bahan dan metode

 BAHAN DAN METODE
Tempat dan waktu penelitian
Penelitian
dilaksanakan
di
Laboratorium
Bakteriologi
Tumbuhan,
Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, dari
Oktober 2010 sampai dengan Juni 2011.
Bahan dan Alat
Bakteri penghasil siderofor yang digunakan dalam penelitian ini diisolasi
dari perakaran tanaman tomat sehat pada lahan yang terinfestasi R. solanacearum
di wilayah Cipanas dan Lembang. Isolat P. fluorescens RH4003 dan isolat R.
solanacearum yang digunakan merupakan koleksi Laboratorium Bakteriologi
Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian
Bogor.
Benih tomat yang digunakan untuk pengujian kemampuan memacu
pertumbuhan tanaman yaitu varietas Arthaloka dan Ratna. Media tanam yang
digunakan yaitu campuran antara pupuk kompos dan tanah steril dengan
perbandingan 1:1.
Isolasi dan Uji Reaksi Hipersensitif Bakteri Penghasil Siderofor
Bakteri penghasil siderofor diisolasi dari bagian rizosfer tanaman tomat
sehat asal Cipanas dan Lembang, Jawa Barat.
Tanaman tomat yang dipilih
sebagai sampel dicabut kemudian tanah yang berada di bagian perakaran serta
bagian akar-akar halus diambil sebanyak 10 g dan disuspensikan ke dalam 100 ml
akuades steril.
Suspensi tersebut kemudian digoyang menggunakan shaker
dengan kecepatan 200 rpm selama 10 menit. Sebanyak 1 ml suspensi bakteri
diambil, kemudian dilakukan pengenceran berseri menggunakan akuades steril
hingga pengenceran 10-7. Suspensi diambil dari pengenceran 10-3, 10 -5, 10
-7
masing-masing sebanyak 100 µl kemudian disebar pada media chrom azurol
sulfat (CAS) secara duplo. Larutan indikator yang terkandung dalam media ini
adalah Fe-CAS yang membantu pembentukan zona berwarna jingga di sekitar
koloni bakteri yang menghasilkan siderofor. Zona berwarna jingga di sekitar
koloni tersebut merupakan indikator yang digunakan dalam menentukan bakteri
10 11
penghasil siderofor.
Bakteri penghasil siderofor kemudian diisolasi dan
digunakan untuk berbagai pengujian.
Sampel tanaman tomat asal Cipanas diberi kode Cp, kemudian diikuti
dengan nomor sampel sehingga akan diperoleh sampel dengan kode Cp1, Cp2,
dan Cp3. Sampel tanaman tomat asal Lembang diberi kode Lb, kemudian diikuti
dengan nomor sampel, sehingga akan diperoleh sampel dengan kode Lb1 dan
Lb2. Bakteri penghasil siderofor hasil isolasi disimpan dalam media cair dengan
kombinasi 80% nutrient broth dan 20% gliserol pada suhu -20 oC. Sebelum
perlakuan, bakteri dipindahkan untuk peremajaan pada media agar King’s B
dalam cawan petri.
Uji reaksi hipersensitif (HR) bakteri penghasil siderofor dilakukan untuk
mengetahui patogenisitas bakteri penghasil siderofor.
Pengujian dilakukan
dengan menggunakan daun tembakau sehat. Bakteri sebelumnya dibiakkan pada
media Luria Bertani broth (LB). Setelah diinkubasi selama 24 sampai 48 jam,
sebanyak 1 ml suspensi diambil dan disuntikkan pada daun tembakau.
Pengamatan dilakukan setelah 24 jam. Sebagai kontrol positif digunakan isolat R.
solanacearum dan Erwinia carotovora. Bakteri dinyatakan bersifat HR positif
apabila menimbulkan gejala nekrosis pada permukaan daun tembakau.
Uji Antagonisme Bakteri Penghasil Siderofor terhadap R. solanacearum
Uji antagonisme bakteri penghasil siderofor dilakukan pada media agar
King’s B. Biakan bakteri penghasil siderofor yang berumur 24 sampai 48 jam
masing-masing disuspensikan dalam akuades steril dan kerapatannya diusahakan
mencapai 108 – 109 cfu/ml. Media agar King’B yang telah disterilisasi dituang
pada cawan berdiameter 9 cm dan ditunggu sampai membeku.
