• Konsentrasi substrat  satuan berat atau konsentrasi (M,
mM, M)
• Enzim murni ; satuan berat/konsentrasi
• Komisi Enzim Internasional tahun 1956 jumlah enzim yang
melakukan katalisis yang menyebabkan perubahan 1 mol
substrat/menit = Unit enzim (U)
• Tahun 1972 diubah  1 kat (1 katal) = jumlah enzim yang
mengkatalis pengubahan 1 g mol substrat/detik :
• 1 kat = 1 mol/detik = 60 mol/menit
= 60 x 106 mol /menit
= 6 x 107 U
Tabel 3. Nilai kcat (Turnover number) Beberapa Jenis Enzim
Enzim
Katalase
Karbinik Anhidrase
Asetilkolinesterase
Penisilinase
Laktat Dehidrogenase
Kimotripsin
DNA Polimerase I
Lisozim
Kcat (Sec-1)
40.000.000
1.000.000
14.000
2.000
1.000
100
15
0.5
Pengukuran Parameter Reaksi Enzim (2)
• Konsentrasi enzim  unit/ml atau unit/mg berat protein
enzim satuan spesifik aktivitas enzim.
• Turnover number (bilangan balik) = jumlah mol substrat yang
dapat diubah per mol enzim dalam keadaan
optimum/maksimum
Vmax
mol S atau P/menit
Bilangan Balik = --------- =
---------------------------E
mol E
Persamaan Michelis Menten
Reaksi Enzimatis
E+S
k1
k-1
ES
k2
E+P
..................1)
Kecepatan Pembentukan Produk :
v = dP/dt = k2(ES)
..................2)
d(ES)/dt = k1(E)(S)-k-1(ES)-k2(ES)
......3)
Konservasi Enzim
(E) = (E0) – (ES)
..................4)
9
14/01/2014
• Dari Pers (3) dan (4) :
k1 (E)o (S)
ES = -----------------k1 + k2 + k1 (S)
................ (5)
Substitusi Pers (5) ke Pers (2) :
k2 (E)o(S)
v =-------------------.........(6)
(k1 + k2)/k1 + S
Jika semua enzim telah berubah menjadi ES (ES = Eo)  reaksi
enzim mencapai max :
Vmax = k2(ES) = k2 (Eo) .......................(7)
• Pada saat v mencapai ½ Vmax, Pers (1) menjadi :
Vmax (S)
½ Vmax = V = ----------  Pers. Michelis Menten
Km (S)
Km + (S) = 2 S)
Km = (S).......................................10)
• V = k2 (E)o; atau
k2 = Vmax/(E)o .............................11)
 k2 = bilangan balik enzim (semakin murni
enzim k2 semakin tinggi
• Konstanta Michelis Menten :
k-1 + k2
Km = ---------........8)
k1
• Substitusi pers (7) dan (8) ke Pers (6) :
v
Vmax [S ] k 2 [E 0 ][S ]

K m  [S ] K m  [S ]
Percobaan Penentuan
Parameter Kecepatan untuk
Kinetika Michaelis-Menten
Lineweaver-Burk
Eadie-Hofstee
Hanes- Woolf
Kinetika Batch
10
14/01/2014
Enzyme Kinetics
Penentuan Parameter
Direct plot
kcat /Km
kcat
Observe vo change
under various [S],
resulted plots
yield Vmax and Km
Turn over
number
k3 [Et]
Vmax
Activity Unit
Maximum
velocity
1 mmole
min
Specific Activity
unit
mg
zero order
1st order
Activity
&
E3
E2
E1
Km
Affinity with
substrate
Double reciprocal
Bi-substrate reaction also
follows M-M equation, but
one of the substrate should
be saturated when estimate
the other
Inhibition
• Buat persamaan dalam bentuk persamaan
linier.
• Plot data.
• Data bagaimana yang harus kita miliki
untuk pengujian kinetika enzim?
• Buat sebuah percobaan
• Slope dan titik potong berhubungan
dengan nilai parameter.
Significance
V [S]
vo= max
Km + [S]
Competitive
Non-competitive
Uncompetitive
Juang RH (2004) BCbasics
Lineweaver-Burk double reciprocal plot
Percobaan Kinetika Enzim
• Enzim + Substrat (reaktan) ditempatkan
pada wadah dengan suhu konstan, diaduk.
• Catat laju kehilangan
pembentukan produk
reaktan
atau
Kenapa harus suhu konstan?
Kenapa harus diaduk dengan sempurna?
Bagaimana dengan medium? Buffer?
Y=mx + b
Plot 1/v Vs 1/[S].
Slope = Km/Vmax,
Titik potong = 1/Vmax
11
14/01/2014
Contoh: Lineweaver-Burk
Solusi Secara Grafik
[S] x 10-5 M
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
intersep
1/ V
Slope = Km/ Vmax
1 Km 1
1


