1. SAMPUL_THESIS

44
Gambar 1. Struktur dan genom virus influensa
[Sumber: Department of Pharmacy CNUH 2003: 3.]
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
45
A
C
B
D
A
5’
3’
3’
5’
D
Keterangan:
Dua buah fragmen DNA diamplifikasi pada reaksi
PCR pertama. Primer ditunjukkan dengan huruf A,
B, C, dan D. Primer B dan C menunjukkan adanya
daerah overlapping. Daerah overlapping tersebut
dihibridisasi pada reaksi PCR kedua. Pada rekasi
PCR kedua, primer A dan D akan mengamplifikasi
fragmen-fragmen menjadi satu fragmen utuh.
Gambar 2. Prinsip dasar teknik overlapping extension
PCR [Sumber: Heckman & Pease 2007: 926.]
’
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
46
Daerah
overlapping
sebagai
primer
3’
Fragmen A
5’
5’
3’
Fragmen B
Sintesis DNA full length pada
reaksi PCR pertama
DNA full length
Amplifikasi DNA full length
pada reaksi PCR kedua
Gambar 3. Sintesis DNA dengan teknik overlapping
entension PCR [Sumber: Seegene 2006: 14.]
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
47
H896F
5’
3’
3’
5’
H923R
1st PCR
2nd PCR
H869F
5’
3’
H953R
3rd PCR
H843F
5’
3’
H979R
4th PCR
H819F
5’
3’
H1003R
dan seterusnya hingga kedelapan pasang
primer ditambahkan
Gambar 4. Overlapping extension PCR dengan variasi
penambahan primer selang 3 siklus
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
48
Thawing
10 X PCR Buffer, 10 mM
dNTP mix, Distilled water,
5X Q-Solution, Primer,
HotStar Taq DNA
Vorteks
Reaction
mixture PCR
Centrifuge
Tabung PCR
Centrifuge
Elektroforesis
PCR
Penambahan
pasangan primer
selang 3 siklus
Analisis
Gambar 5. Skema kerja penelitian
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
Geldoc
49
H896F
5’
3
5’
H923R
H869F
5’
3’
H953R
H843F
5’
3’
H979R
H819F
5’
3’
Awal siklus
1st PCR
H1003R
H791F
5’
3’
H1028R
H765F
5’
3’
H1051R
H729F
5’
3’
H1078R
H703F
5’
3’
H1104R
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
49
Gambar 6. Metode ke-1 (delapan pasang primer ditambahkan secara bersamaan pada awal siklus
untuk satu kali reaksi PCR)
50
H896F
5’
3’
5’
H923R
Awal siklus
H869F
5’
3’
Siklus ke-3
H953R
H843F
5’
3’
H979R
Siklus ke-6
H819F
5’
1st PCR
3’
H1003R
Siklus ke-9
H791F
5’
3’
Siklus ke-12
H1028R
H765F
5’
3’
H1051R
Siklus ke-15
H729F
5’
3’
H1078R
Siklus ke-18
H703F
5’
3’
H1104R
Siklus ke-21
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
50
Gambar 7. Metode ke-2 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam satu kali reaksi PCR,
dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam satu reaksi PCR)
51
H896F
5’
3’
5’
H923R
Awal siklus
H869F
5’
3’
Siklus ke-3
H953R
1st PCR
H843F
5’
3’
H979R
Siklus ke-6
H819F
5’
3’
H1003R
Siklus ke-9
H791F
5’
3’
Awal siklus
H1028R
H765F
5’
3’
H1051R
Siklus ke-3
H729F
5’
2nd PCR
3’
H1078R
Siklus ke-6
H703F
5’
3’
H1104R
Siklus ke-9
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
51
Gambar 8. Metode ke-3 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam dua kali reaksi PCR,
dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam satu reaksi PCR)
52
H896F
5’
3’
5’
H923R
Awal siklus
1st PCR
H869F
5’
3’
Siklus ke-3
H953R
H843F
5’
3’
H979R
Awal siklus
2nd PCR
H819F
5’
3’
Siklus ke-3
H1003R
H791F
5’
3’
Awal siklus
H1028R
3rd PCR
H765F
5’
3’
Siklus ke-3
H1051R
H729F
5’
3’
H1078R
Awal siklus
4th PCR
H703F
5’
3’
H1104R
Siklus ke-3
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
52
Gambar 9. Metode ke-4 (Delapan pasang primer ditambahakan dalam empat kali reaksi PCR,
dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam satu reaksi PCR)
53
H896F
5’
3’
5’
