BIO.012-08-Deteksi Fragmen

58
Gambar 1. Struktur dan genom virus avian influenza subtipe H5N1
[Sumber: Bickel 2006: 1.]
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
59
Gambar 2. Aktivitas neuraminidase dalam infeksi virus AI
[Sumber: Ting 1998: 1.]
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
60
Residues binding site
Sialic Acid binding site
Catalytic site
Gambar 3. Struktur neuraminidase [Sumber: Ting 1998: 1.]
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
61
Gambar 4. Prinsip dasar polymerase chain reaction (PCR)
[Sumber: Copernicus 2008: 1.]
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
62
Gambar 5. Sintesis cDNA dengan omniscript reverse transcriptase
[Sumber: Qiagen 2004: 9.]
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
63
C
Perbesaran 10×100
B
Perbesaran 10×100
A
Perbesaran 10×100
Gambar 6. Haemophilus influenzae (A); Neisseria meningitidis (B);
Streptococcus pneumonia (C) [Sumber: Todar 2004: 1.]
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
64
Cetakan RNA
ditambahkan ke
dalam reaction mix
RT-PCR di biosafety
cabinet
Reaction mix RT-PCR dan
Hot Start PCR dibuat
di ruang PCR
Cetakan cDNA
ditambahkan ke
dalam reaction
mix Hot Start-PCR
di biosafety
cabinet
Amplifikasi DNA
dilakukan
dengan
thermocycler
sebanyak 35
siklus.
Pembuatan cDNA dengan
omniscript reverse
transcriptase,purifikasi cDNA,
dan pengukuran konsentrasi
cDNA dengan
spektrofotometer.
Keberhasilan PCR
diperiksa dengan
PAGE 12%, 120 V,
1 jam.
Hasil PAGE diperiksa
di bawah sinar UV dengan
pewarnaan etidium
bromida 1 µl/ml dan difoto
dengan gel doc.
Gambar 7. Skema kerja penelitian
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
65
3
2
1
M
256 pb
174 pb
231 pb
300 pb
200 pb
100 pb
7
6
5
218 pb
4
M
300 pb
200 pb
100 pb
Gel poliakrilamida 12%; 120 volt; EtBr 1 µl/ml; 60 menit
Keterangan
:
Lajur 7
Lajur 6
Lajur 5
Lajur 4
Lajur 3
Lajur 2
Lajur 1
Lajur M
: Produk PCR NIF757 + NIR975 pada suhu annealing 57,6° C
: Produk PCR NIF757 + NIR975 pada suhu annealing 56° C
: Produk PCR NIF757 + NIR975 pada suhu annealing 57,6° C
: Produk PCR NIF757 + NIR975 pada suhu annealing 56° C
: Produk PCR NIF600 + NIR774 pada suhu annealing 58,6° C
: Produk PCR NIF306 + NIR537 pada suhu annealing 57,6° C
: Produk PCR NIF64 + NIR320 pada suhu annealing 55,2° C
: Penanda DNA 100 pb
: Menunjukkan pita DNA dan ukurannya
: PCR dilakukan dengan konsentrasi akhir primer 1 µM dan konsentrasi akhir MgCl2
2 mM (Lajur 1, 2, 3, 6, dan 7)
PCR dilakukan dengan konsentrasi akhir primer 0,5 µM dan konsentrasi akhir MgCl2
2 mM (Lajur 4 dan 5)
Keterangan
Gambar 8. Visualisasi produk PCR hasil optimasi untuk uji spesifisitas
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
66
k-
6
5
4
3
2
2
1
M
256 pb
231 pb
300 pb
200 pb
100 pb
k-
12
11
10
9
8
7
M
300 pb
218 pb
174 pb
200 pb
100 pb
Gel poliakrilamida 12%; 120 volt; EtBr 1 µl/ml; 60 menit
Keterangan
:
Lajur kLajur 12
Lajur 11
Lajur 10
Lajur 9
Lajur 8
Lajur 7
Lajur 6
Lajur 5
Lajur 4
Lajur 3
Lajur 2
Lajur 1
Lajur M
: Kontrol negatif (tanpa penambahan cetakan DNA)
: Produk PCR NIF757 + NIR975; MgCl2 4 mM
: Produk PCR NIF757 + NIR975; MgCl2 3 mM
: Produk PCR NIF757 + NIR975; MgCl2 2 mM
: Produk PCR NIF600 + NIR774; MgCl2 4 mM
: Produk PCR NIF600 + NIR774; MgCl2 3 mM