v Vmax [S] Vmax
1/ Vmax
1/ [S]
-1/ Km
V, M/min x 10-5
1.17
1.50
1.75
1.94
2.10
2.23
2.33
2.42
2.50
Plot 1/V Vs 1/[S]
Fit to Data
Lineweaver-Burk Plot
3.00
9.00
y = 0.5686x + 2.8687
2.50
8.00
7.00
2.00
6.00
1.50
5.00
4.00
1.00
3.00
0.50
2.00
1.00
0.00
0.00
0.00
2.00
4.00
6.00
1/[S] x 10^(-4)
8.00
10.00
12.00
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
[S] (M) x 10^(-5)
12
14/01/2014
Metode Lain
PR
• Eadie-Hofstee plot
v  Vmax  K m
v
[S ]
• Dari contoh data untuk Lineweaver-Burl,
hitung juga Km dan Vmax dengan
menggunakan metode Edie-Hofstee dan
Hanes-Woolf
• Hanes- Woolf
[S ] K m


v
Vmax
1
[S ]
Vmax
Contoh Soal 2
Dari sebuah percobaan kinetika enzim diperoleh data sebagai
berikut :
Contoh Soal 3
Percobaan enzimatis dilakukan pada 2 kondisi yang berbeda
menggunakan substrat murni S. Hasil yang diperoleh adalah sebagai
berikut :
[S] (10-5M)
Vo
Kondisi A
Kondisi B
0.08
[S]] (M)
V (nmol/min)
1.5
0.21
0.20
1.43
2.0
0.25
0.1
0.26
1.67
3.0
0.28
0.12
0.33
2.08
4.0
0.33
0.13
1.00
3.33
8.0
0.44
0.16
16.0
0.40
0.18
Buatlah garifk hubungan [S] Vs V, tentukanlah nilai Km dan Vmax
a. Buatlah plot menggunakan plot Lineweaver-Burk
b. Hitunglah nilai Vmax dan Km untuk kedua kondisi tersebut
c. Jelaskan alasan yang memungkinkan mengapa kedua hasil
tersebut berbeda
13
14/01/2014
Perbandingan Metode
• Lineweaver-Burk: memberikan pendugaan
yang baik terhadap Vmax, kesalahan tidak
simetris terhadap data, pada [S] yang
rendah nilai error semakin tinggi
• Eadie-Hofstee: bias< pada [S] yang rendah
• Hanes-Woolf: lebih akurat untuk Vmax.
• Tidak satupun metode ini yang sempurna
Penghambatan Reaksi Enzimatis
 Kerja enzim dapat dihambat secara reversible atau irreversible
 Irreversible  pembentukan atau pemecahan ikatan kovalen
dalam enzim
 Reversible  suatu senyawa dapat terikat dan kemudian dpt
lepas kembali
Reversible inhibitor ini dpt dibagi :



competitive
non-competitive
un-competitive
 Penghambatan substrat
Kinetika Reaksi Batch
v
d[S ] Vmax [S ]

dt
K m  [S ]
Integrasi
Vmaxt  [S 0 ]  [S ]  K m ln
[S 0 ]
[S ]
dihasilkan :
[S 0 ]  [S ]
K
[S ]
  m ln 0 Vmax
t
t
[S ]
PENGATURAN ENZIM
Penghambat kompetitif
(competitive inhibitor):
molekul inhibitor
berkompetisi dengan
substrat untuk
menempati sisi aktif
enzim.
Penghambat non
kompetitif
(allosteric inhibition)
Molekul penghambat
bergabung dengan
enzim di luar sisi aktif,
menyebabkan
konformasi enzim
berubah
14
14/01/2014
Penghambatan competitive
Penghambatan umpan balik (Feedback Inhibition)
Penumpukan produk akhir menghambat kerja enzim
pertama dalam rangkaian reaksi tersebut sehingga
produksi enzim selanjutnya ditunda
 Inhibitor bersaing dgn
substrat untuk terikat pd
sisi aktif
 Biasanya inhibitor berupa
senyawa yg menyerupai
substratnya, & mengikat
enzim membentuk
komplek EI
 krn terikat scr reversible
 penghambatannya bias,
yaitu ketika ditambah
substrat maka
penghambatan berkurang
 Contoh penghambatan kompetitif : asam
malonat yang strukturnya mirip dengan asam
suksinat  menghambat suksinat
dehidrogenase
Gambar. Penghambatan kompetitif pada reaksi enzim,
dilakukan menurut Leneweaver-Burk
Pemetaan
15
14/01/2014
• Nilai K1 = konstanta kesetimbangan bagi reaksi penghambatan,
dimana :
k-1
(E)(I)
K1 = ----- = ------k1
EI
• Pers Michelis Menten dengan adanya penghambatan
kompetitif :
Vmax [S ]
Vmax [S ]
v 