Suspensi R.
solanacearum diambil sebanyak 100 µl kemudian disebar di permukaan media
tersebut. Setelah R. solanacearum yang disebar tersebut kering angin, satu potong
kertas saring steril berdiameter 5 mm diletakkan di atas permukaan agar.
Sebanyak 5 µl suspensi bakteri penghasil siderofor diteteskan di atas kertas saring
tersebut. Sebagai kontrol, potongan kertas saring ditetesi dengan akuades steril.
Setiap pengujian dilakukan sebanyak tiga ulangan.
Diameter zona hambatan
diukur setelah diinkubasi pada suhu ruang selama 24 sampai 48 jam.
12
Karakterisasi Bakteri Penghasil Siderofor
Karakterisasi dilakukan untuk mengetahui karakter dari masing-masing
bakteri penghasil siderofor yang memiliki kemampuan antagonisme terhadap R.
solanacearum. Karakterisasi meliputi pengamatan morfologi, produksi senyawa
fluoresens, reaksi Gram, kemampuan melarutkan fosfat, kemampuan bertahan
pada suhu 80 oC, dan kemampuan dalam memacu pertumbuhan tanaman tomat
yang meliputi daya kecambah, pertambahan tinggi tanaman, dan bobot kering
tanaman.
Morfologi Bakteri Penghasil Siderofor
Pengamatan morfologi bakteri penghasil siderofor dilakukan dengan cara
menggores kuadran bakteri penghasil siderofor pada media agar King’s B.
Pengamatan dilakukan setelah biakan berumur 24 sampai 48 jam. Pengamatan
morfologi meliputi diameter, bentuk, warna, elevasi, dan tepian dari koloni
tunggal masing-masing isolat bakteri.
Produksi Senyawa Fluoresens Bakteri Penghasil Siderofor
Produksi senyawa fluoresens oleh bakteri penghasil siderofor dideteksi
dengan cara menggoreskan bakteri penghasil siderofor pada media agar King’s B.
Setelah berumur 24 sampai 48 jam biakan bakteri kemudian diamati dibawah
lampu near ultraviolet (NUV) yang memiliki panjang gelombang sekitar 200
sampai 380 nm. Sebagai pembanding digunakan isolat bakteri P. fluorescens
RH4003 (P1).
Uji Gram Bakteri Penghasil Siderofor
Sifat Gram suatu bakteri dapat diketahui dengan metode sederhana
menggunakan KOH 3%. Biakan bakteri yang sebelumnya telah ditumbuhkan di
media padat diambil sebanyak satu lup, kemudian dilarutkan dalam KOH 3%.
Bakteri yang menghasilkan lendir mengindikasikan bahwa bakteri tersebut
termasuk kelompok Gram negatif, sedangkan yang tidak menghasilkan lendir
mengindikasikan bahwa bakteri tersebut termasuk kelompok Gram positif
13
Uji Aktivitas Pelarutan Fosfat oleh Bakteri Penghasil Siderofor
Uji aktivitas pelarutan fosfat dilakuan dengan cara menumbuhkan isolatisolat bakteri penghasil siderofor pada media Pikovskaya padat menurut meode
Rao dan Sinha (1963).
Setelah diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang,
dilakukan pengamatan zona bening di sekeliling koloni bakteri. Adanya zona
bening mengindikasikan bahwa bakteri penghasil siderofor tersebut memiliki
kemampuan melarutkan fosfat.
Uji Kemampuan Bertahan pada Suhu 80 oC
Bakteri yang akan diuji kemampuan bertahan pada suhu 80 oC sebelumnya
dibiakkan pada media LB. Setelah diinkubasi selama 24 jam bakteri tersebut
dipanaskan pada suhu 80 oC selama 15 menit, kemudian disebar pada media
tryptic soy agar. Bakteri yang tumbuh pada media TSA mengindikasikan bahwa
bakteri tersebut dapat bertahan pada suhu panas sampai 80 oC.
