TEST (BST) - Digilib ITS

UJI TOKSISITAS FRAKSI DARI SPONGS LAUT
Xestospongia DENGAN METODE BRINE SHRIMP
TEST (BST)
Oleh:
FRANSISCHA GALUH KARTIKASARI
1506100002
Dosen Pembimbing:
Awik Puji Dyah Nurhayati S.Si, M.Si
Drs. Agus Wahyudi M.S
LATAR BELAKANG
keanekaragaman hayati
laut Indonesia
melimpah
Spons
Genus Xestospongia
metabolit sekunder
Alkaloid, polycyclic Quinones dan
hydroquinones, derivate
polyacetylenic, aminoalkohol, dan
sterol (aragusterol) (Laurent et
al,2006), oxaquinoleridinesl, βCarbdine, terpenoid, laktones
(Kondracki et al,1992)
mempertahankan
diri dari predator
memiliki aktivitas farmakologis
dapat dipisahkan melalui metode
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Fraksi-fraksi
Uji pendahuluan
antikanker
Menggunakan
Artemia salina
Diuji ketoksikannya
dengan metode Brine
Shrimp Test (BST)
Permasalahan
Menguji toksisitas dari fraksi yang didapat dari ekstrak
Xestospongia dengan metode Brine Shrimp Test (BST)
Batasan masalah
Batasan masalah dalam penelitian ini antara lain:
1. menguji secara kualitatif senyawa Xestospongia
2. menguji toksisitas dari fraksi dari hasil KLT pada Xestospongia
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini antara lain:
1. untuk mengetahui jenis senyawa dari Xestospongia secara kualitatif
2. untuk mengetahui toksisitas dari fraksi Xestospongia dengan menggunakan metode
Brine Shrimp Test (BST)
Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini diharapkan dapat
digunakan sebagai pengembangan alternatif
pengobatan antikanker dengan menggunakan
produk dari spons laut.
METODOLOGI
Waktu Dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan April-Juli 2010. Uji
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Kromatografi lapis
Tipis Preparatif (KLTP) dilakukan di labolatorium Kimia
Sintesis Fakultas Farmasi UNAIR, Uji kualitatif
dilakukan diLabolatorium Farmakognosis Fakultas
Farmasi UNAIR dan uji Brine Shrimp Test (BST)
dilakukan di Labolatorium Zoologi Biologi ITS.
Cara Kerja
1. Isolasi Senyawa Bioaktif
Ekstrak kasar
Xestospongia dari
labolatorium zoologi
biologi ITS yang
telah kering diambil 1
gr
dilarutkan
etanol ±2
ml
Larutan ekstrak dalam etanol, ditotolkan pada
pelat KLT menggunakan pipa kapiler dengan
jarak ± 1 cm dari dasar
Setelah totolan kering,lempengan dimasukkan ke
dalam bejana dan dielusi hingga jarak ± 1 cm dari
tepi atas dengan fase gerak yang sesuai
kemudian di deteksi dengan sinar UV 254 nm dan
UV 365 nm
2. Uji Kualitatif
senyawa yang terpisahkan.
disemprot dengan anisaldehid, uap amoniak, besi
(III) klorida, Lieberman-Buchard dan
Dragendorff.
