EFEK EKSTRAK ETANOLIK DAUN Gynura procumbens (Lour) Merr

EFEK EKSTRAK ETANOLIK DAUN Gynura procumbens (Lour) Merr TERHADAP
PROLIFERASI SEL KANKER PAYUDARA TIKUS YANG DIINDUKSI 7,12Dimetilbenz(a)antrasen (DMBA)
ANTIPROLIFERATIVE EFFECT OF ETHANOLIC EXTRACT LEAVES OF Gynura
procumbens (Lour) Merr ON DMBA INDUCED RAT MAMMARY CARCINOMA CELL
Sri Susilowati1, Edy Meiyanto2, Sugiyanto3
Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim, Semarang1 , Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada2
INTISARI
Ekstrak etanolik daun Gynura procumbens (Lour) Merr yang diberikan pada tahap inisiasi ternyata
dapat menurunkan angka kejadian munculnya kanker payudara pada tikus betina galur Sprague Dawley
yang diinduksi 7,12-dimetilbenz(a)antrasen (DMBA). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh
ekstrak etanolik daun G. procumbens terhadap aktivitas proliferasi dari sel kanker payudara tikus tersebut.
Pengamatan aktivitas proliferasi sel kanker payudara tikus dilakukan dengan metode AgNOR.
Pengecatan AgNOR dilakukan terhadap jaringan payudara tikus yang telah diblok paraffin dan sebelumnya
difiksasi dengan formalin 10%. Aktivitas proliferasi diketahui dari nilai mAgNOR yaitu rata-rata jumlah
titik hitam dalam sel, pada pengamatan 100 sel. Penelitian ini terdiri dari 5 kelompok yaitu kontrol positif,
kontrol negatif dan 3 kelompok perlakuan. Kontrol positif merupakan jaringan kanker payudara tikus yang
diambil dari kelompok tikus yang hanya mendapat inisiator DMBA. Kontrol negatif adalah jaringan
payudara normal dari kelompok tikus yang mendapat minyak jagung sebagai pelarut DMBA. Kelompok
perlakuan merupakan jaringan kanker payudara tikus dari 3 kelompok tikus yang mendapat perlakuan
ekstrak etanolik daun
G. procumbens dengan 3 peringkat dosis masing-masing 250 mg/kg BB; 500
mg/kg BB; dan 750 mg/kg BB. Ekstrak ini diberikan sebelum dan selama inisiasi DMBA.
Hasil penelitian menunjukkan ekstrak etanolik daun G. procumbens mampu mengurangi aktivitas
proliferasi sel kanker payudara tikus karena induksi DMBA. Rata-rata nilai m AgNOR kelompok kontrol
positif adalah 2,69 + 0,42 dan kelompok kontrol negatif adalah 1,06 + 0,11, sedangkan kelompok perlakuan
ekstrak dengan tiga peringkat dosis masing-masing adalah 1,01 + 0,08 untuk dosis 250 mg/kg BB, 1,48 +
0,49 untuk dosis 500 mg/kg BB dan 1,55 + 0,49 untuk dosis 750 mg/kg BB. Dengan demikian dapat
disimpulkan bahwa ekstrak etanolik daun G. procumbens mampu menghambat pertumbuhan kanker
payudara pada model hewan percobaan (tikus) melalui penurunan aktivitas proliferasi.
ABSTRACT
Ethanolic extract leaves of Gynura procumbens (Lour) Merr could reduce tumour incident on
7,12- dimethylbenz(a)anthracene (DMBA) induced rat mammary carcinoma. The aim of this study was to
evaluate the effect of the extract on activity of tumor cells proliferation.
