BAB V. KESIMPULAN, SARAN DAN RINGKASAN V.1

BAB V. KESIMPULAN, SARAN DAN RINGKASAN
V.1. Kesimpulan
1. Frekuensi genotip AA pada individu dengan riwayat keluarga DMT2 lebih
tinggi daripada individu tanpa riwayat keluarga DMT2.
2. Frekuensi alel A pada individu dengan riwayat keluarga DMT2lebih tinggi
daripada individu tanpa riwayat keluarga DMT2.
3. Risiko untuk mendapatkan alel A pada individu denganriwayat keluarga
DMT2 lebih tinggi dibandingkan individu tanpa riwayat keluarga DMT2.
4. HOMA-β genotip AA lebih rendah dibandingkan genotip GA dan GG pada
subyek penelitian.
V.2. Saran
1. Diberikan edukasi tentang risiko terjadinya DMT2 pada subyekterutama bagi
individu pembawa genotip AA dan alel A pada penelitian ini.
2. Disarankan pada individu pembawa genotip AA dan alel A pada penelitian ini
untuk selalu melakukan pemeriksaan kondisi kesehatan (Checkup).
3. Dilakukan penelitian kohort terhadap individu pembawa genotip AA dan alel
A.
4. Dilakukan penelitian lebih lanjut polimorfisme E23K gen KCNJ11pada
individu dengan riwayat dan tanpa riwayat keluarga DMT2pada sampel yang
mewakili seluruh daerah di Indonesia.
49
V.3. Ringkasan
V.3.1.Latar Belakang
Diabetes melitus tipe 2 (DMT2) merupakan penyakit multifaktorial yang
melibatkan faktor genetik dan lingkungan (Weberet al., 2012). Berdasarkan
patogenesisnya, DM dibagi menjadi 4 tipe, dengan tipe tersering adalah DMT2
(90-95%), yaitu DM yang ditandai dengan resistensi dan defisiensi insulin relatif
atau defek sekresi insulin (ADA, 2012). Menurut data World Health Organization
(WHO)penderita DM pada tahun 2011 sekitar 346 juta diseluruh dunia dan
meningkat menjadi 438 juta pada tahun 2030. Penderita DMdi Indonesia pada
tahun 2000 mencapai 8,4 juta dan akan meningkat sekitar 21,3 juta pada tahun
2030 (Wild et al., 2004). Hasil Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) (2013)
didapatkan prevalensi DM tertinggi di provinsi Yogyakarta(2,6%) dan terendah di
Lampung (0,7%) (Kemenkes, 2013).
Gen potassium inwardly-rectifying chanel sub family J member 11
(KCNJ11)merupakan gen penyusun kanal ion K+ yang sensitif terhadap ATP
(kanal KATP) dan berperan dalam pengaturan sekresi insulin dari sel β pankreas
(Riedel et al., 2003). Stimulus sekresi insulin pada sel β pankreas yaitu (a) ketika
glukosa ekstraseluler rendah maka kanal KATP terbuka dan metabolisme glukosa
pada sel β pankreas menurun sehingga membran sel mengalami hiperpolarisasi.
Hiperpolarisasi menjaga pintu kanal ion voltageCa2+tertutup agar Ca2+ yang
masuk tetap rendah dan sekresi insulin dihambat; (b) sebaliknya ketika glukosa
ekstraseluler tinggi, metabolisme glukosa pada sel β pankreas menghasilkan ATP
dalam jumlah besar dan diikuti MgADP yang rendah memicu kanal KATP tertutup
sehingga menyebabkan depolarisasi membran, kanal ion Ca2+terbuka daninflux
Ca2+ yang tinggi menyebabkan insulin disekresikan ke ekstrasel(Proks and
Ashcroft, 2008).