1st PCR
Awal siklus
H923R
H869F
5’
3’
2nd PCR
Awal siklus
H953R
H843F
5’
3’
H979R
3rd PCR
Awal siklus
H819F
5’
3’
4th PCR
Awal siklus
H1003R
H791F
5’
3’
5th PCR
Awal siklus
H1028R
H765F
5’
3’
Awal siklus
H1051R
6th PCR
H729F
5’
3’
H1078R
Awal siklus
7th PCR
H703F
5’
3’
H1104R
Awal siklus
8th PCR
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
53
Gambar 10. Metode ke-5 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam delapan kali reaksi PCR)
54
K-
M
5
4
3
2
1
200 pb
100 pb
Gel poliakrilamid 12 %; 120 volt; EtBr 1 µg/ml; 60 menit
Keterangan:
Lajur KLajur M
Lajur 5
Lajur 4
Lajur 3
Lajur 2
Lajur 1
: Kontrol negatif (tanpa penambahan pasangan primer)
: Penanda DNA 100 pb
: Metode ke-5 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam delapan kali
reaksi PCR)
: Metode ke-4 (Delapan pasang primer ditambahakan dalam empat kali
reaksi PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam satu
reaksi PCR)
: Metode ke-3 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam dua kali
reaksi PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam satu
reaksi PCR)
: Metode ke-2 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam satu kali
reaksi PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam satu
reaksi PCR)
: Metode ke-1 (Delapan pasang primer ditambahkan secara bersamaan
pada awal siklus untuk satu kali reaksi PCR)
: Menunjukkan pita DNA dan ukurannya
Gambar 11. Visualisasi produk PCR pertama dari kelima metode
penambahan primer dengan suhu annealing 60° C dan final
concentration MgCl2 sebesar 1,5 mM
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
55
K-
5
4
3
2
1
M
200 pb
134 pb
100 pb
83 pb
d
d
Gel poliakrilamid 12 %; 120 volt; EtBr 1 µg/ml; 60 menit
Keterangan:
Lajur KLajur 5
Lajur 4
Lajur 3
Lajur 2
Lajur 1
Lajur M
d
: Kontrol negatif (tanpa penambahan pasangan primer)
: Metode ke-5 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam delapan kali
reaksi PCR)
: Metode ke-4 (Delapan pasang primer ditambahakan dalam empat kali
reaksi PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam
satu reaksi PCR)
: Metode ke-3 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam dua kali
reaksi PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam
satu reaksi PCR)
: Metode ke-2 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam satu kali
reaksi PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam
satu reaksi PCR)
: Metode ke-1 (Delapan pasang primer ditambahkan secara bersamaan
pada awal siklus untuk satu kali reaksi PCR)
: Penanda DNA 100 pb
: Menunjukkan pita DNA dan ukurannya
: Produk dimer
Gambar 12. Visualisasi produk PCR pertama dari kelima metode
penambahan primer dengan suhu annealing 55° C dan final
concentration MgCl2 sebesar 1,5 mM
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
56
M K- 1
2
3
4
5
M
200 pb
100 pb
d
d
d
Gel poliakrilamid 12 %; 120 volt; EtBr 1 µg/ml; 60 menit
Keterangan:
Lajur M
Lajur KLajur 1
Lajur 2
Lajur 3
Lajur 4
Lajur 5
d
: Penanda DNA 100 pb
: Kontrol negatif (tanpa penambahan pasangan primer)
: Metode ke-1 (Delapan pasang primer ditambahkan secara bersamaan
pada awal siklus untuk satu kali reaksi PCR)
: Metode ke-2 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam satu kali
reaksi PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam
satu reaksi PCR)
: Metode ke-3 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam dua kali
reaksi PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam
satu reaksi PCR)
: Metode ke-4 (Delapan pasang primer ditambahakan dalam empat kali