The activity of tumor cells proliferation was carried out with AgNOR methode. AgNOR staining
was done to paraffin embedded mammary gland tissue. The activity of tumor cells proliferation was
expressed by value AgNOR amount of black dot in cells, determined on 100 cells. This study was divided
into 5 group, positive control group, negative control group and 3 treatment groups. Positive control group
was mammary carcinoma tissues from rats were given inisiator only, DMBA. Negative control group was
normal mammary gland tissues from rats were given corn oil. Treatment groups were mammary carcinoma
tissues from rats were given ethanolic extract leaves of G. procumbens with 3 doses, 250, 500 and 750
mg/kg body weight. This extracts were given before and at the time of DMBA inisiation
The results showed of this study demonstrated that etanolic extract leaves of G. procumbens
could reduce the activity of tumor cells proliferation. Mean AgNOR positive control group was 2,69 +
0,42 and negative control group was 1,06 + 0,11, treatment group was 1,01 + 0,08 for extract dose 250
mg/kg BW, 1,48 + 0,49 for extract dose 500 mg/kg bw and 1,55 + 0,49 for extract dose 750 mg/kg BW. It
can be concluded that etanolic extract leaves of G. procumbens are capable to delay the progression of
mammary tumour in experimental animal (rat).
1
PENDAHULUAN
Kanker merupakan penyakit yang
mematikan. Menurut laporan WHO, terdapat
lebih dari 10 juta kasus kanker pertahun di
dunia. Di Amerika Serikat kanker merupakan
penyebab kematian kedua setelah penyakit
kardiovaskular. Sedangkan di Indonesia
kanker merupakan penyebab kematian ke-6
(Tjindarbumi &Mangunkusumo, 2002).
Kanker payudara termasuk jenis
kanker yang paling sering diderita kaum
wanita disamping kanker kulit dan merupakan
penyebab kematian kedua setelah kanker paru.
Dari semua kasus kanker pada wanita di
Amerika Serikat, kanker payudara menduduki
peringkat pertama (32%) dan kematian karena
kanker jenis ini mencapai 18% (King, 2000).
Sedangkan di Indonesia kanker payudara
menduduki peringkat kedua setelah kanker
leher rahim (serviks) dan kasusnya mencapai
17,77% (Tjindarbumi & Mangunkusumo,
2002).
Beberapa usaha pengobatan terhadap
kanker telah dilakukan secara intensif, yaitu
dengan
pembedahan,
kemoterapi
dan
radioterapi, namun belum mampu secara
efektif menanggulangi kanker. Meskipun
pengobatan dengan cara-cara tersebut cukup
menolong penderita kanker yang terdeteksi
dini dan belum mengalami metastasis
(Ganiswara, 1995). Kegagalan yang sering
terjadi dalam pengobatan kanker, utamanya
melalui kemoterapi, dikarenakan rendahnya
selektifitas anti kanker dan belum jelasnya
proses karsinogenesis itu sendiri. Kendala lain
yang dihadapi dalam pengobatan kanker
adalah mahalnya biaya pengobatan.
Berdasarkan hal-hal tersebut di atas,
penelitian dan pengembangan obat kanker
menjadi sangat penting untuk terus dilakukan.
Namun usaha pencegahan kanker yang
dilakukan sejak dini kiranya merupakan jalan
terbaik terhindar dari masalah - masalah yang
ditimbulkan kanker.
Upaya
penemuan
senyawa
kemopreventif dalam rangka pencegahan dan
penundaan proses karsinogenesis serta
pengurangan kanker untuk terjadi kembali,
merupakan strategi baru yang menjanjikan.
Senyawa kemopreventif dapat berupa bahan
makanan ataupun senyawa kimia baik natural
(fitokimia) atau sintetik. Upaya ini merupakan
alternatif yang mudah dan murah terhindar
dari kanker terutama bagi masyarakat dengan
resiko tinggi.
Secara empiris G. procumbens telah
digunakan untuk mengobati penyakit kanker
payudara dan kanker otak.
Disamping itu
telah pula dilakukan penelitian laboratorium
mengenai khasiat daun G. procumbens
sebagai anti kanker baik secara in vitro atau in
vivo. Secara in vitro daun G. procumbens
mempunyai efek antikarsinogenik, dengan
menghambat aktivitas sel vero dan sel
mieloma. Penelitian in vivo membuktikan
ekstrak etanolik daun G. procumbens mampu
menghambat pertumbuhan tumor paru dan
lambung pada mencit karena induksi
benzo(a)piren. Daun G. procumbens juga
terbukti
memiliki
potensi
sebagai
antimutagenik dan antiangiogenik. Ekstrak ini
juga
terbukti
mampu
menghambat
pertumbuhan tumor payudara tikus yang
diinduksi DMBA pada tahap inisiasi.