Polimorfisme adalah terdapatnya alel dengan frekuensi lebih dari 1% pada
populasi umum (Nussbaumet al., 2004). Salah satu polimorfisme yang berperan
dalam patofisiologi DMT2 adalah E23K gen KCNJ11 yang menyebabkan
subsitusi guanin (G) menjadi adenin (A) sehingga ada perubahan asam amino
glutamat (GAG) menjadi lisin (AAG) (Li, 2013).Individu pembawa alel A dengan
riwayat keluarga DMT2 berisiko menderita DMT2.Polimorfisme E23K gen
KCNJ11merupakan faktor risikoDMT2 (Abed et al., 2013).Polimorfisme E23K
gen KCNJ11mempengaruhi kanal gating kanal KATP dengan menurunkan waktu
penutupan kanal sehingga meningkatkan aktivitas kanal KATP (Schwanstecheret
al., 2002). Peningkatan aktivitas kanal KATPmenimbulkan gangguan sekresi
insulin (Kosteret al., 2005; Vilarealet al., 2009).
Tujuan penelitian ini untuk mengetahui polimorfisme E23K gen KCNJ11
dan sekresi insulin pada individu dengan riwayat keluarga (DRK) dan tanpa
riwayat keluarga (TRK) DMT2.
V.3.2. Tinjauan Pustaka
Diabetes melitus tipe 2 merupakan penyakit multifaktorial dengan
komponen genetik, lingkungan dan perilaku kesehatan (Weber et al.,
2012).Penyakit dengan pola pewarisan disebabkan oleh kelainan genetik yang
diturunkan dari orang tua kepada anaknya sebagai akumulasi dari berbagai jenis
mutasi yang terjadi pada deoxyribonucleic acid (DNA)(Bener et al.,2013).
Pengetahuan faktor genetik diharapkan dapat mencegah DMT2 secara dini pada
setiap individu (Florez et al., 2007). KasusDMberisiko 4 kali lipat menderita DM
(Harrison et al., 2003: Elbein, 2009).
Sel β pankreas mensekresi insulin akibat stimulasi glukosa. Fase 1 terjadi
3-10 menit pertama setelah makan. Insulin yang disekresi merupakan insulin sel β
pankreas. Fase 2 sekresi insulin dimulai 20 menit akibat stimulasi glukosa dan
berlangsung sampai 2 jam sebagai insulin yang baru disintesis (Baynes &
Domoniczak, 2007). Pada fase 1 glukosa meningkatkan sekresi insulinuntuk
pencegahan kenaikan kadar glukosa darah yang akan merangsang fase 2
memproduksi insulin lebih tinggi. Semakin tinggi kadar glukosa darah maka
semakin tinggi kebutuhan kadar insulin, kemampuan ini terbatas pada kadar
glukosa darahnormal (Thevenod, 2008).
Polimorfisme adalah terdapatnya alel dengan frekuensi lebih dari 1% pada
populasi umum (Nussbaum et al., 2004). Salah satu polimorfisme adalah E23K
gen KCNJ11 yang terletak pada lengan pendek kromosom 11 (11p15.1),
mempunyai 1 ekson dengan 2000 basa (2kb) dan tidak memiliki intron. Gen
KCNJ11 mengkode sebuah protein dengan 390 asam amino dan 2 segmen
transmembran (Genetics Home Reference/ GHR,2013). Gen KCNJ11 berperan
dalam pengaturan fisiologis homeostasis glukosa dengan mengatur sekresi insulin
dari sel β pankreas, di samping stimulus dari glukosa dan voltage dependent
Ca2+kanal ion (Riedel et al., 2003; Li, 2012). Peningkatan aktivitas kanal
KATPmenimbulkan gangguan sekresi insulin (Koster et al., 2005; Vilareal et al.,
2009).
V.3.3. Metode Penelitian
Penelitian ini menggunakan rancangan penelitian kasus kontrol. Seluruh
prosedur penelitian, telah mendapatkan rekomendasi dan persetujuan dari Komisi
Etik Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada.
Subjek penelitian adalah 34kasus yang direkrut dari keluarga pasien
DMT2 di Klinik Diabetes Poliklinik Penyakit Dalam RSUP. dr. Sardjito
Yogyakarta dan 34 kontrol yang direkrut dari civitas akademika dan mahasiswa
FK UGM. Kasus memenuhi kriteria inklusi yaitu laki-laki atau wanita tampak
sehat dengan usia antara 19-39 tahun, mempunyai keluarga menderita DMT2
(ayah/ibu-kakek/nenek), sedangkan kontrol tidak mempunyai keluarga menderita
DMT2 (ayah/ibu-kakek/nenek)dan bersedia menjadi subjek penelitian. Kriteria
eksklusi yaitu terdeteksi DM dengan kadar glukosa darah puasa (GDP) ≥ 126
2
mg/dL, obesitas (IMT ≥ 25 kg/m ), hipertensi (tekanan darah (TD) sistolik ≥140
mmHg, tekanan darah (TD) diastolik ≥90 mmHg) dan hamil.
