PROSEDUR PCR

PROSEDUR PCR
Vivantis DNA amplification kit
1. Bersihkan tempat kerja dengan ethanol 70%
2. Siapkan sarung tangan, pipet tips, eppendorf tubes steril pada tempat bersih (seringlah
mengganti sarung tangan)
3. Siapkan Vivantis DNA amplification kit dari -20 kemudian thawing pada RT
4. Penyiapan primer
a. Proses pengenceran primer
 Β_actin_F ditambah dengan 378 µL water free RNAse
 Β_actin_R ditambah dengan 354 µL water free RNAse
 Jagged 1_F ditambah dengan 394 µL water free RNAse
 Jagged 1_R ditambah dengan 374 µL water free RNAse
Dipipeting supaya homogen dan divortex
b. Proses aliquot primer
Diambil 10 µL masing-masing primer dimasukkan pada ependof yang berbeda dan
dilabel
5. Labeli 200 µL PCR tube sesuai jumlah sampel
Label 1 = K14P
label 2 = K24P
Label 3 = K34P
label 4 = K42P
Label 5 = K54P
label 6 = K64P
Label 7 = K74P
label 8 = K84P
Label 9 = K94P
Untuk penulisan dengan tinta biru menggunakan primer “Jagged 1” dan tinta hitam
“Β_actin” (karena pada penelitian ini hanya menggunakan 2 primer tersebut)
6. Penyiapan reagen PCR mix reaksi
Ikutilah prosedur pada table dibawah ini
Prosedure PCR Reaction
Tabel 1. Mix Reaksi
No.
Mix Reaksi PCR
1 x Reaksi
1/7 X Reaksi
12X Reaksi
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Water nuclease-free
10 x Vi Buffer A
2mM dNTP mix
50mM MgCl2
10µM Forward Primer
10µM Reverse Primer
Taq DNA Polymerase
Control DNA/sample DNA
total
38,1 µL
5 µL
2 µL
1,5 µL
1 µL
1 µL
O,4 µL
1 µL
50 µL
5,443 µL – 5,386 µL
0,714 µL
0,286 µL
0,214 µL
0,143 µL
0,143 µL
0,057 µL
0,143 µL – 0,2 µL
7,143 µL
64,632 µL
8,568 µL
3,432 µL
2,568 µL
1,716 µL
1,716 µL
O,684 µL
@ 0,2 µL
Catatan :
a. Untuk menentukan x reaksi:
1. perhitungkan total volume yang diperlukan cukup untuk percobaan selanjutnya
(Elektroforesis Horisontal/DNA), contoh 1/7 x reaksi,
Heni Endrawati, S.Si
Page 1
2. kemudian kalikan dengan jumlah sampel ditambah 3 atau 4, contoh 12 x reaksi = 9
sampel + 3
b. untuk Taq DNA polymerase harus segera di aliquot 20 µL pada beberapa ependdof,
labellah dan segera disimpan dalam -20oC
7. Siapkan/masukkan 6,943 µL Mix reaksi PCR kedalam masing tube eppendorf (v 200 µL)
sampel yg telah disiapkan (no. 5)
8. Pipetlah 0,2 µL DNA template atau DNa Sampel
9. Campurlah dengan mix reaksi PCR yang sidah siap dalam tube eppendorf dengan cara
dipepeting (jangan divortex) kemudian spin down
10. Bawalah tube pada mecin PCR dan gunakan mengikuti kondisi siklus pada table 2
Tabel 2. cycling condition PCR
PCR Cycle step
Initial denaturation
Denaturation
Anneling
Extention
Final extention
Hold
Temperature
O
95 C
O
95 C
O
52 C
O
72 C
O
72 C
O
12 C
Time (minutes)
3
30 sec
30 sec
30 sec
5
Indefinitely
Number of cycle
1
40
1
1
11. Setelah proses PCR sampel bisa disimpan dalam 4oC, atau langsung di elektroforesis
Horisontal/DNA.
Heni Endrawati, S.Si
Page 2