Mekanisme penghambatan ataupun
penyembuhan kanker sangatlah kompleks.
Akhir-akhir ini telah banyak penelitian yang
mengungkap
mekanisme
penghambatan
terjadinya tumor ataupun penyembuhannya,
salah
satunya
melalui
mekanisme
antiproliferasi. Dalam penelitian ini ingin
diketahui potensi dari ekstrak etanolik daun G.
procumbens sebagai antiproliferasi pada tumor
payudara tikus yang diinduksi 7,12dimetilbenz(a)antrasen (DMBA) pada tahap
inisiasi. Dengan pemberian ekstrak yang
dilakukan sejak awal yaitu sebelum dan
selama inisiasi diharapkan dapat diketahui
potensi kemopreventif dari daun G.
procumbens yang merupakan bahan alam yang
berpotensi untuk dikembangkan.
METODE PENELITIAN
Bahan : ekstrak etanolik daun G. procumbens,
CMC Na (E. Merck), DMBA (7,12dimetilbenz(a)ntrasen)
(Sigma
Chem.),
minyak jagung, Akuades, Formalin 10 %
(teknis), etanol (teknis), perak nitrat (AgNO3),
gelatin dan Asam Formiat 1%.
Hewan uji : Tikus betina galur Sprague
Dawley
Cara Penelitian :
Induksi karsinogenesis dengan DMBA dan
perlakuan dengan ekstrak etanolik daun G.
procumbens.
Tikus betina umur 1 bulan, dibagi
menjadi 5 kelompok secara random. Masingmasing kelompok terdiri dari 10 ekor tikus.
Kelompok I merupakan kelompok kontrol
positif, yang dibuat model kanker payudara
dengan pemberian DMBA dalam minyak
jagung dengan dosis 20 mg/kg BB secara
peroral sebanyak 10 kali, yaitu seminggu 2
kali selama 5 minggu pada umur 1,5 bulan.
Kelompok II-IV, yaitu kelompok perlakuan,
diberi ekstrak etanolik daun G. procumbens
dengan peringkat dosis 250 mg/kg BB, 500
mg/kg BB dan 750 mg/kg BB setiap hari
selama 14 hari sebelum inisiasi dan selama
inisiasi (pemberian DMBA). Dosis, frekuensi
dan cara pemberian DMBA sama dengan
kelompok kontrol positif. Kelompok V
merupakan kelompok kontrol negatif, tikus
umur 1,5 bulan hanya diberi minyak jagung.
Minyak jagung diberikan 10 kali, seminggu 2
kali selama 5 minggu. Tikus kelompok
kontrol positif dan negatif selama empat belas
hari sebelum inisiasi DMBA hanya mendapat
pakan kontrol.
Pengamatan perkembangan tumor
dilakukan setiap minggu selama 16 minggu
setelah inisiasi (pemberian DMBA) yang
terakhir. Pada akhir pengamatan dilakukan
nekropsi untuk mengetahui keadaan seluler
dari organ payudara yang terkena kanker
dengan pewarnaan AgNOR untuk mengetahui
aktivitas proliferasinya. Organ ini difiksasi
dengan larutan formalin 10% sebelum
dilakukan pengeblokan dengan paraffin.
Pemeriksaan aktivitas proliferasi dengan
metode AgNOR
Irisan jaringan glandula mammae dari
blok parafin setebal kurang lebih 3 µm
diproses dengan xylen untuk menghilangkan
lilinnya
(deparafinisasi).
Kemudian
didehidrasi secara bertingkat dengan etanol,
selanjutnya dicuci dengan akuades. Langkah
berikutnya irisan ini ditutup dengan larutan
pewarna AgNOR yang terdiri dari campuran
satu bagian volume 2% gelatin dalam 1%
larutan asam formiat dengan dua bagian
volume 50% larutan perak nitrat, pada
temperatur kamar di ruangan gelap selama
kurang lebih 45 menit untuk mendapatkan
hasil optimal. Sediaan kemudian dicuci
dengan akuades dan didehidrasi dalam etanol
dengan konsentrasi bertingkat dan ditutup
dengan kaca penutup menggunakan medium
sintetik.
