Aktivitas Reduksi Nitrat Dan Kinetika Bakteri

PEMBAHASAN
Pangamatan morfologi sel menunjukkan bentuk sel batang, dan ada yang
bulat. Sementara koloni bervariasi dari bentuk, tepian, elevasi dan warna. Hasil
pewarnaan gram menunjukan bahwa ada isolat yang bersifat gram negatif dan
ada juga yang bersifat Gram positif. Holt et al. (1994) mengemukakan bahwa
kelompok bakteri denitrifikasi pada umumnya bersifar gram negatif, berbentuk
bulat atau batang.
Berdasarkan uji fermentasi glukosa semua isolat adalah bersifat non
fermentatif karena tidak merubah substrat yang berwarna ungu menjadi kuning.
Hal ini dikarenakan ketidakmampuan bakteri tersebut memproduksi asam pada
media yang mengadung glukosa dalam kondisi anaerob hingga tidak terjadi
perubahan warna. Sementara bakteri fermentatif dalam kondisi anaerob
melakukan fosforilasi tingkat substrat dan menghasilkan asam organik. Asam
organik menyebabkan pH media lebih rendah dan merubah warna brom cressol
purple menjadi kuning. Rusmana dan Nedwell (2004) melaporkan bahwa proses
denitrifikasi dilakukan oleh mikroorganisme dengan tipe metabolisme respirasi
dan reduksi nitrat menjadi amonium dissimilatif (DNRA) dilakukan oleh
kelompok bakteri dengan tipe metabolisme fermentatif.
Lebih lanjut White (2000) menyatakan bahwa proses fermentasi
memperoleh energi melalui fosforilasi tingkat substrat yang terjadi di sitosol
menggunakan bahan organik seperti glukosa, asetat dan laktat sebagai penerima
elektron dan sumber karbon. Sedangkan respirasi anaerob memperoleh energi
melalui fosforilasi oksidatif pada membran sel menggunakan senyawa anorganik
seperti nitrat, sulfat atau fumarat sebagai penerima elektron terakhir pengganti
oksigen.
Pertumbuhan isolat HNF5, LNF, NFR1 dan NFR4 pada uji pendahuluan
dengan kondisi saturasi udara berbeda memperlihatkan pola yang sama yaitu
semakin tinggi konsentrasi oksigen semakin baik pertumbuhannya. Hal ini dapat
dilihat dari nilai Optical Density (OD). Pertumbuhan paling tinggi terjadi pada
udara saturasi 100% sedangkan pertumbuhan paling rendah terlihat pada udara
saturasi 0%. Dari keempat isolat yang diuji pertumbuhan paling tinggi adalah
30
NFR4, berarti isolat ini paling mampu beradaptasi dengan faktor lingkungan yang
ada walaupun kurang responsif terhadap perubahan konsentrasi udara saturasi.
NFR1 memiliki pertumbuhan yang baik dan rensponsif terhadap perubahan udara
saturasi. Isolat HNF5 dan LNF kurang baik pertumbuhannya dan kurang responsif
terhadap perubahan konsentrasi udara saturasi. Isolat NFR1 memperlihatkan
pertumbuhan berbeda pada konsentrasi oksigen berbeda.
Pada kadar oksigen rendah proses penguraian bahan organik lambat.
Respirasi aerobik dengan oksigen sebagai akseptor elektron menghasilkan energi
yang tinggi. Energi tinggi memacu pertumbuhan lebih cepat (Maier et al. 2000).
Pada isolat terpilih NFR1dan NFR4 Pertumbuhan paling cepat terjadi pada udara
saturasi 100%, dan paling lambat terjadi pada udara saturasi 1%. Perbedaan jelas
terlihat pada isolat NFR1. Pada Isolat NFR4 walaupun pertumbuhan tidak besar
perbedaannya tapi pada udara saturasi 100% sel masih terus tumbuh sampai akhir
masa inkubasi. Diasumsikan walaupun isolat NFR1 dan NFR4 sama-sama
anaerob fakultatif tetapi Isolat NFR1 menyukai lebih banyak oksigen dalam
respirasinya. Terbukti pada saat konsentrasi oksigen rendah pertumbuhan menjadi
lambat. Pada isolat NFR4 oksigen yang diperlukan sedikit, terlihat dari
pertumbuhan yang hampir sama pada konsentrasi oksigan rendah maupun tinggi.