Dihitung nilai Rf (Retardation Factor) dengan menggunakan rumus:
Rf = Jarak yang ditempuh substansi
Jarak yang ditempuh oleh pelarut
3. Isolasi Senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis
Preparatif (KLTP)
Ekstrak Xestospongia
sp. yang dilarutkan
dalam ethanol
ditotolkan pada Plat KLTP
berupa garis lurus
menggunakan pipa kapiler
dengan jarak ± 2 cm dari dasar
dielusi dengan fase
gerak yang didapat dari
Kromatografi lapis
Tipis (KLT) hingga
jarak ± 2 cm dari tepi
atas
Senyawa yang berupa fraksi
dikerok dengan menggunakan
spatula berdasarkan nilai Rf yang
didapat dari KLT
Hasil berupa fraksi
Hasil penyaringan
dikeringkan dalam aerator
dilarutkan dalam etanol
dan disaring dengen
kertas saring
2. Uji Toksisitas
Fraksi yang didapat dari hasil
Kromatografi Lapis Tipis
Preparatif (KLTP)
kontrol
1000 ppm
dibuat dalam konsentrasi 1000
ppm, 500 ppm, 250 ppm, 100
ppm, 10 ppm dan 0 ppm (kontrol)
ditimbang
500 ppm
250 ppm
100 ppm
50 ml+50 ml
25 ml+75 ml
10 ml+90 ml
1 ml+99 ml
10 ppm
Telur Artemia salina
ditetaskan dalam wadah yang berisi 500
ml air laut
dengan kepadatan 5 g/L
diaerasi
selama 48 jam
Telur menetas dalam jangka waktu 24-36 jam
Setelah menetas, diberi pakan berupa ragi
dengan konsentrasi 3 mg dalam 5 ml air
laut sebanyak 1 tetes
Larva umur 48 jam
Digunakan dalam uji BST
3. Uji Brine Shrimp Test (BST)
Pada fraksi hasil Kromatografi lapis Tipis (KLT)
kontrol
1000 ppm
diambil
1 ml
diambil
1 ml
5 ml air
laut
250 ppm
500 ppm
diambil
1 ml
5 ml air
laut
100 ppm
diambil
1 ml
5 ml air
laut
10 ppm
diambil
1 ml
diambil
1 ml
5 ml air
laut
5 ml
air laut
5 ml
air
laut
masing-masing tabung reaksi
dimasukkan 10 ekor larva
Artemia salina umur 48 jam
diamati jumlah Artemia salina yang mati
dengan kaca pembesar selama 24 jam
dilakukan 3 kali ulangan
dihitung % kematian
Bila pada kontrol tidak ada larva
yang mati
Bila pada kontrol ada larva yang
mati
Rumus yang digunakan:
Jumlah Larva yang mati
%Kematian =
x 100%
Jumlah hewan yang diuji
(Meyer et al.,1982)
Rumus yang digunakan:
Jumlah larva yang mati – jumlah larva yang mati pada kontrol
%kematian =
Jumlah Hewan uji
x 100%
(Meyer et al.,1982)
ditentukan besarnya LC50 yang dihitung
dengan analisis probit menggunakan
MINITAB
hasil
Rancangan Penelitian dan Analisis Data
Penelitian menggunakan rancangan eksploratif dengan memberi perlakuan
konsentrasi ekstrak spons sebesar 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm,10
ppm dan 0 ppm sebagai kontrol. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3
kali.
Data Hasil
Tabel Analisa Kualitatif Jenis Senyawa
Jenis Senyawa
Warna
terpenoid
Merah atau ungu
steroid
biru
fenolik
biru ungu
flavonoid
warna jingga sampai merah
alkaloid
orange sampai merah bata
Analisa Data
Persentase kematian A. salina kemudian dilakukan analisis probit
untuk mengetahui nilai LC50. Analisis probit menggunakan program
MINITAB. Suatu ekstrak dianggap memiliki aktivitas toksik dan
berpotensi untuk diteliti lebih lanjut jika harga LC50 < 1000 ppm (Meyer
et al.,1982).
