pembuatan dna rekombinan

PEMBUATAN DNA
REKOMBINAN
1
Nama enzim restriksi
o  Berdasarkan nama organisme dari mana enzim
diisolasi, mis.:
n 
n 
n 
Eco dari Escherichia coli
Hin dari Haemophilus influenzae
Hae dari Haemophilus aegyptius
o  Diikuti oleh nama strain (bila perlu)
o  Diikuti oleh angka Romawi
n 
Menunjukkan ada lebih dari satu macam enzim
restriksi dihasilkan dari organisme tersebut
2
Cara kerja enzim restriksi
o  Mengkatalisis hidrolisis ikatan fosfodiester dari
DNA.
3
Pemotongan DNA oleh enzim
restriksi
o  Memotong DNA pada
urutan spesifik = urutan pengenalan
(recognition sequence)
n  lokasi spesifik = sisi restriksi (restriction site)
n 
o  Hasil pemotongan
Simetris: urutan pengenalan palindrom
n  Tidak simetris: urutan pengenalan panjang dan
bukan palindrom
n 
4
Hasil pemotongan enzim restriksi
o  Simetris
n  Ujung lancip
n 
Ujung tumpul
n 
Ujung lancip
o  Tidak simetris
n 
BstXI
5
Contoh beberapa macam enzim
restriksi tipe II
o  HindII
o  GTPy PuAC
o  HindIII
o  A AGCTT
o  PstI
o  CTGCA G
o  MboI (frekuensi tinggi)
o  N GATCN
o  SmaI
o  CCC GGG
o  Xma I
o  C CCGGG
o  PspAI
o  C CCGGG
n 
n 
Py =T atau C; Pu = A atau G)
Isoskizomer = Dua enzim restriksi yang dapat mengenali
urutan DNA yang sama yang berasal dari organisme
berbeda → sisi restriksi bisa sama atau berbeda
Palindrom : Go hang a salami! I’m a lasagna hog
6
Pemotongan dan penyambungan
kembali DNA
o  Pemotongan DNA:
5’- NNNGAATTCNNN -3’
3’- NNNCTTAAGNNN -5’
EcoRI
o  Penyambungan
kembali
5’- NNNG
3’- NNNCTTAA
AATTCNNN -3’
GNNN -5’
5’- NNNG
OH
3’- NNNCTTAAP
PAATTCNNN
-3’
OHGNNN -5’
ligase
5’- NNNGAATTCNNN -3’
3’- NNNCTTAAGNNN -5’
7
4-9
Menyambung DNA
o  Ligase
Berasal dari
Bacteriophage (T4)
8
Ligasi ujung tumpul
o  Ujung tumpul dapat diligasi dengan ujung tumpul
o  Ujung lancip dapat dijadikan ujung tumpul:
n 
n 
Ujung 5’ yang ssDNA: dengan DNA polimerase I dan dNTP
Melepaskan bagian yang ssDNA dengan T4 DNA
polimerase
p  Mempunyai
n 
aktivitas DNA polimerase 5’ → 3’
p  Mempunyai aktivitas eksonuklease 3’ → 5’
Hasil ligasi tidak dapat dipotong lagi pada sisi yang sama
o  Ligasi ujung tumpul tidak seefisien ligasi ujung lancip
9
Ligasi ujung lancip
o  Ujung ssDNA sama/komplementer, DNA dapat
diligasi
n 
n 
n 
n 
BamHI
BclI
Sau3AI
BstYI
5’ -.....G ↓ GATCC.....-3’
5’ -.....A ↓ GATCT.....-3’
5’ -..... ↓ GATC .....-3’
5’ -.....R ↓ GATCY .....-3’
o  Bila DNA hasil pemotongan BamHI diligasi dengan
DNA hasil pemotongan BclI, hasil ligasinya dapat
dipotong dengan enzim apa?
10
VEKTOR KLONING (1)
o  Molekul DNA yang:
n  dapat bereplikasi sendiri di dalam sel
n  dimana DNA asing dapat dimasukkan
n  Ada marker:
p  untuk
mendeteksi adanya vektor
p  untuk mendeteksi adanya DNA asing
o  Macam-macam marker
n  gen resistensi antibiotik
n  gen lacZ (β-galaktosidase)
n  gen untuk sintesis asam amino
11
VEKTOR KLONING (2)
o  Plasmid
o  Virus
n 
n 
Bakteriofag lambda
Bakteriofag M13
o  Kombinasi dari plasmid dan virus
n 
n 
Kosmid
Phagemid
o  BAC (bacterial artificial chromosome)
12
Dasar pemilihan vektor
Ukuran DNA asing yang akan dimasukkan ke
dalam sel
n  Galur sel inang yang akan digunakan
n  Eksperimen yang akan dilakukan setelah
kloning
n 
p  Apakah
gen akan diekspresi?
p  Apakah diperlukan modifikasi pasca translasi pada
protein yang akan dihasilkan?