Jumlah AgNOR tiap sel dihitung di
bawah mikroskop dengan perbesaran 1000X
dalam minyak imersi. Pada tiap sampel
dihitung minimal 100 sel (rata-rata 110 sel)
dengan 3 kali pengamatan (3 daerah lapang
pandang yang berbeda). Parameter aktivitas
proliferasi digunakan nilai AgNOR yaitu ratarata jumlah titik hitam (NOR) pada setiap sel,
yang dilakukan dengan membagi seluruh
jumlah titik hitam dalam sel yang teramati
dengan seluruh jumlah sel yang teramati
(minimal 100 sel).
Untuk pengecatan AgNOR dilakukan
di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas
Kedokteran, UGM Yogyakarta, sedangkan
pemeriksaannya dilakukan di Laboratorium
Ilmu Hayati, UGM Yogyakarta di bawah
mikroskop binokuler Olympus dengan
perbesaran 1000X, hasil direkam dengan
kamera digital Canon S-40.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Teknik pewarnaan AgNOR dapat
digunakan untuk menganalisis aktivitas
proliferasi sel tumor dan mendiagnosa tingkat
keparahan (malignancy) tumor (Lee et al.,
1999; Bankfalvi et al., 2002). Parameter
aktivitas proliferasi dalam penelitian ini dilihat
dari nilai m AgNOR, yaitu rata-rata jumlah
titik hitam (dot) dalam setiap sel (Gambar 1
dan 2) yang diamati pada minimal 100 sel.
Cara m AgNOR ini dapat digunakan untuk
menentukan tingkat aktivitas proliferasi
beberapa sampel jaringan tumor dari beberapa
organ termasuk kanker payudara (Lee et al.,
1999 ; Bankfalvi et al., 2002 ; Ghozali dan
Harijadi, 1997).
Gambar 1. Gambaran histopatologi hasil pewarnaan AgNOR dari sel normal glandula mammae kelompok kontrol
negatif (perbesaran 100x10) : contoh AgNOR (titik hitam dalam sel), terlihat rata-rata AgNOR (m
AgNOR) dari sel normal glandula mammae (acinus) adalah 1.
Gambar 2.
Gambaran histopatologi hasil pewarnaan AgNOR dari sel tumor glandula mammae kelompok kontrol
positif (perbesaran 100x10) : contoh AgNOR (titik hitam dalam sel), terlihat rata-rata AgNOR (m
AgNOR) dari sel tumor glandula mammae tikus yang diinduksi DMBA adalah antara 2-3.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa
ekstrak etanolik daun G. procumbens mampu
menurunkan aktivitas proliferasi sel-sel tumor
glandula mammae dari tikus yang diinduksi
DMBA. Pada kelompok kontrol positif kanker
(DMBA) rata-rata nilai m AgNOR adalah 2,69
+ 0,42 , sedangkan kelompok yang terkena
kanker pada perlakuan ekstrak etanolik daun
G. procumbens dosis 250 mg/kg BB adalah
1,01 + 0,08, dosis 500 mg/kg BB adalah 1,48
+ 0,49, dan dosis 750 mg/kg BB adalah 1,55 +
0,49. Penurunan nilai m AgNOR pada semua
kelompok perlakuan ekstrak dibanding
kelompok
kontrol
positif
(DMBA)
menunjukkan
kebermaknaan
(p<0,05)
( Gambar 3).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa
ekstrak etanolik daun G. procumbens memiliki
potensi sebagai antiproliferatif karena mampu
menurunkan aktivitas proliferasi sel-sel tumor
payudara tikus karena induksi DMBA. Efek
antiproliferatif ini dapat mencegah progresi
sel-sel kanker menjadi bentuk malignant
(ganas).