Hasil Dan pembahasan
Hasil KLT diperoleh spot fraksi sebanyak 4, dengan pelarut kloroform dan
aseton (5:1) (v/v)
Kloroform memiliki tingkat kepolaran yang lebih rendah dari pada aseton
sehingga gabungan keduanya menghasilkan kepolaran yang berbeda 
Kepolaran yang dihasilkan dari gabungan kedua pelarut rendah sehingga
senyawa yang dapat larut pada pelarut tersebut juga memiliki tingkat
kepolaran yang rendah
Plat KLT yang telah dielusi dengan pelarut kloroform dan aceton (5:1) (v/v)
berpendar ketika diamati dengan UV pada panjang gelombang 254 nm 
memiliki energi relatif lebih kuat daripada 365 nm
Hasil pada Kromatografi Lapis Tipis
(KLT)
Fraksi 4
Fraksi 3
Fraksi 2
Fraksi 1
Spot noda (fraksi) berpendar pada panjang Spot noda (fraksi) tidak berpendar pada
gelombang 254 nm
panjang gelombang 365 nm
Hasil pada Kromatografi Lapis Tipis
(KLT)
Jenis senyawa pada spot fraksi yang telah diperoleh adalah senyawa terpenoid
yang ditandai dengan adanya warna ungu setelah dilakukan penyemprotan
dengan reagen anisaldehid (Tabel 4.1).
Tabel 4.1. Hasil kualitatif jenis senyawa
Jenis Senyawa
Warna
Hasil Uji
terpenoid
Merah atau ungu
+
steroid
biru
-
fenolik
biru ungu
-
flavonoid
warna jingga sampai merah
-
alkaloid
orange sampai merah bata
-
Hasil pada Kromatografi Lapis Tipis
(KLT)
Hasil
penyemprotan
dengan Liberman
Buchart
Hasil
penyemprotan
dengan
Dragendroff
Hasil
penyemprotan
dengan
anisaldehid
Hasil
penyemprotan
dengan besi (III)
klorida
Hasil
penyemprotan
dengan uap
amonia
Hasil pada Kromatografi Lapis Tipis
(KLT)
Dari harga Rf yang di dapat dari KLT yaitu ½
Nilai Rf yang didapat dari KLT sama dengan Nilai Rf pada
Kromatografi lapis Tipis preparatif (KLTP) yang digunakan
untuk mengambil senyawa pada KLTP
Rf menunjukkan perjalanan senyawa yang dipisahkan
relative terhadap perjalanan pelarut
Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode
Brine Shrimp Test (BST)
Hasil uji toksisitas fraksi spons laut Xestospongia menujukkan % kematian terhadap larva
Artemia salina yang ditunjukkan dalam Tabel 4.2
Tabel 4.2. Hasil Uji Brine Shrimp Test (BST) untuk fraksi yang didapat dari Kromatografi
Lapis Tipis (KLT)
Konsentrasi
Pengulangan
Jumlah larva Artemia
yang diuji
Jumlah Larva
Artemia yang Mati
0
0
0
10
10
10
100
100
100
250
250
250
500
500
500
1000
1000
1000
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
0
1
2
2
5
3
3
4
4
5
4
4
6
4
4
5
6
6
jumlah
rata-rata
%
kematian
3
1.00
10
10
3.33
23.3
11
3.67
26.7
13
4.33
33.3
14
4.67
36.67
17
5.67
46.67
Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode
Brine Shrimp Test (BST)
Probability Plot for Jumlah Larva Artemia yang Mati
Normal - 95% CI
Probit Data - ML Estimates
99
Table of Statistics
Mean
692.329
StDev 1027.53
Median 692.329
IQ R
1386.11
95
90
Percent
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
-5000
-2500
0
2500
Konsentrasi
5000
7500
Grafik 4.1 Probability plot untuk jumlah larva Artemia yang mati
Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode
Brine Shrimp Test (BST)
Larva Artemia yang mati pada kontrol
larva pada kondisi yang lemah
tidak dapat beradaptasi saat dipindahkan dari media air laut dari
tempat penetasan ke dalam media air laut di botol ampul.
Larva Artemia yang mati pada kontrol
mengalami penurunan aktivitas.
Semakin lama, Artemia dalam kontrol semakin lemah dan terus berada
di dasar tabung.