: Produk PCR NIF600 + NIR774; MgCl2 2 mM
: Produk PCR NIF306 + NIR537; MgCl2 4 mM
: Produk PCR NIF306 + NIR537; MgCl2 3 mM
: Produk PCR NIF306 + NIR537; MgCl2 2 mM
: Produk PCR NIF64 + NIR320; MgCl2 4 mM
: Produk PCR NIF64 + NIR320; MgCl2 3 mM
: Produk PCR NIF64 + NIR320; MgCl2 2 mM
: Penanda DNA 100 pb
: Menunjukkan pita DNA dan ukurannya
: PCR dilakukan dengan konsentrasi akhir primer 1 µM
Keterangan
Gambar 9. Visualisasi produk PCR hasil optimasi konsentrasi MgCl2
untuk uji sensitivitas
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
67
kK-
6
5
4
3
2
1
M
300 pb
256 pb
200 pb
(a)
kK-
100 pb
6
5
4
3
2
1
M
300 pb
231 pb
200 pb
100 pb
(b)
Gel poliakrilamida 12%; 120 volt; EtBr 1 µl/ml; 60 menit
Keterangan
:
Lajur kLajur 6
Lajur 5
Lajur 4
Lajur 3
Lajur 2
Lajur 1
Lajur M
: Kontrol negatif (tanpa penambahan cetakan DNA)
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 0,1 pg/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 1 pg/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 0,01 ng/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 0,1 ng/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 1 ng/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 10 ng/µl
: Penanda DNA 100 pb
: Menunjukkan pita DNA dan ukurannya
: PCR dilakukan pada suhu annealing 55,2º C (a) dan 57,6º C (b), konsentrasi akhir
primer 1 µM, dan konsentrasi akhir MgCl2 4 mM
Keterangan
Gambar 10. Visualisasi produk PCR hasil uji sensitivitas menggunakan
pasangan primer NIF64 + NIR320 (a) dan NIF306 + NIR537 (b)
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
68
kK-
6
5
4
3
2
1
M
m
300 pb
231 pb
200 pb
100 pb
(a)
k-
6
5
4
3
2
1
M
300 pb
231 pb
200 pb
100 pb
(b)
Gel poliakrilamida 12%; 120 volt; EtBr 1 µl/ml; 60 menit
Keterangan
:
Lajur kLajur 6
Lajur 5
Lajur 4
Lajur 3
Lajur 2
Lajur 1
Lajur M
: Kontrol negatif (tanpa penambahan cetakan DNA)
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 0,1 pg/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 1 pg/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 0,01 ng/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 0,1 ng/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 1 ng/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 10 ng/µl
: Penanda DNA 100 pb
: Menunjukkan pita DNA dan ukurannya
: PCR dilakukan pada suhu annealing 57,6º C, konsentrasi akhir primer 1 µM, dan
konsentrasi akhir MgCl2 4 mM
Keterangan
Gambar 11. Visualisasi produk PCR pengulangan ke-4 (a) dan ke-5 (b) uji
sensitivitas menggunakan pasangan primer NIF306 + NIR537
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
69
k-
6
5
4
3
2
1
(b)
(a)
174 pb
M
300 pb
200 pb
100 pb
Gel poliakrilamida 12%; 120 volt; EtBr 1 µl/ml; 60 menit
Keterangan
:
Lajur kLajur 6
Lajur 5
Lajur 4
Lajur 3
Lajur 2
Lajur 1
Lajur M
: Kontrol negatif (tanpa penambahan cetakan DNA)
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 0,1 pg/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 1 pg/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 0,01 ng/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 0,1 ng/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 1 ng/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 10 ng/µl
: Penanda DNA 100 pb
: Menunjukkan pita DNA dan ukurannya