Mekanisme
proliferasi
dapat
dijelaskan melalui regulasi siklus sel. Progresi
siklus sel diregulasi oleh kompleks cyclin cyclin dependent kinase (Cdk). Aktivasi
kompleks Cdk4-Cyc D, Cdk6-Cyc D, Cdk2Cyc E dan Cdk2-Cyc A, diperlukan dari fase
G1 menuju fase S. Protein tumor suppressor
retinoblastoma (pRb) merupakan protein
target yang difosforilasi oleh kompleks CdkCyc ini sehingga mampu melepaskan factor
transkripsi E2F yang berperan untuk
proliferasi sel. Cyclin-dependent kinase
inhibitor (CKI) merupakan protein yang
mampu menginaktivasi kompleks Cdk-cyclin.
Protein yang termasuk dalam golongan CKI
adalah p21, p27, p57 serta INK4.
Penghambatan proliferasi melalui penundaan
siklus sel dapat terjadi dengan adanya
penghambatan aktivitas kinase (aktivitas Cdk)
oleh CAK (Cdk activating kinase), penurunan
ekspresi cyclin atau peningkatan ekspresi CKI.
Efek antiproliferatif dari beberapa
senyawa yang berpotensi antikanker salah
satunya diketahui melalui kemampuannya
dalam menunda siklus sel. Beberapa flavonoid
seperti apigenin, genistein dan quercetin
dilaporkan mampu menginduksi G2/M arrest
pada beberapa cell line (Lepley et al., 1996 cit
Pan et al., 2002). Sedangkan beberapa
flavonoid yang lain juga dapat menginduksi
G1 arrest (Matsukawa et al., 1993 cit Pan et
al., 2002).
Pan et al., (2002) melaporkan bahwa
polimetoksi flavonoid (tangeretin) yang
terdapat pada kulit jeruk, dapat menginduksi
G1 arrest dengan adanya peningkatan ekspresi
Cdk inhibitors seperti p27, p21 pada colon
cacer cell line (COLO 205). Protein p21 dan
p27 merupakan anggota Cip/Kip protein yang
dapat membentuk trimer dengan kompleks
Cyc D-Cdk (holoenzim). Trimer dengan
holoenzim akan mengakibatkan holoenzim ini
tidak dapat memphosphorilasi pRb, sehingga
sel akan arrest pada G1. Tangeretin juga telah
terbukti dapat menginhibisi Cdk 4 dan 6,
menekan ekspresi Cyc A, Cyc D1 dan Cyc E
serta meningkatkan level p53 pada sel COLO
205. Protein p53 merupakan regulator yang
dapat memacu ekspresi p21, sehingga dapat
menyebabkan cell cycle arrest pada G1 (Guo
and Hay, 1999).
aktivitas proliferasi
rata-rata nilai m AgNOR
3
2.687
2.5
2
1.48 1.554
1.5
1.015
1.058
1
0.5
0
Kontrol
Ekstrak
Ekstrak
Ekstrak
Kontrol
B
B
positif (DMBA)
Gynura 250
Gynura 500
Gynura 750
negatif (corn oil)
Gambar 3. Efek ekstrak etanolik daun G. procumbens terhadap aktivitas proliferasi sel-sel tumor payudara tikus
yang diinduksi DMBA
A
C
B
D
Gambar 4. Gambaran histopatologi hasil pewarnaan AgNOR dari sel-sel tumor glandula mammae (A) kontrol positif (DMBA), m
AgNOR=2,96 ; (B) perlakuan ekstrak etanolik daun G. procumbens dosis 250 mg/kg BB, m AgNOR=1,01 ; (C) dosis
500 mg/kg BB, m AgNOR=1,48 ; (D) dosis 750 mg/kg BB, m AgNOR=1,55 (perbesaran 100x10): contoh AgNOR
(NOR yang bersifat argyrofilik, terlihat sebagai titik hitam di dalam sel)
Seperti diketahui ekstrak etanolik
daun G. procumbens memiliki kandungan
kimia flavonoid, sterol tak jenuh, triterpen,
polifenol, tanin, saponin dan minyak atsiri
(Sudarto dan Pramono, 1985), sedangkan
senyawa aktif yang berpotensi sebagai
antikarsinogenik adalah flavonoid yang
mengarah ke golongan flavon/flavonol
(Sugiyanto et al., 2003). Kemungkinan
mekanisme aksi antiproliferatif dari ekstrak
tersebut sama dengan mekanisme penundaan
siklus sel oleh tangeretin. Senyawa flavonoid
dalam ekstrak etanolik daun G. procumbens
dimungkinkan mampu meningkatkan CKI
seperti p21, p27 atau p57, menginhibisi Cdk,
menekan ekspresi cyclin atau meningkatkan
level p53 sehingga terjadi cell cycle arrest dan
pertumbuhan sel tumor pun dapat dihambat.