Larva Artemia dengan perlakuan fraksi (ppm)
gerak (gerakannya tidak teratur)
mengalami disorientasi
Semakin tinggi nilai konsentrasi fraksi ekstrak
semakin tinggi (Tabel 4.1)
mortalitas Artemia juga
Harbourne (1994) semakin tinggi konsentrasi ekstrak, maka sifat toksiknya
akan semakin tinggi.
Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode
Brine Shrimp Test (BST)
Dari hasil perhitungan Analisa Probit dengan menggunakan MINITAB,
didapat nilai LC50 pada ekstrak fraksi Xestospongia ini adalah 692.329
ppm.
Meyer (1982)
suatu ekstrak bersifat toksik bila nilai LC50 ≤1000 ppm
sehingga ekstrak dari fraksi Xestospongia dapat dikatakan toksik.
Terpenoid bersifat toksik
pada sebagian besar komponen terpenoid memiliki
struktur lipofilik
menyebabkan kerusakan membran sel sehingga
menyebabkan kematian sel.
Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode
Brine Shrimp Test (BST)
Sifat nonpolar terpenoid
mudah menembus membran sel atau
membran organel dalam sel pada sisi hidrofobik
membentuk
struktur misel
terbentuknya ikatan antara senyawa nonpolar
(terpenoid) dengan bagian nonpolar dari membran sel
menyebabkan permeabilitas membran sel terganggu.
Terpenoid
memiliki efek sinergis bagi toksin lain dengan
bertindak sebagai solven untuk memfasilitasi toksin bergerak
melalui membran (Dudareva dan Gershenzon, 2007 dalam Imaria,2008).
Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode
Brine Shrimp Test (BST)
 Terpenoid
merusak DNA
merusak ikatan dalam DNA menjadi
DNA Single-strand dan dapat menghambat proses mitosis sel (Sladić dan
Gašić, 2006)
 Senyawa bioaktif sebagai zat toksik dapat masuk melalui membran
sel larva Artemia (secara difusi), membran sel : untuk mengatur
perpindahan zat ke dalam dan keluar sel pada organela sel
 Senyawa toksik masuk
menyebabkan terjadinya perusakan
atau modifikasi permeabilitas membrane dan mengacaukan system
perpindahan zat dengan cara turut campur dalam pembawa dan
produksi ATP
mengganggu proses biokimiawi dan fisiologi (Connell dan
Miller,1995)
Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode
Brine Shrimp Test (BST)
Masuknya zat toksik
melalui saluran pencernaan
Artemia bersifat
penyaring tidak selektif (non selective filter feeder)
sehingga apa saja
yang dapat masuk mulut artemia seakan-akan menjadi makanannya
(Isnansetyo dan Kurniastuty,1995 dalam Widyastuti,2005)
Senyawa yang masuk
dapat berinteraksi dengan target (misalnya
enzim,lemak, membran sel, asam nukleat)
mempengaruhi
mekanisme tubuh yang akhirnya dapat menyebabkan kematian (Connell dan
Miller,1995)
Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode
Brine Shrimp Test (BST)
Masuknya senyawa toksik
melalui pernafasan
saat pertukaran
gas melewati permukaan permeable pada bagian tengah tempat
keluarnya di thoraciz appendages
Metabolisme sekunder yang bersifat polar relatif lebih toksik daripada
yang bersifat non polar (Nurhayati et al.,2006)
Senyawa metabolit sekunder yang bersifat polar
flavonoid
Senyawa yang bersifat non polar
dalam Nurhayati et al.,2006)
alkaloid dan
terpenoid dan steroid (Sastroamidjojo
Kesimpulan dan Saran
Kesimpulan
Hasil dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa hasil kualitatif
pada Rf ½ merupakan terpenoid. Fraksi tersebut mempunyai
nilai LC50 sebesar 692.329 ppm
Saran
Perlu diadakan penelitian terhadap sel kanker untuk mengetahui
potensi senyawa tersebut sebagai anti kanker