Kadar GDP dianalisis dengan spektrofotometri metode glucose oxydase-pamino phenazone (GOD-PAP)dan kadar insulin puasa dengan enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) dari DRG International, Inc. USA (EIA-2935)
(nilai normal kadar insulin puasa2-25 μIU/mL). Sekresi Insulin diketahui dengan
menggunakan Homeostatic model asessment β (HOMA-β) sebagai model untuk
mengukur fungsi sel β pankreas. Nilai normal HOMA-β ≥ 107%(Ciampelli et al.,
2005), Rumus perhitungan HOMA-β (Tabara et al.,2011):
−
360
(%) =
ℎ
− 63
Isolasi DNA menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit
Promega. Polimorfisme E23K gen KCNJ11 dianalisis dengan polymerase chain
reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP).Amplifikasi
fragmen DNA yang mengapit posisi kodon E23K genKCNJ11 dengan
primer:forward primers 5'-CCA CCG AGA GGA CTC TGC A-3' dan reverse
primers 5'-CTG GCG GGC ACG GTA CCT-3'. PCR reaksi 30 µL yang terdiri
dari: 2 µL DNA, 15 µLmaster mix PCR (2x buffer PCR, 150 mM dNTP, dan 0,5
U Taq DNA polymerase), 2 µL primer (1 µLprimer forward dan 1 µLprimer
reverse) dan 11 µL aquades.
Kondisi temperature siklus PCR:(1) Denaturasi awal selama 7 menit pada
suhu 94oC, dilanjutkan 35 siklus PCR: (2) denaturasi pada 94oC 1 menit; (3)
annealing pada 63oC 1 menit; (4) extension pada 72oC 1 menit; (5) final extension
7 menit pada suhu 72oC; (6) cooling sampai 4oC. PCR running selama 2 jam 16
menit.
Pemotongan produk PCR dengan enzim restriksi (RFLP):Produk PCR
sebanyak 4 µL ditambah 1,0 µL NE buffer, 0.5 µL enzim Ban II(Thermo), 4,5 µL
aquades hingga volume akhir 10 µLreaction mixture. Reaction mixture diinkubasi
selama 16 jam pada 37oC dalam inkubator.Hasil reaksi dilakukan elektroforesis
dengan gel agarose3% (selama 45 menit, 100 volt) dan divisualisasi dengan
ethidium bromide. Hasil pemotongan dilihat dibawah sinar UV yaitu: genotip GG
(wild type) memiliki 1 pita (179 bp), genotip GA memiliki 3 pita (179 bp, 160 bp
dan 19 bp) dan genotip AA memiliki 2 pita (160 bp dan 19 bp).
Normalitas data diuji dengan menggunakan Saphiro-Wilkdilanjutkan uji
parametrik Independen Sampel T-test. Jika distribusi data tidak normal maka
dilakukan transformasi data, jika distribusi data tetap tidak normal maka
digunakan Mann-Whitney U-test. Perbedaan frekuensi genotip dan alel antara
kasusdan kontrol, dianalisis dengan Chi-Square test.Risiko untuk mendapatkan
alel A terhadap kasusdan kontrol dianalisis dengan uji Odds ratio. Perbedaan
HOMA-β diantara genotip AA, GA dan GG dianalisis menggunakan one way
ANOVA, dilanjutkan post hoc. Nilai p< 0,05 sebagai batas signifikansi.
V.3.4. Hasil
Tabel 2 menunjukkan karakteristik kasus(7 laki-laki dan 27 perempuan)
dankontrol(8 laki-laki dan 26 perempuan). Tidak ada perbedaan bermakna pada
distribusi jenis kelamin, usia, BB, TB, IMT, TD sistolik, TD diastolik, GDP pada
kasusdan kontrol. Kadar insulin puasa dan HOMA-β menunjukkan ada perbedaan
bermakna pada kasusdan kontrol.