 I 
K m,app

 [S ]
K m 1
 [S ]
 K I 


• Pers Lineweaver-Burk bagi enzim yang mengalami
penghambatan :
Penghambatan non-competitive
 inhibitor terikat pada sisi lain
dari enzim (bkn sisi aktif)
 jadi tidak memblok pembtkan
enzim-substrat komplek
 Enzim mjd tidak aktif ketika
inhibitor terikat walau enzim
mengikat substrat
 Inhibitor mengurangi
konsentrasi enzim yg aktif,
sehingga mempengaruhi
Vmax –nya

Gambar.
Penghambatan non kompetitif pada reaksi enzim.
Pemetaan dilakukan menurut Lineweaver Burk
16
14/01/2014
• Persamaan Lineweaver-Burk untuk enzim yang
mengalami penghambatan non kompetitif :
Penghambatan un-competitive
 Terikat pd sisi selain sisi
aktif enzim
 Berbeda dgn non-
competitive  inhibitor
ini hanya terikat pd ES
komplek
 Sehingga tidak terikat pd
enzim bebas
 Vmax berubah, dan Km
juga berubah

17
14/01/2014
Enzyme Inhibition (Mechanism)
Competitive
I
Non-competitive
I
E
S
I
S
I
I
I
Compete for
active site
S
I
Direct Plots
E
S
Competitive
I
Non-competitive
Vmax
E
Substrate
S
Inhibitor
I
Uncompetitive
Different site
vo
E + S←
→ ES → E + P
+
+
I
I
↓↑
↓↑
EII + S →EIIS
E + S←
→ ES → E + P
+
I
↓↑
EIIS
I
[II] binds to free [E] only,
and competes with [S];
increasing [S] overcomes
Inhibition by [II].
[II] binds to free [E] or [ES]
complex; Increasing [S] can
not overcome [II] inhibition.
[II] binds to [ES] complex
only, increasing [S] favors
the inhibition by [II].
I
[S], mM
Km = Km’
Vmax decreased
Km unchanged
1/vo
1/vo
1/Km
I
Vmax
I
Km’ Km
Persamaan Michaelis-Menten
Vmax’
[S], mM
Both Vmax & Km decreased
1/vo
I
I
Two parallel
lines
1/ Vmax
1/[S]
Intersect
at X axis
1/Km
1/ Vmax
1/[S]
Juang RH (2004) BCbasics
Pengaruh Substrat
Uncompetitive
Vmax’
[S], mM
Vmax unchanged
Km increased
Intersect
at Y axis
I
Vmax
vo
Km Km’
E + S←
→ ES → E + P
+
I
↓↑
EII
Double Reciprocal
Equation and Description
Cartoon Guide
I
Enzyme Inhibition (Plots)
1/ Vmax
1/Km
1/[S]
Juang RH (2004) BCbasics
Pengaruh Substrat
• Jika [S]= KM, persamaan Michaelis Menten  menjadi
• Jika [S] >> KM, persamaan Michaelis Menten  menjadi
• Jika [S] << KM, persamaan Michaelis Menten  menjadi
18
14/01/2014
Penghambatan Oleh Substrat
• E+S
k1
k-1
ES
+
S
ksi
k2
Penghambatan oleh Substrat
E +P
No substrate inhibition
v
k-si
Substrate inhibition
ESS
ES [S]
• Ksi= ----------------
v 
[S ]max. rate  K mK Si
Vmax [S ]
[S]2
K m  [S ] 
KSi
S
ESS
REAKSI ENZIMATIS DUA SUBSTRAT
• Persamaan Michaelis –Menten diturunkan untuk
reaksi enzim dengan 1 substrat
• Umumnya reaksi enzim memiliki substrat dan produk
yang lebih dari 1
• Reaksi 2 substrat (Bi-substrate) terjadi pada hampir
60% reaksi enzim
REAKSI ENZIMATIS DUA SUBSTRAT
 Model reaksi :
A+BP+Q
 Umumnya terjadi pada enzim transferase
 Cara penentuan nilai Km dan Vmax sama dengan
penentuan pada substrat tunggal
 Diperlukan rangkaian percobaan yang menggunakan
salah satu substrat tetap (misal B) sedang yang
kedua divariasi untuk menentukan pengaruhnya
terhadap Km, sehingga diperoleh KmA, kemudian
perlakuan dibalik, sehingga diperoleh KmB
19
14/01/2014
Persamaan Kinetika untuk Reaksi 2
Substrat
 Ada 2 keadaan yang mungkin terjadi jika 2 substrat
[B]
1/v
v=
Vmax[A][B]
Ka[B] + Kb[A] + [A][B]
bereaksi dengan bantuan enzim, yaitu :
- reaksi pergantian tunggal
- reaksi pergantian ganda
1/[A]
v=
Vmax[A][B]
[A][B] + Ka[B] + Kb[A] + KaKb
[B]
1/v
1/[A]
REAKSI PERGANTIAN TUNGGAL
 Kedua substrat A dan B secara simultan harus terdapat pada sisi aktif
enzim sehingga diperoleh senyawa terner EAB
 Ada 2 cara reaksi pergantian tunggal (RPT), yaitu :
- RPT- acak
- RPT - teratur
 Pada RPT-acak, reaksi enzim dengan substrat maupun produk terjadi
secara acak :
 Pada RPT-teratur terdapat substrat utama yang harus terikat terlebih
dahulu sebelum substrat kedua bereaksi  Bi Bi Mechanism
E + A (Substrat utama)
EA
EA + B
EAB
B
A
E
EA
P
EAB
EPQ
Q
EQ
E
Setelah A terikat pada E, maka B terikat oleh EA menjadi EAB. Baik A
maupun B kemudian mengalami transformasi menjadi P dan Q yang
masih terikat dengan E. P dilepas lebih dahulu kemudian Q.
P
A
E
EA
E*P
B
E*
Q
E*B
EQ
E
20
14/01/2014
REAKSI PERGANTIAN GANDA (RPG)
 Beda RPT-teratur dengan RPT-acak : pada RPT
teratur, hasil reaksi pertama akan menghambat
secara kompetitif reaksi total.
 Persamaan untuk menghitung V pada RPT-teratur :
V
1
Vmax
( K mA 
K sA K mB 1
KB
1
( )
(1  m )
B
A Vmax
B
 Salah satu substrat utama terikat pada enzim yang
kemudian dilepas sebagai hasil sebelum substrat
kedua masuk terikat pada enzim
 Contoh : reaksi yang dikatalis oleh aspartat amino
transferase
Aspartat + -ketoglutarat  oksaloasetat + Glutamat
 Mekanismenya disebut : Ping-Pong Bi Bi Mechanism
B
A
E
 Ping-Pong Bi Bi Mechanism :