Perlu
dilakukan
uji
khusus
untuk
membuktikan hal ini.
KESIMPULAN
Ekstrak etanolik daun G. procumbens
yang diberikan pada tahap inisiasi mampu
menurunkan aktivitas proliferasi dari sel
kanker payudara tikus yang diinduksi DMBA.
SARAN
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
untuk mengeksplorasi mekanisme molekuler
yang mungkin terjadi dari senyawa yang
berpotensi sebagai antiproliferatif tersebut.
UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan terima kasih ditujukan kepada
Program Penelitian Hibah Bersaing periode
2002-2004 yang telah memberikan dukungan
dana untuk penelitian ini, Dr. Edy Meiyanto,
MSi, Apt dan Prof. Dr. Sugiyanto, SU, Apt
yang telah membimbing dalam penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Bankfalvi A., Giuffre G., Öfner D., Diallo R.,
Poremba C., Buchwalow I. B., Barresi
V., Bocker W., and Tuccari G., 2002,
Relationship between HER2 status and
proliferation rate in breast cancer assessed
by immunohistochemistry, fluorescence in
situ hybridisation and standardised
AgNOR analysis, International J. Of
Oncol. 23: 1285-1292
Ganiswara, S. G., 1995, Farmakologi dan Terapi,
Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran
Universitas Indonesia, Jakarta : 686-687
Ghozali, A. dan Harijadi, 1997, Pewarnaan
nucleolar organizer region (AgNOR) pada
perubahan fibrokistik payudara, Berkala
Ilmu Kedokteran, Vol. 29, No. 2 : 47-52
Guo, M., Hay, B. A., 1999, Cell Proliferation and
Apoptosis, Current Opinion in Cell Biol.
11: 745-752
King, R. J. B., 2000, Cancer Biology, 2nd ed,
Pearson Eduation Limited, London
Lee, Y-C., Chern, J-H., Pan, C-C., Chang, S-C.,
Perng, R-P., 1999, Argyrophilic Nucleolar
Organizer Regions in Cells of Thymoma
and Thymic Carcinoma “Correlation with
DNA Ploidy and Clinicopathologic
Characteristic “ ,Chest 115: 1115-1119
Pan, M. H., Chen, W. J., Shiau, S.Y.L., Ho, C.T.,
Lin, J.K., 2002, Tangeretin Induces Cell
Cycle G1 Arrest through Inhibiting
Cyclin Dependent Kinases 2 and 4
Activities as well as Elevating Cdk
Inhibitor p21 and p27 in Human
Colorectal
Carcinoma
Cell,
Carcinogenesis, vol. 23: 1677-1684
Sudarto, B., dan Pramono, S., 1985, Skrining
Fitokimia
Daun
Dewa
(Gynura
procumbens, Luor Merr yang diduga
berkhasiat sebagai anti-kanker, PPPTUGM, Lembaga Penelitian UGM,
Yogyakarta
Sugiyanto, Sudarto, B., Meiyanto, E., Nugroho, A.
E., Jenie, U. A., 2003, Aktivitas
Antikarsinogenik Senyawa yang Berasal
dari Tumbuhan, Majalah Farmasi
Indonesia, 14 (4) : 216-225
Tjindarbumi, D., and Mangunkusumo, R., 2002,
Cancer in Indonesia, Present and Future,
Jpn J Clin Oncol : 32 (Supplement 1):
S17-S21