Tabel 3 menunjukkan distribusi frekuensi genotippada kasus adalah
AA(41%), GA (53%) dan GG (6%), sedangkan pada kontrol adalah AA(6%), GA
(65%) dan GG (29%). Terdapat perbedaan bermakna pada distribusi frekuensi
genotipantara kasusdan kontrol (p=0,001). Distribusi frekuensi alel pada kasus
adalah A(68%) dan G (32%), sedangkan pada kontrol adalah A(38%) dan G
(62%). Terdapat perbedaan bermakna pada distribusi frekuensi alelantara
kasusdan kontrol (p=0,001). Hasil uji Odds ratio untuk mengetahui risiko genotip
AA dan GA menunjukkan hubungan bermakna pada genotip AA dan GA
antarakasusdan kontrol (p=0,011, OR 6,66, IK 95% 1,33-33,27). Begitu juga pada
alel A menunjukkan hubungan bermakna antarakasusdan kontrol (p=0,001, OR
3,38, IK 95% 1,67-6,84).
Perbedaan nilai HOMA-β pada subyek penelitian dapat dilihat pada Tabel 5.
Hasil analisisOne-Way ANOVAmenunjukkan bahwaada perbedaanbermaknanilai
HOMA-βantara individu dengan genotip AA, GA dan GG(p=0,000).Nilai
HOMA-β individu dengan genotip AA (85,44% ± 39,55) lebih rendah daripada
genotip GA (212,20% ± 79,30) dan GG (254,00% ± 61,98) pada subyek
penelitian.
V.3.4. Pembahasan
1.
Distribusi Frekuensi Genotip dan Alel Polimorfisme E23K Gen KCNJ11pada
Individu dengan Riwayat dan tanpa Riwayat Keluarga DMT2.
Frekuensi genotip dan alel polimorfisme E23K gen KCNJ11 pada individu
dengan riwayat keluarga DMT2 (kasus) dan tanpa riwayat keluarga DMT2
(kontrol) di Yogyakarta bervariasi karena didapatkan sebaran genotip yang
berbeda pada homozigot maupun heterozigot. Perbedaan penelitian ini dengan
penelitian di beberapa negara adalah pada subyek penelitian dan jumlah sampel.
Subyek penelitian ini adalah individu dengan riwayat keluarga DMT2 dan tanpa
riwayat keluarga DMT2 sedangkan subyek penelitian pada beberapa negara
adalah individu normal dan penderita DMT2. Jumlah sampel pada penelitian di
beberapa negara lebih banyak dibandingkan dengan jumlah sampel pada
penelitian ini.
Tabel 7 menunjukkan bahwa penelitian ini sama dengan penelitian di
beberapa populasi yaitu Asia Barat (Palestina, Israel), Asia Timur (Cina, Jepang),
Eropa Tengah (Cekoslowakia) dan Eropa Barat (Jerman) bahwa frekuensi genotip
AA pada penderita DMT2 lebih tinggi daripada individu normal. Dengan
demikian genotip AA banyak ditemukan di beberapa etnik yang berbeda.
2.
Polimorfisme E23K Gen KCNJ11 sebagai Faktor Risiko untuk Mendapatkan
Alel A pada Individu dengan Riwayat dan tanpa Riwayat Keluarga DMT2.
Tabel 3 menunjukkanbahwa individu dengan riwayat keluarga DMT2
(kasus) mempunyai risiko untuk mendapatkan genotip AA dan GA 6,66 kali lebih
tinggi daripada tanpa riwayat keluarga DMT2 (kontrol) (p=0,011, OR 6,66, IK
95% 1,33-33,27). Risikountuk mendapatkan alel A 3,38 kali lebih tinggi pada
kasus daripada kontrol (p=0,001, OR 3,38, IK 95% 1,67-6,84). Odds ratio
penelitian ini merupakan risiko alel A sedangkan OR pada penelitian beberapa
etnik merupakan risiko terjadinya DMT2.