Substrat utama (asam aspartat) terikat terlebih dahulu pada enzim
Gugus amino pada asam aspartat dipindahkan pada gugus prostetis
(piridoksal fosfat) yang terikat pada enzim
Aspartat akan berubah menjadi asam oksaloasetat dan dilepas dari
sisi aktif
Substrat kedua masuk pada sisi yang sama dan terjadi penempelan
gugus amino pada asam tersebut membentuk glutamat
Asam glutamat meninggalkan sisi aktif
A
E
Q
E *A
E*B
P
E*
B
EA
P
EAB
EPQ
Q
EQ
E
 Ping-Pong Mechanism
P
A
E
EA
E*P
B
E*
Q
E*B
EQ
E
21
14/01/2014
Reaksi Ping-Pong
 Persamaan untuk menghitung V pada reaksi
pergantian ganda :
O
H OH
H O
HO
HO
H
OH
O
H
A
m
H
P
O
B
m
K
1 K
1
1

( )  (1 
)(
)
V Vmax A
B Vmax
O
O
O
O
P
OH
HO
HN
H O
H
HO
N
H
H
O
O
O
H
H
H
P
O
H
O
O
galactose 1-phosphate
H
OH
OH
OH
O
UDP-Glucose
HO
O
OH
H O
H
HO
H
H
OH
O
H OH
HN
H
P
O
O
O
O
O
P
O
O
H
H
O
OH
N
H
H
OH
H O
HO
HO
H
H
OH
O
H
P
O
O
O
glucose 1-phosphate
UDP-Galactose
Inaktivasi Enzim
• Enzim akan mengalami denaturasi akibat :
– Suhu
– pH
– Radiasi
– Pengikatan Irreversible oleh inhibitor
• Suhu dapat meningkatkan laju aktivitas
enzim (thermal activation) dan menurunkan
laju aktivitas enzim (thermal denaturation)
Pengaruh Suhu
Suhu optimum untuk reaksi
enzim 35 -45℃ .
22
14/01/2014
Pengaruh Suhu
Pengaruh Suhu
Pada suhu moderat, semakin tinggi suhu
maka laju reaksi akan meningkat
v  k2 [ E ], dimana k2  Ae
 Ea
RT
Pada suhu tinggi, maka semakin tinggi suhu
laju denaturasi akan meningkat :

 Ed
d [E ]
 kd [ E ], atau [ E]  [ E0 ]e kd t , dimana kd  Ad e d RT
dt
Pengaruh suhu terhadap laju reaksi :
v  Ae
E a
RT
[E 0 ]e k d t
Energi Aktivasi 10
kcal/mol
Energi Deaktivasi100
kcal/mol
Pengaruh pH
pH Optimum
23