Keberadaan akseptor elektron selain oksigen seperti nitrat, menimbulkan
pengaruh terhadap jalur metabolisme oksidatif. Nitrat dapat dimanfaatkan sebagai
akseptor elektron alternatif walaupun dalam kondisi aerobik (Carter et al. 1995).
Medium yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri denitifikasi
mengandung asetat sebagai sumber karbon dan nitrat sebagai penerima elektron
terakhir. Menurut Teixera dan Olivera (2002), bakteri pereduksi nitrat heterotrof
dapat hidup menggunakan senyawa organik sebagai sumber karbon misalnya
asam asetat, asam propionat, asam benzoat, gliserol, metanol dan glukosa.
Sedangkan nitrat digunakan sebagai alternatif penerima elektron terakhir dalam
keadaan anaerob (Richardson 2000).
Oksidasi molekul glukosa pada sistem metabolisme aerob akan berlangsung
melalui lintasan glikolisis dan dilanjutkan dengan oksidasi piruvat menjadi CO2
melalui siklus TCA. Gliserol akan masuk ke dalam lintasan glikolisis melalui
pembentukan gliseraldehida-3-fosfat. Sedangkan asetat akan masuk ke dalam
31
siklus TCA setelah diubah menjadi asetil-CoA (Prescott et al. 2000). Oksidasi
akan menghasilkan ATP, NADH, dan FADH2. Perolehan energi yang lebih
banyak akan mendukung pertumbuhan sel. Semakin banyak Oksigen sebagai
akseptor elektron dari donor maka proses oksidasi akan lebih cepat sehingga
pertumbuhan akan lebih cepat.
Aktivitas dan kecepatan isolat dalam mereduksi nitrat berbanding lurus
dengan tingkat laju pertumbuhannya. Pertumbuhan isolat pada media sangat
tergantung pada kemampuan beradaptasi dengan lingkungan. Faktor nutrien dan
kemampuan kompetisi yang rendah dapat menghambat proses adaptasi tersebut.
Setelah 96 jam waktu inkubasi pada uji reduksi nitrat untuk seleksi isolat
terlihat Isolat HNF 5 dan LNF memiliki kemampuan yang hampir sama, dimana
nitrat yang tereduksi hampir 100% (49,42 mm) untuk semua konsentrasi udara
saturasi. Pada Isolat NFR1 dan NFR4 nitrat yang direduksi lebih sedikit, tetapi
terlihat perbedaan aktivitas reduksi nitrat pada saturasi udara berbeda.
Perbedaan kemampuan
mereduksi nitrat pada semua isolat terkoleksi
disebabkan oleh perbedaan aktivitas dari masing- masing isolat. Kemampuan
isolat dalam mereduksi nitrat ditunjukkan oleh penurunan konsentrasi senyawa
nitrat dalam medium pertumbuhan. Penurunan senyawa nitrat diduga disebabkan
penggunaan nitrat sebagai akseptor elektron alternatif pengganti oksigen dalam
rantai respirasi pada kondisi oksigen terbatas. Bakteri denitrifikasi dapat
menggunakan nitrat, nitrit, nitrit oksida atau nitrous oksida sebagai penerima
elektron terakhir alternatif untuk mendapatkan energi (Richardson 2000).
Kemampuan isolat NFR1 mereduksi nitrat tidak terlalu tinggi dibanding
isolat lain tetapi isolat NFR1 lebih responsif terhadap perbedaan konsentrasi udara
saturasi. Isolat NFR4 memiliki pertumbuhan paling baik, kemampuan mereduksi
nitratnya tinggi dan responsif terhadap perbedaan konsentrasi oksigen. Hal ini
dapat dilihat pertumbuhan dan aktivitas reduksi nitrat yang berbeda pada saturasi
udara berbeda. Isolat HNF5 dan LNF mempunyai kemampuan mereduksi nitrat
yang tinggi tetapi tidak responsif terhadap perbedaan konsentrasi oksigen.