reaksi PCR, dengan selang 3 siklus untuk 1 pasang primer dalam
satu reaksi PCR)
: Metode ke-5 (Delapan pasang primer ditambahkan dalam delapan kali
reaksi PCR)
: Menunjukkan pita DNA dan ukurannya
: Produk dimer
Gambar 13. Visualisasi produk PCR pertama dari kelima metode
penambahan primer dengan suhu annealing 55° C dan final
concentration MgCl2 sebesar 2 mM
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
57
4
3
2
1
M
446 pb
400 pb
344 pb
300 pb
239 pb
200 pb
134 pb
100 pb
Gel poliakrilamid 12 %;120 volt; EtBr 1 µg/ml; 60 menit
Keterangan:
Lajur 4
Lajur 3
Lajur 2
Lajur 1
Lajur M
:
:
:
:
:
:
Produk PCR keempat
Produk PCR ketiga
Produk PCR kedua
Produk PCR pertama
Penanda DNA 100 pb
Menunjukkan pita DNA dan ukurannya
Gambar 14. Visualisasi produk PCR pertama sampai keempat
dari metode ke-4
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
58
8
7
6
5
4
3
2
1
M
446 pb
400 pb
300 pb
200 pb
399 pb
344 pb
291 pb
185pb
239 pb
134 pb
100 pb
83 pb
Gel poliakrilamid 12 %; 120 volt; EtBr 1µg/ml; 60 menit
Keterangan:
Lajur 8
Lajur 7
Lajur 6
Lajur 5
Lajur 4
Lajur 3
Lajur 2
Lajur 1
Lajur M
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
Produk PCR kedelapan
Produk PCR ketujuh
Produk PCR keenam
Produk PCR kelima
Produk PCR keempat
Produk PCR ketiga
Produk PCR kedua
Produk PCR pertama
Penanda DNA 100 pb
Menunjukkan pita DNA dan ukurannya
Gambar 15. Visualisasi produk PCR pertama sampai kedelapan dari
metode ke-5
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
59
TABEL
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
60
Tabel 1
Waktu yang dibutuhkan untuk sintesis fragmen 6881119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur
A/Indonesia/5/2005 dengan inisiasi overlapping extension PCR
No.
Metode
sintesis
ke-
Waktu untuk satu
Jumlah
kali reaksi PCR
reaksi PCR
(jam: menit: detik)
1.
1
02: 05: 00
1
01: 00: 00
1
03: 05: 00
2.
2
02: 55: 00
1
01: 00: 00
1
03: 55: 00
3.
3
02: 35: 00
2
01: 00: 00
2
05: 10: 00
4.
4
02: 15: 00
4
01: 00: 00
4
13: 00: 00
5.
5
01: 55: 00
8
01: 00: 00
8
23: 20: 00
Waktu untuk satu kali
running Elektroforesis
(jam: menit: detik)
Total waktu untuk
Jumlah
running
sintesis
Elektroforesis (jam: menit: detik)
60
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
61
Tabel 2
Total volume reagen dan jumlah peralatan habis pakai yang dibutuhkan untuk reaksi PCR pada sintesis fragmen
688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur A/Indonesia/5/2005 dengan inisiasi overlapping extension PCR
Metode
sintesis
ke4
5
H729F+
H1078R
H703F+
H1104R
HotStarTaq
master mix
kit 250 unit
(unit)
Tabung
PCR
0,2 ml
(buah)
Tips
0,5-10µl
(buah)
0,65
0,65
0,65
2,8
8
31
0,65
0,65
0,65
2,8
8
55
Pasangan primer (µl)
H819F+ H791F+ H765F+
H1003R H1028R H1051R
H896F+
H923R
H869F+
H953R
H843F+
H979R
0,39
0,65
0,65
0,65
0,65
0,39
0,65
0,65
0,65
0,65
Tabel 3
Total volume reagen dan jumlah peralatan habis pakai yang dibutuhkan untuk running elektroforesis pada sintesis
fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur A/Indonesia/5/2005 dengan inisiasi overlapping
extension PCR
Metode
sintesis
ke-
30 % Acrylamide
(ml)
10x
TBE
(ml)
10 %
APS
(µl)
TEMED
(µl)
Penanda DNA
100 pb
(µl)
10x loading
dye
(µl)
Tips
20 µl, 100 µl,
dan 1000 µl
(buah)
4
6,0
1,500
170,0
17,00
16
8
36
5
12,0
3,000
340,0
34,00
32
16
72
61
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
62
Tabel 4
Total biaya yang dibutuhkan untuk reaksi PCR pada sintesis fragmen 688--1119
gen HA Avian Influenza Virus (AIV) galur A/Indonesia/5/2005 dengan inisiasi