Pada penelitian ini individu dikelompokkan berdasarkan adanya alel A dan
riwayat keluarga DMT2 yaitu (1) risiko rendah apabila individu tidak membawa
alel A dan tidak mempunyai riwayat keluarga DMT2; (2) risiko sedang apabila
individu tidak membawa alel A dan mempunyai riwayat keluarga DMT2 atau
individu membawa alel A dan tidak mempunyai riwayat keluarga DMT2; (3)
risiko tinggi apabila individu membawa alel A dan mempunyai riwayat keluarga
DMT2. Pada penelitian di Amerika Serikat, individu dikelompokkan hanya
berdasarkan adanya riwayat keluarga DMT2 yaitu (1) risiko rendahapabila tidak
mempunyai riwayat keluarga DMT2; (2) risiko sedang apabila salah satu orang
tua menderita DMT2 dan salah satu kakek nenek menderita DMT2 atau kakek
nenek menderita DM dari garis keturunan ibu atau ayah; (3)risiko tinggi apabila
kedua orang tua atau salah satunya menderita DMT2 dan kakek nenek dari kedua
orang tua menderita DMT2 (Tabel 9).
3.
Perbedaan HOMA-β Genotip AA, GA dan GG pada Subyek Penelitian.
Pada penelitian ini sekresi insulin diketahui dengan menggunakan HOMA-β
sebagai suatu model untuk mengukur fungsi sel β pankreas. Hasil penelitian ini
menunjukkan bahwa ada perbedaanbermaknanilai HOMA-β antara individu
dengan genotip AA, GA dan GG. Hasil penelitian ini sesuai dengan
penelitianRadha et al. (2003) bahwa faktor genetik dapat mempengaruhi
biosintesis dan sekresi insulin. Begitu juga dengan penelitian Chen et al. (2012)
yang menyatakan bahwa terjadi penurunan fungsi sel β pankreas yang ditandai
dengan rendahnya nilai HOMA-β. Penurunan sekresi insulin ini terjadi karena
abnormalitas fungsi sel β pankreas yang disebabkan beberapa faktor, antara lain
faktor genetik (Defronzo, 2008). Faktor genetik berperan penting dalam kejadian
DMT2 dalam suatu keluarga (Bener, 2013).
Tabel 5 menunjukkan bahwa HOMA-β genotip AA lebih rendah
dibandingkan genotip GA dan GG karena polimorfisme E23K gen KCNJ11
menyebabkan perubahan asam amino. Asam amino yang mengalami perubahan
yaitu asam glutamat (GAG) menjadi lisin (AAG). Perubahan asam amino ini akan
menyebabkan perubahan muatan negatif menjadi positif dan perubahan sifat asam
amino dari asam menjadi basa. Terjadinya perubahan muatan mengakibatkan
penurunan respon kanal KATPuntuk segera menutup dengan adanya ATP sehingga
kanal KATPterbuka lebih lama dan terjadi penurunan sekresi insulin (Haider et al.,
2005; Bryan et al., 2004).
Tabel 11 menunjukkan bahwa nilai HOMA-βpada kasus dan kontrol di
beberapa negara lain menunjukkan hasil yang bervariasi. Penelitian ini
menunjukkan bahwa nilai HOMA-β kasus lebih rendah daripada nilaiHOMA-β
kontrol. Hasil penelitian ini sama dengan penelitian di Meksiko, Hongkong,
India(Romero et al.,2005; Tam et al.,2014; Gupta et al.,2014).
Tabel
12
menunjukkan
bahwa
nilai
HOMA-β
pada
penelitian
polimorfisme E23K gen KCNJ11 di beberapa negara lain bervariasi. Penelitian ini
menunjukkan bahwa nilai HOMA-β individu dengan genotip AA lebih rendah
daripada genotip GA dan GG. Penelitian di Shanghai Cina menunjukkan bahwa
genotip GA lebih rendah daripada AAdan GG (He et al.,2008). Berbeda dengan
penelitian di Rusia menunjukkan genotip AA dan GA lebih rendah daripada
genotip GG (Christiakov et al., 2009).
V.3.5. Kesimpulan
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa frekuensi genotip AA, alel
A dan risiko untuk mendapatkan alel A pada kasus lebih tinggi daripada kontrol.
Nilai HOMA-β individu dengan genotip AA lebih rendah daripada genotip GA
dan GG pada penelitian ini.