Perbedaan kemampuan mereduksi nitrat pada semua isolat disebabkan oleh
adanya perbedaan aktivitas masing-masing isolat. Selain itu perbedaan kadar
nitrat yang direduksi pada masing-masing isolat menunjukkan banyaknya elektron
32
yang dapat diperoleh pada oksidasi senyawa karbon yang tersedia dalam medium
karena kelompok bakteri ini menggunakan nitrat sebagai penerima elektron
terakhir pada kondisi anaerob. Elektron yang diperoleh dari oksidasi senyawa
karbon tersimpan pada molekul NADH dan FADH2 yang berperan sebagai donor
elektron pada rantai respirasi (Madigan et al. 2009; White 2000).
Pada isolat NFR1 akumulasi nitrit terjadi fluktuatif selama inkubasi
sedangkan pada isolat NFR4 akumulasi nitrit tertinggi pada jam ke 12. Menurut
Balszcyk (1993) akumulasi nitrit dapat disebabkan oleh kompetisi penggunaan
nitrat sebagai akseptor elektron, adanya penghambatan nitrit reduktase karena
okumulasi NO. Tidak seimbangnya reaksi reduksi untuk katalisasi nitrat dan nitrit
olah enzim reduktase serta terlambatnya induksi nitrit reduktase dibanding nitrat
reduktase diperkirakan dapat juga menyebabkan akumulasi nitrit. Pada medium
minimal induksi nitrat reduktase lebih awal sedangkan induksi nitrit reduktase
terlambat untuk beberapa jam sampai beberapa hari. Penghambatan nitrit oksida
reduktase oleh nitrat karena nitrat lebih kompetitif sebagai akseptor elektron
dibanding nitrit
Pada Isolat NFR4 akumulasi nitrit terlihat pada 12 jam waktu inkubasi dan
mulai menurun pada jam ke 24 dan akhirnya habis. Diperkirakan pada isolat ini
nirit segera direduksi menjadi gas NO, N2O atau N2. Pada kondisi oksigen terbatas
kelompok bakteri denitrifikasi akan aktif mereduksi nitrat menjadi nitrit, nitrit
oksida, nitrous oksida dan dinitrogen (Paul dan Clark 1996). Bakteri denitrifikasi
lebih kompetitif hidup dilingkungan oksigen rendah, tetapi ada juga beberapa
proses denitrifikasi berlangsung aerobik (Hallin dan Lindren 1999; Zumf 1999).
Dari uji terlihat pada kedua isolat nitrit terbanyak dihasilkan pada konsentrasi
udara saturasi 1% dan yang paling sedikit dihasilkan pada udara saturasi 100%.
Reduksi nitrat pada bakteri denitrifikasi melibatkan beberapa tahap reaksi
yang dikatalis enzim. Terdapat dua enzim yang mengkatalis tahap pertama tahap
reduksi nitrat menjadi nitrit, yaitu periplasmic nitrate reductase (Nap) dan
membrane-bound nitrate reductase (Nar). Patureu et al. (1994) menjelaskan
bahwa beberapa bakteri denitrifikasi dapat menggunakan senyawa nitrat dengan
aktivitas enzim Nap melalui denitrifikasi aerobik maupun anaerobik. Aktivitas
enzim Nar berhubungan langsung dengan proses respirasi pembentukan ATP,
33
sedangkan
enzim Nap tidak langsung. Ekspresi gen nar dipengaruhi oleh
ketersediaan oksigen dan nitrit sedangkan untuk gen nap tidak (Moreno-Vivian et
al. 1999).
Jenis enzim yang mengkatalis reduksi nitrit menjadi nitrit oksida yaitu
cytochrome cd1 nitrate reductase (NirS) dan copper nitrite reductase (NirK).
Reaksi perubahan nitrit oksida menjadi nitrous oksida dikatalis enzim nitric oxide
reductase (Nor) dan nitrous oksida menjadi dinitrogen dikatalis nitrous oxide
reductase (Nos) (Zumf et al.1997; Richardson 2000).
Berdasarkan hasil sekuensing 16S-rRNA yang dilakukan Marnis (2008)
isolat NFR1mempunyai kemiripan dengan Microbacterium sp (95%). Sementara
NFR4 mempunyai kemiripan dengan Shewanella algae (95%). Richardson (2001)
mengemukakan Microbacterium sp memiliki
gen nar yang berfungsi untuk
mereduksi senyawa nitrat dan tidak memiliki gen nos untuk mereduksi nitrous
oksida menjadi dinitrogen. Bakteri Shewanella algae memiliki gen nas dan nap
dalam melakukan aktivitas reduksi nitrat.