overlapping extension PCR
Metode
sintesis ke-
Pasangan
primer (µl)
Komponen biaya (Rp)
HotStarTaq
Tabung PCR
master mix
0,2 ml
kit 250 unit
Tips
0,5--10µl
Total Biaya
(Rp)
4
2.455,82
123.594,80
4.400,00
40.364,48
170.815,10
5
2.455,82
123.594,80
4.400,00
71.614,40
202.065,02
Tabel 5
Total biaya yang dibutuhkan untuk running elektroforesis pada sintesis fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza
Virus (AIV) galur A/Indonesia/5/2005 dengan inisiasi overlapping extension PCR
Metode
sintesis ke-
30 %
Acrylamide
10x
TBE
10 %
APS
Komponen biaya (Rp)
TEMED
Penanda
DNA 100 pb
10x loading
dye
Tips
20 µl, 100
µl, dan 1000
µl
Total Biaya
(Rp)
4
6.495,72
339,56
217,60
237,66
32.439,20
453,52
46.874,88
87.058,14
5
12.991,44
679,11
435,20
475,32
64.878,40
907,04
93.749,76
174.116,27
62
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
63
LAMPIRAN
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
64
Lampiran 1
Jumlah kumulatif kasus Avian Influenza Virus (AIV) tipe A (H5N1) yang dilaporkan oleh WHO
per 22 Februari 2008
Negara
Azerbaijan
Kamboja
China
Djibouti
Mesir
Indonesia
Irak
Rep.
Demokratik
Rakyat Lao
Myanmar
Nigeria
Pakistan
Thailand
Turki
Vietnam
Total
2003
case death
s
s
2004
case death
s
s
2005
case death
s
s
2006
case death
s
s
2007
case death
s
s
2008
case death
s
s
Total
case death
s
s
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
8
0
0
20
0
0
0
4
5
0
0
13
0
0
8
2
13
1
18
55
3
0
5
2
8
0
10
45
2
0
0
1
5
0
25
42
0
2
0
1
3
0
9
37
0
2
0
0
2
0
0
12
0
0
0
0
2
0
0
10
0
0
8
7
29
1
43
129
3
2
5
7
19
0
19
105
2
2
0
0
0
0
0
3
4
0
0
0
0
0
3
4
0
0
0
17
0
29
46
0
0
0
12
0
20
32
0
0
0
5
0
61
98
0
0
0
2
0
19
43
0
0
0
3
12
0
115
0
0
0
3
4
0
79
1
1
1
0
0
8
86
0
1
1
0
0
5
59
0
0
0
0
0
3
17
0
0
0
0
0
3
15
1
1
1
25
12
104
366
0
1
1
17
4
50
232
[Sumber: WHO 2008: 1.]
64
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
65
Lampiran 2
Daftar primer yang digunakan untuk sintesis fragmen 688--1119 gen HA Avian Influenza Virus (AIV)
galur A/Indonesia/5/2005 dengan teknik PCR
Primer
Forward
H896F
H869F
H843F
H819F
H791F
H765F
H729F
H703F
Reverse
H923R
H953R
H979R
H1003R
H1028R
H1051R
H1078R
H1104R
Kandungan GC
(%)
Forward
Reverse
46
46
46
46
46
43
50
46
50
48
51
48
46
46
42
38
Melting temperature
(° C)
Forward
Reverse
67
66
70
70
68
66
68
68
69
69
66
67
66
66
66
66
Panjang primer
(pb)
Forward
Reverse
47
47
34
47
34
41
36
47
36
39
37
48
47
50
45
52
Expected
band
(pb)
83
134
185
239
291
344
399
446
65
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
66
Lampiran 3
Komposisi campuran reaksi (reaction mixture) PCR pertama (1 kali reaksi PCR) untuk metode ke-1
Komposisi campuran reaksi (reaction mixture)
PCR
ke-
1
Forward +
Reverse
H896F +
H923R
H869F +
H953R
H843F +
H979R
H819F +
H1003R
H791F +
H1028R
H765F +
H1051R
H729F +
H1078R
H703F+
H1104R
Volume
Total
(µl)
Volume
(µl)
10x HotStar
PCR buffer
(µl)
5x Q
Solution
(µl)
10x mM
dNTP mix
(µl)
HotStar
Taq DNA
polymerase
(µl)
Distilled
water
(µl)
0,39
1,30
2,60
0,26
0,07
8,38
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
Pasangan primer
66
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
67
Lampiran 4
Komposisi campuran reaksi (reaction mixture) PCR pertama (1 kali reaksi PCR) untuk metode ke-2
Komposisi campuran reaksi (reaction mixture)
PCR
ke-
1
Forward +
Reverse
H896F +
H923R
H869F +
H953R
H843F +
H979R
H819F +
H1003R
H791F +
H1028R
H765F +
H1051R
H729F +
H1078R
H703F+
H1104R
Volume
Total
(µl)
Volume
(µl)
10x HotStar
PCR buffer
(µl)
5x Q
Solution
(µl)
10x mM
dNTP mix
(µl)