13
Plasmid
o  dsDNA
o  berbentuk lingkaran tertutup
o  1 – 200 kb
o  Jumlah plasmid di dalam sel: 1 – 700 (tergantung
macam plasmidnya)
o  Vektor kloning
n 
n 
n 
n 
Sisi pemotongan enzim restriksi yang unik
Marker seleksi kehadiran plasmid (resistensi
antibiotik)
Marker seleksi kehadiran DNA sisipan (lacZ)
pBR322, pUC10
o  Shuttle vector
n 
14
n 
Dapat bereplikasi di dalam > 1 spesies
YEp24 dapat bereplikasi di E. coli & ragi
Plasmid pBR322
Ec o RI
Hin d III
o  Marker seleksi: gen
n 
15
BamHI: sensitif tetrasiklin
PstI: sensitif ampisilin
am
p
Sa lI
r
n 
PstI
Ba m HI
r
t
te
resistensi tetrasiklin dan
ampisilin
o  Ori = origin of replication,
sekuens yang
memungkinkan plasmid
dapat menggandakan diri
dalam bakteri
o  DNA disisipkan ke dalam sisi
kloning:
p BR3 2 2
4 ,3 6 kb
A va I
o ri
P vu I
Plasmid pUC18/pUC19
o  Sisi kloning
p UC 1 8 /p UC 1 9
2 ,6 9 kb
o  Seleksi biru-putih
o ri
16
MC S
la c I
n 
lacZ aktif
Xgal berubah
menjadi biru
p
Z
n 
am
r
la c
dalam gen lacZ
o  Ada IPTG & Xgal
EcoRI
SacI
KpnI
SmaI
XmaI
BamHI
XboI
SalI
AccI
HincII
PstI
SphI
HindIII
17
Blue-White Colony Selection
18
IPTG-XGal
19
Vektor kloning khusus
o  Vektor ekspresi
Gen asing diekspresi & produksi protein tinggi
n  Promoter
n  Sisi pengikatan ribosom (SD)
n  Kodon start dekat sisi kloning
n  Signal terminasi transkripsi
n 
o  Vektor untuk mempelajari daerah regulator
pada DNA
n 
20
Reporter gene (gen pelapor)
Vector ekspresi pKK233-2
Marker seleksi
Promoter tac
RBS
Sisi pengenalan enzim
restriksi yang unik
Txn = terminator
Tidak ditunjukkan:
ori replikasi DNA
21
Ekspresi gen dari promoter
yang kuat dan dapat diregulasi
o  Transkripsi merupakan titik kontrol yang paling
penting
n  Dikontrol oleh promoter dari gen
o  Dua sifat penting dari promoter
n  Kuat
p 
p 
p 
n 
Dapat diregulasi
p 
22
Afinitas tinggi terhadap RNA polimerase
Ikatan kuat
sering ditranskripsi
Ikatan lemah RNA polimerase lepas
tidak ada transkripsi
p 
Kapan gen diekspresi dapat dikontrol
gunakan induser / ko-represor
Promoter yang penting dalam
vektor ekspresi E. coli
o  lac (atau lacUV5)
o  trp
o  tac (atau trc)
o  pL dari fag λ
o  gen 10 dari fag T7
23
tac (trc) promoter
o  Hibrid dari promoter lac dan trp
daerah -35 dari trp
daerah -10 dari lac
n  terpisah 16 pb = promoter tac
n  terpisah 17 bp = promoter trc
o  3x lebih kuat dari trp
o  10x lebih kuat dari lac
24
Promoter λ pL
o  promoter pL diregulasi oleh represor λ
o  represor λ dikode gen cI
o  Digunakan gen cI mutan
n 
n 
Mutasi kondisional
Mutan sensitif suhu
p 
28-30°C = suhu permisif
n 
n 
p 
42°C = suhu restriktif
mutan
•  ada ekspresi gen yang dikontrol represor cI
n 
25
fenotipe normal
Tidak ada ekspresi gen yang dikontrol represor cI
Regulasi oleh promoter pL
A) 30°C
protein cI aktif
mRNA
pcI
26
cI
oL
pL
gen target
Regulasi oleh promoter pL
B) 42°C
protein cI aktif
protein cI
tidak aktif
mRNA
pcI
27
cI - ts
oL
pL
gen target
Promoter gen 10 fag T7
o  Semua promoter fag T7 (termasuk gen
10) memerlukan RNA Polimerase T7
untuk ekspresinya
n 
n 
28
Letakkan gen RNA Pol T7 di bawah kontrol
promoter lac dalam sel E.coli
Letakkan Gen target di bawah kontrol
promoter gen 10
Promoter gen 10 fag T7
Induser
RNA Pol T7
pro lac Gen RNA Pol T7
Protein
target
T7 RNA Pol
pro g10
29
Gen target
Promoter gen 10 fag T7
o  Ekspresi gen RNA polimerase T7
dikontrol oleh induser operon lac
n 
n 
Laktosa (allolaktosa) ATAU
IPTG (iso-propil thio galaktosida)
p  Tidak
dimetabolisasi seperti laktosa
p  Tidak dipotong oleh β-galaktosidase
30
Transformasi
o  Transformasi
Memasukkan DNA ke dalam sel
n  Sel ditransformasi,
sedangkan
DNA mentransformasi sel
n 
o  Transforman
n 
Sel yang telah ditransformasi
o  Efisiensi transformasi =
n 
Jumlah transforman / µg DNA plasmid
Transformasi dengan metode CaCl2
o  Bakteri
ditumbuhkan sampai <108 sel/ml
(pertengahan fase logaritmik)
n  Diberi perlakuan dengan CaCl2 dingin
n  Diberi kejutan panas yang singkat.
n 
o  Perlakuan ini menyebabkan sel bakteri
menjadi kompeten untuk sementara,
sehingga dapat menerima DNA dari luar
sel
Setelah transformasi sel bakteri
o  Bakteri ditumbuhkan
o  Seleksi sel bakteri yang berhasil ditransformasi
plasmid
Medium diberi antibiotik
n  Bakteri perlu diberi kesempatan untuk mengekspresi
gen resistensi antibiotik yang ada di plasmid sebelum
antibiotik ditambahkan pada medium pertumbuhan
bakteri
n 
o  Seleksi bakteri yang berhasil ditransformasi
dengan plasmid rekombinan