Pada isolat NFR1 tidak dihasilkan amonium, bahkan amonium berkurang
dibandingkan dengan media awal. Penurunan konsentrasi senyawa amonium
diduga disebabkan penggunaan amonium oleh isolat NFR1 sebagai sumber
nitrogen dan sumber energi. Penggunaan senyawa amonium sebagai sumber N
melalui proses assimilasi, dimana amonium diubah menjadi senyawa nitrogen
organik untuk sintesis material sel.
Isolat NFR4 menghasilkan amonium. Amonium tertinggi dihasilkan pada
jam ke 36 dan setelah jam ke 48 amonium berkurang dan habis. Diduga pada
bakteri ini terdapat enzim Nfr yang dapat mereduksi nitrat menjadi amonium.
Zumf (1992) mengemukakan bakteri denitrifikasi memanfaatkan senyawa nitrat
atau nitrit sebagai penerima elektron terakhir dalam proses metabolismenya.
Sebagai produk akhir dari metabolisme tersebut adalah gas nitrogen seperti nitrit
oxida, nitrous oxida atau dinitrogen, namun pada beberapa bekteri pereduksi nitrat
ada yang menghasilkan amonium. Krause dan Nealson (1997) menambahkan
bahwa pada Shewanella reduksi nitrat ke amonium merupakan fisiologi tambahan.
Bila bakteri ini berada pada potensial redoks yang tinggi menggunakan glukosa
sebagai sumber karbon Shewanella putrefacien dapat mereduksi nitrat menjadi
34
amonium (Samuelsson 1985; Samuelsson 1988). Amonium semakin berkurang
diduga karena dimanfaatkan oleh bakteri untuk pertumbuhan dan membangun
struktur sel (Maier 2000). Amonium tertinggi dihasilkan pada konsentrasi udara
saturasi 1% dan terendah pada konsentrasi udara saturasi 100%. Diduga walaupun
enzim Nfr tidak langsung dipengaruhi oleh konsentrasi oksigen tetapi hasil
reduksi sebelumnya oleh enzim Nar dan Nap menyebabkan pada konsentrasi
amonium juga ikut terpengaruh. Pada isolat ini konsentrasi udara saturasi yang
rendah menyebabkan gen nfr mengekspresikan enzim Nfr yang umumnya dimiliki
oleh bakteri DNRA
Sistem metabolisme tiap isolat sangat beragam. Hal ini terlihat dari
kemampuan bakteri dalam menghasilkan gas. Banyaknya gas yang dihasilkan
berbanding terbalik dengan nitrit dan amonium. Semakin banyak amonium dan
nitrit yang terbentuk berarti akan makin sedikit gas yang dihasilkan, begitu pula
sebaliknya. Semua isolat denitrifikasi yang diujikan menghasilkan gas pada
aktivitas reduksi nitrat. Widiyanto (2006) menyatakan kemampuan masingmasing isolat denitrifikasi mempunyai spesifikasi yang berbeda dalam mereduksi
senyawa nitrat dan memproduksi gas nitrogen. Denitrifikasi adalah merupakan
proses perubahan nitrat menjadi nitrous oksida dan gas nitrogen pada kondisi
oksigen yang terbatas (Richardson 2000; Moreno-Vivian et al.1999). Banyak dan
macam gas yang dihasilkan tergantung kepada kelengkapan enzim yang dimiliki
bakteri tersebut serta faktor lingkungan yang turut mempengaruhinya.
Rumana (2003a) telah mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri-bakteri
dari sedimen estuari
yang memiliki metabolisme berbeda. Comomonas
testosteroni mampu mereduksi nitrat menjadi N2, Shewanella putrefacien
mereduksi nitrat hanya sampai N2O, berarti tidak mempunyai gen nos yang
berperan dalam mereduksi N2O menjadi N2. Hal ini menunjukkan kemungkinan
isolat perlakuan memiliki produk akhir berupa N2O.