HotStar
Taq DNA
polymerase
(µl)
Distilled
water
(µl)
0,39
1,30
2,60
0,26
0,07
8,38
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
Pasangan primer
67
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
68
Lampiran 5
Komposisi campuran reaksi (reaction mixture) PCR pertama sampai kedua (2 kali reaksi PCR) untuk metode ke-3
Pasangan primer
PCR ke-
1
2
Forward+
Reverse
H896F +
H923R
H869F +
H953R
H843F +
H979R
H819F +
H1003R
H791F +
H1028R
H765F +
H1051R
H729F +
H1078R
H703F+
H1104R
Volume
(µl)
Komposisi campuran reaksi (reaction mixture)
Template
10x
10x mM
5x Q
HotStar
dNTP
Solution
Asal
Volume
PCR buffer
mix
(µl)
template
(µl)
(µl)
(µl)
HotStar
Taq DNA
polymerase
(µl)
Distilled
water
(µl)
Volume
Total
(µl)
0,39
-
1,30
2,60
0,26
0,07
8,38
13,00
0,65
-
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
0,65
-
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
0,65
-
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
1,30
2,60
0,26
0,07
7,47
13,00
0,65
Produk
PCR
pertama
0,65
0,65
-
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
0,65
-
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
0,65
-
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
68
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
69
Lampiran 6
Komposisi campuran reaksi (reaction mixture) PCR pertama sampai keempat (4 kali reaksi PCR) untuk metode ke-4
Pasangan primer
PCR ke-
1
Forward+
Reverse
H896F +
H923R
H869F +
H953R
H843F +
H979R
Volume
(µl)
Volume
Total
(µl)
1,30
2,60
0,26
0,07
8,38
13,00
0,65
-
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
1,30
2,60
0,26
0,07
7,47
13,00
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
1,30
2,60
0,26
0,07
7,47
13,00
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
1,30
2,60
0,26
0,07
7,47
13,00
1,30
2,60
0,26
0,07
8,12
13,00
0,65
Produk
PCR
pertama
0,65
0,65
0,65
0,65
0,65
-
Produk
PCR
kedua
0,65
4
H703F+
H1104R
Distilled
water
(µl)
-
3
H765F +
H1051R
H729F +
H1078R
HotStar
Taq DNA
polymerase
(µl)
0,39
2
H819F +
H1003R
H791F +
H1028R
Komposisi campuran reaksi (reaction mixture)
Template
10x
10x mM
5x Q
HotStar
dNTP
Solution
Asal
Volume
PCR buffer
mix
(µl)
template
(µl)
(µl)
(µl)
0,65
-
Produk
PCR
ketiga
0,65
-
69
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
70
Lampiran 7
Komposisi campuran reaksi (reaction mixture) PCR pertama sampai kedelapan (8 kali reaksi PCR) untuk metode
ke-5
Pasangan primer
PCR ke-
Forward+
Reverse
Volume
(µl)
2
H896F +
H923R
H869F +
H953R
3
H843F +
H979R
0,65
4
H819F +
H1003R
0,65
5
H791F +
H1028R
0,65
6
H765F +
H1051R
0,65
7
H729F +
H1078R
0,65
8
H703F+
H1104R
0,65
1
Komposisi campuran reaksi (reaction mixture)
Template
10x
10x mM
5x Q
HotStar
dNTP
Solution
Asal
Volume
PCR buffer
mix
(µl)
template
(µl)
(µl)
(µl)
0,39
0,65
Produk
PCR
pertama
Produk
PCR
kedua
Produk
PCR
ketiga
Produk
PCR
keempat
Produk
PCR
kelima
Produk
PCR
keenam
Produk
PCR
ketujuh
HotStar
Taq DNA
polymerase
(µl)
Distilled
water
(µl)
Volume
Total
(µl)
1,30
2,60
0,26
0,07
8,38
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
7,47
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
7,47
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
7,47
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
7,47
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
7,47
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
7,47
13,00
0,65
1,30
2,60
0,26
0,07
7,47
13,00
70
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
71
Lampiran 8
Komposisi gel poliakrilamid 12 % untuk visualisasi produk PCR
No.