Uji Pemacuan Pertumbuhan Tanaman Tomat oleh Bakteri Penghasil
Siderofor
Kemampuan bakteri penghasil siderofor dalam memacu pertumbuhan
tanaman diukur berdasarkan kemampuannya dalam meningkatkan daya
kecambah, pertambahan tinggi, bobot basah, bobot kering, dan kadar air tanaman
tomat. Jenis tanaman tomat yang digunakan yaitu varietas Arthaloka dan Ratna.
Pengaruh bakteri penghasil siderofor terhadap daya kecambah. Media
tanam yang digunakan berupa tanah steril dan kompos yang dicampur dengan
perbandingan 1:1. Media tanam tersebut dimasukkan dalam pot tray berukuran
50 cm x 30 cm dengan jumlah lubang tanam sebanyak 128 lubang. Sebelum
ditanam, benih diberi perlakuan dengan cara direndam dalam suspensi bakteri
penghasil siderofor selama 16 jam atau semalaman sambil digoyang
menggunakan shaker. Sebagai kontrol, benih direndam dalam akuades steril.
Benih ditanam sebanyak satu benih per lubang tanam. Jumlah perlakuan untuk
setiap varietas sebanyak delapan perlakuan termasuk kontrol dengan masingmasing perlakuan tiga ulangan.
Masing-masing ulangan terdiri atas 15 unit.
14
Pengamatan dilakukan untuk melihat persentase daya kecambah (DK) dari
masing-masing perlakuan yang dihitung dengan menggunakan rumus :
DK (%) = jumlah benih yang berkecambah X 100%
jumlah benih yang diamati
Pengaruh bakteri penghasil siderofor terhadap tinggi tanaman.
Sebagai media tanam digunakan campuran tanah dan kompos dengan
perbandingan 1:1. Tanah dimasukkan ke dalam polybag berukuran 10 cm x 15
cm. Sebelum ditanam benih tersebut diberi perlakuan dengan cara direndam
dalam suspensi bakteri selama 16 jam atau semalaman sambil digoyang
menggunakan shaker. Sebagai kontrol, benih direndam dalam akuades steril.
Benih kemudian ditanam sebanyak satu benih per polybag. Jumlah perlakuan
untuk setiap varietas sebanyak delapan perlakuan termasuk kontrol. Masingmasing perlakuan diulang sebanyak tiga kali dan masing-masing ulangan terdiri
atas lima unit.
Pengamatan tinggi tanaman dilakukan setelah muncul daun
pertama sampai 30 hari setelah tanam. Selain itu dihitung nilai AUHPGC (area
under height of plant growth curve) dengan rumus yang dinyatakan oleh Van der
Plank (1963) sebagai berikut:
Keterangan:
yi+1= data pengamatan ke-i+1
yi = data pengamatan ke-i
ti+1 = waktu pengamatan ke-i+1
ti = waktu pengamatan ke-i
Pengaruh bakteri penghasil siderofor terhadap bobot basah, bobot
kering, dan kadar air tanaman tomat. Bobot basah tanaman tomat diukur
setelah panen dengan menggunakan timbangan digital. Bobot kering tanaman
diperoleh dengan cara mengeringkan terlebih dahulu tanaman yang dicabut
kemudian ditimbang sampai mendapatkan nilai bobot kering yang konstan. Kadar
air dihitung dengan menggunakan rumus:
15
Kadar air (%) = Bobot basah – Bobot Kering x 100%
Bobot Basah
Semua data yang diperoleh dari pengukuran daya kecambah, pertambahan
tinggi tanaman, nilai AUHPGC, bobot kering, bobot basah, dan kadar air tanaman
diubah dalam bentuk persentase peningkatan atau penurunan yang dibandingkan
dengan nilai kontrol masing-masing.
Analisis Data
Data populasi bakteri hasil isolasi dianalisis menggunakan uji t, dengan
bantuan program Minitab versi 13.3.
Rancangan percobaan yang digunakan
untuk menentukan pengaruh bakteri penghasil siderofor terhadap pertumbuhan
tanaman adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan varietas sebagai faktor
pertama dan isolat bakteri penghasil siderofor sebagai faktor kedua. Data ditata
menggunakan program Microsoft Excel 2007, kemudian dianalisis menggunakan
analisis ragam dengan program Statistical Analysis System (SAS) versi 9.1
Windows. Perlakuan yang berbeda nyata diuji lanjut dengan uji selang berganda
Duncan pada taraf nyata 5%.