Walaupun NFR1 dan NFR4 diperkirakan menghasilkan N2O tetapi jumlah
dan perbandingannya dengan gas lain dipengaruhi berbagai faktor antara lain
bahan organik, suhu dan oksigen. Enzim nitrat dan nitrit reduktase hanya
diekspresikan ketika konsentrasi oksigen tidak lebih tinggi dari 2,5-5% yang mana
Nitrous oksida reduktase diekspresikan ketika O2 tidak lebih tinggi dari 5%
35
(Korner dan Zumf 1989). Kester (1997) berdasarkan percobaannya dengan bakteri
denitrifikasi Alcaligenes eutropus dan Pseudomonas stutzeri menggunakan
medium asetat pada konsentrasi udara saturasi 0%,1%, 5%,10% dan 80%
menyatakan NO2, NO, N2O terbanyak ditemukan pada konsentrasi udara saturasi
0%.
Enzim-enzim pada proses reduksi nitrat paling aktif dibawah kondisi
anaerobik walaupun beberapa organisme diketahui melakukan respirasi O2
dan denitrifikasi secara bersamaan (McKenney 2001). Hernandes (1998)
menambahkan oksigen menghambat reduksi nitrat dan dinitrogen melalui tiga
tingkatan, yaitu dengan menekan sintesis sistem enzim yang mengkatalis reduksi
nitrat, mengganggu kerja sistem enzim pada bakteri dan mengalihkan aliran
elektron dari satu sistem respirasi (nitrat) ke yang lainya (oksigen).
Isolat NFR4 mereduksi nitrat lebih lambat dari NFR1. Isolat NFR4 diisolasi
oleh Marnis (2008) dari medium dengan konsentrasi nitrat rendah. Isolat NFR4
memiliki kemiripan dengan Shewanella algae diduga memiliki gen nap yang
mengekspresikan enzim Nap. Enzim Nap lebih kompetitif pada nitrat yang
rendah, dan tidak dipengaruhi oleh kehadiran oksigen sehingga dalam aktivitas
reduksi nitrat perbedaan konsentrasi oksigen tidak terlalu berpengaruh nyata. Nap
aktif dalam konsisi aerob dan anaerob. Enzim ini tidak langsung berhubungan
dengan proton motion force (PMF). Beberapa bakteri menggunakan Nap pada
respirasi aerobik untuk mendukung pertumbuhan dan Nap berfungsi untuk
menyeimbangkan reaksi redoks untuk pertumbuhan yang optimal (Moreno-Vivian
1999; Rusmana 2003a). Denitrifikasi aerobik sangat penting pada organisma yang
hidup pada lingkungan mikroaerobik atau pada lingkungan yang cepat berubah
antara aerobik dan anaerobik. Nap memegang peranan penting untuk beradaptasi
pada kondisi anaerobik dari kondisi aerobik dan mencegah akumulasi nitrit tinggi
yang dapat menghambat pertumbuhan (Zumf 1997; Richardson et al. 2001).
Isolat NFR1 yang diisolasi dari medium dengan konsentrasi nitrat tinggi
(Marnis 2008), diduga memiliki enzim Nar. Nar lebih komptitif pada konsentrasi
nitrat yang tinggi dan dipengaruhi oleh keberadaan oksigen sehingga perbedaan
konsentrasi oksigen perpengaruh terhadap aktivitas reduksi nitrat isolat ini.
Kecepatan reduksi nitrat setiap sel tinggi pada konsentrasi oksigen rendah dan
36
lambat pada konsentrasi oksigen tinggi. Hal ini disebabkan pada konsentrasi
oksigen rendah nitrat digunakan sebagai akseptor elektron untuk menghasilkan
energi. Enzim Nar membangkitkan PMF melalui membran yang diikuti sintesis
ATP. Enzim Nar disintesis selama pertumbuhan anaerobik melalui protein Fnr
pada lingkungan yang mengandung nitrat dan nitrit. Pada kondisi anoksik Fnr
mengikat ke DNA dan mengaktivasi transkripsi nar dan gen-gen lain untuk
metabolisme anaerobik. Pada kondisi aerobik [4Fe-2S]2+ dikonversi menjadi [3Fe2S]2+ atau
[2Fe-2S]2+ sehingga Fnr tidak aktif (Moreno-vivian et al. 1999;
Richardson et al. 2001).