Komponen gel
Volume
1
Millipore water
3,1875 ml
2
10x TBE
0,375
ml
3
30 % acrylamide solution (0,8% bis)
1,5
ml
4
10 % APS (Ammonium Persulfate)
42,5
µl
5
TEMED
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
4,25
µl
72
Lampiran 9
Penghitungan volume larutan 10 µM primer untuk final
concentration primer 0,3 µM
Tujuan:
Untuk mengetahui volume larutan 10 µM primer yang harus
ditambahkan ke dalam larutan reaction mix PCR sehingga memiliki final
concentration primer tertentu.
Rumus:
M1 x V1 = M2 x V2
M1 adalah working concentration primer dari stock (10 µM)
M2 adalah final concentration reaksi PCR yang diharapkan
V1 adalah volume primer yang ditambahkan ke dalam reaksi PCR
V2 adalah total volume reaksi PCR.
Contoh perhitungan:
Jika ingin membuat campuran reaksi (reaction mix) PCR
dengan volume13 µl dan final concentration primer dalam campuran reaksi
PCR sebesar 0,3 µM, maka volume 10 µM primer yang ditambahkan adalah:
M1 x V1 = M2 x V2
10 µM x V1 = 0,3 µM x 13 µM
V1 = 0,3 µM x 13 µM
10 µM
V1 = 0,39 µM
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
73
Lampiran 10
Penghitungan volume larutan 25 mM MgCl2 untuk final concentration
MgCl2 2 mM
Tujuan:
Untuk mengetahui volume larutan 25 mM MgCl2 yang harus
ditambahkan ke dalam larutan reaction mix PCR agar memiliki final
concentration MgCl2 tertentu.
Rumus:
Konsentrasi MgCl2 − 1,5 mM MgCl2
Volume MgCl2 =
x Total volume reaksi
25 mM MgCl2
Contoh perhitungan:
Jika ingin membuat campuran reaksi (reaction mix) PCR
dengan volume13 µl dan final concentration MgCl2 dalam campuran reaksi
PCR sebesar 2 mM, maka volume 25 mM MgCl2 yang ditambahkan adalah:
Volume 25 mM MgCl2 = 2 mM MgCl2 – 1,5 MgCl2 x 13 µL
25 mM MgCl2
= 0,26 µL
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
74
Lampiran 11
Penghitungan biaya reagen-reagen dan peralatan habis pakai yang digunakan untuk PCR dan elektroforesis
A. Reagen-reagen dan peralatan habis pakai untuk PCR
No.
1.
Nama produk
HotStarTaq master
kit 250 U [Qiagen]
Komposisi/
Banyaknya produk
250 unit
HotStarTaq DNA
Polymerase
(Qiagen 2007:175)
Harga
SGD 305
= Rp 2.207.050,15
1 SGD = Rp 7.236,23
10x PCR buffer
Biaya per satuan reagen/alat
Final concentration untuk HotStarTaq
master kit 250 U adalah 2,5
unit/reaksi dengan volume 0,5 µl,
sehingga final concentration untuk
volume 1 µl adalah 5 unit/reaksi.
(Bank Indonesia 2008: 1)
5x Q solution
Maka harga untuk 1µl HotStarTaq
master kit 250 U adalah:
(Rp 2.207.050,15/250) x 5
= Rp 44.141,00
25 mM MgCl2
10 mM dNTP mix
2.
PCR tube
[Axygen]
Distilled water
1000 buah
(Axygen 2008: 1)
Rp 550.000,00
Harga untuk 1000 buah tabung PCR
adalah Rp 550.000,00.
Maka harga untuk 1 buah tabung
PCR adalah:
Rp 550.000,00/1000
= Rp 550,00
74
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
75
No.
3.
Nama produk
Primer (Qiagen)
H896F + H923R
H869F + H953R
H843F + H979R
H819F + H1003R
H791F + H1028R
H765F + H1051R
H729F + H1078R
H703F + H1104R
Komposisi/
Banyaknya produk
200 µl untuk 500 µM
primer (untuk masingmasing primer)
Harga per unit
SGD 1 per pb
= Rp 7.236,23
1 SGD = Rp 7.236,23
(Bank Indonesia 2008: 1)
Biaya per satuan reagen/alat
Total panjang primer yang
digunakan adalah:
(47+34+34+36+36+37+47+45) +
(47+47+41+47+39+48
+50+52) = 687 pb
Total biaya untuk keseluruhan
primer adalah:
687 pb x Rp 7236,23
= Rp 4.971.290,01
(Qiagen 2007:175)
Produk primer sebanyak 200 µl
untuk 500 µM. Working
concentration primer yang
digunakan adalah 10 µM,
sehingga volume primer menjadi:
V1. M1 = V2. M2
V2 = (200 X 500)/10
V2= 10.000 µl
Harga untuk 1 µl total primer yang
digunakan adalah:
Rp 4.971.290,01/10.000
= Rp 497,13
4
Tips {0,5 --10 µl}
[Axygen]
96 tip/rack
(Axygen 2008: 1)
Rp 125.000,00/rack
96 buah tips seharga
Rp 125.000,00
Maka harga untuk 1 buah tip
adalah:
1/96x Rp 125.000,00
= Rp 1.302,08
75
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
76
B. Reagen-reagen dan peralatan habis pakai untuk running elektroforesis
No.
1.
Nama produk
30 % acrylamide/bis
29:1 [BioRad]
Komposisi/
Banyaknya produk
500 ml
(BioRad 2008: 1)
2.
10x TBE buffer
[BioRad]
10 % APS
[BioRad]
1 Liter
TEMED
[Promega]
10 gram
50 ml
(Promega 2008:1)
5.
6x Loading Dye solution
[Fermentas]
(Fermentas 2006: 327)
USD 23
= Rp 226.366,00
1 USD = Rp 9.842,00
(Bank Indonesia 2008: 1)
(BioRad 2008: 1)
4.
USD 55
= Rp 541.310,00
1 USD = Rp 9.842,00
(Bank Indonesia 2008: 1)
(BioRad 2008: 2)
3.
Harga
5 x 1 ml
Biaya per satuan reagen/alat
Harga 1 ml 30 % acrylamide/bis
29:1 adalah:
Rp 541.310,00/500
= Rp 1.082,62
Harga 1 ml 10x TBE buffer
adalah:
Rp 226.366,00/1000
=Rp 226,37
USD 13
= Rp 127.946,00
Untuk membuat larutan 100 ml
10 % APS diperlukan 10 g APS.
1 USD = Rp 9.842,00
(Bank Indonesia 2008: 1)
Maka harga untuk 1 µl larutan
10 % APS adalah:
Rp 127.946,00/100.000 µl
= Rp 1,28
USD 71
= Rp 698.782,00
Harga 1µl TEMED adalah:
Rp 698.782,00/50.000
= Rp 13,98
1 USD = Rp 9.842,00
(Bank Indonesia 2008: 1)
USD 28,80
= Rp 283.449,60
1 USD = Rp 9.842,00
(Bank Indonesia 2008: 1)
Harga 1µl 6x Loading Dye
solution adalah:
Rp 283.449,60/5.000
= Rp 56,69
76
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
77
No.
6.
Nama produk
O’Range ruler
100 bp DNA ladder
[Fermentas]
Komposisi/
banyaknya
produk
0,1 µg/µl
sebanyak 1 x 50 µg
(Fermentas 2006:
322)
7.
Tips [Axygen]
0,5 --10 µl, 20 µl,
100 µl, dan 1000 µl
Harga
USD 103
= Rp 1.013.726,00
Biaya per satuan reagen/alat
Harga 1µl O’Range ruler 100 bp DNA
ladder adalah:
(Rp 1.013.726,00 x 0,1)/50
= Rp 2.027,45
1 SGD = Rp 7.236,23
(Bank Indonesia 2008: 1)
96 tip/rack
Masing-masing
ukuran
(Axygen 2008: 2)
Rp 125.000,00/rack
96 buah tips seharga
Rp 125.000,00
Maka harga untuk 1 buah tip adalah:
1/96x Rp 125.000,00
= Rp 1.302,08
77
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008
78
Sintesis Fragmen..., Lamtorogung Prayitno, FMIPA UI, 2008