: PCR dilakukan pada suhu annealing 58,6º C, konsentrasi akhir primer 1 µM, dan
konsentrasi akhir MgCl2 4 mM
Keterangan
Gambar 12. Visualisasi produk PCR hasil uji sensitivitas menggunakan
pasangan primer NIF600 + NIR774
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
70
K-
6
5
4
3
2
1
M
300 pb
200 pb
174 pb
100 pb
(a)
Dimer primer
k-
6
5
4
3
2
1
M
300 pb
200 pb
174 pb
(b)
100 pb
Gel poliakrilamida 12%; 120 volt; EtBr 1 µl/ml; 60 menit
Keterangan
:
Lajur kLajur 6
Lajur 5
Lajur 4
Lajur 3
Lajur 2
Lajur 1
Lajur M
: Kontrol negatif (tanpa penambahan cetakan DNA)
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 0,1 pg/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 1 pg/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 0,01 ng/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 0,1 ng/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 1 ng/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 10 ng/µl
: Penanda DNA 100 pb
: Menunjukkan pita DNA dan ukurannya
: PCR dilakukan pada suhu annealing 58,6º C, konsentrasi akhir primer 1 µM, dan
konsentrasi akhir MgCl2 4 mM
Keterangan
Gambar 13. Visualisasi produk PCR pengulangan ke-2 (a) dan ke-3 (b) uji
sensitivitas menggunakan pasangan primer NIF600 + NIR774
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
71
KK-
6
5
4
3
2
1
M
M
300 pb
218 pb
200 pb
(a)
K-
100 pb
6
5
4
3
2
1
M
M
300 pb
218 pb
200 pb
100 pb
(b)
Gel poliakrilamida 12%; 120 volt; EtBr 1 µl/ml; 60 menit
Keterangan
:
Lajur kLajur 6
Lajur 5
Lajur 4
Lajur 3
Lajur 2
Lajur 1
Lajur M
: Kontrol negatif (tanpa penambahan cetakan DNA)
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 0,1 pg/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 1 pg/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 0,01 ng/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 0,1 ng/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 1 ng/µl
: Produk PCR dengan konsentrasi cetakan DNA 10 ng/µl
: Penanda DNA 100 pb
: Menunjukkan pita DNA dan ukurannya
: PCR dilakukan pada suhu annealing 56º C, konsentrasi akhir primer 1 µM, dan
konsentrasi akhir MgCl2 4 mM
Keterangan
Gambar 14. Visualisasi produk PCR hasil uji sensitivitas menggunakan
pasangan primer NIF757 + NIR975
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
72
k-
5
4
3
2
1
M
256 pb
300 pb
200 pb
100 pb
k-
9
8
7
6
M
300 pb
256 pb
200 pb
100 pb
Gel poliakrilamida 12%; 120 volt; EtBr 1 µl/ml; 60 menit
Keterangan
:
Lajur kLajur 9
Lajur 8
Lajur 7
Lajur 6
Lajur 5
Lajur 4
Lajur 3
Lajur 2
Lajur 1
Lajur M
: Kontrol negatif (tanpa penambahan cetakan DNA)
: Produk PCR Streptococcus pneumonia
: Produk PCR Neisseria meningitidis
: Produk PCR Haemophilus influenzae
: Produk PCR A/chicken/Indonesia/2006 (H5N1)
: Produk PCR A/Indonesia/2007 (H3N2)
: Produk PCR A/Indonesia/2007 (H1N1)
: Produk PCR A/chicken/Indonesia/2007 (H5N1)
: Produk PCR A/chicken/Indonesia/2006 (H5N1)
: Produk PCR A/chicken/Indonesia/2005 (H5N1)
: Penanda DNA 100 pb
: Menunjukkan pita DNA dan ukurannya
: PCR dilakukan pada suhu annealing 55,2º C, konsentrasi akhir primer 1 µM, dan
konsentrasi akhir MgCl2 2 mM
Keterangan
Gambar 15. Visualisasi produk PCR hasil uji spesifisitas menggunakan
pasangan primer NIF64 + NIR320
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
73
k-
5
4
3
2
1
M
300 pb
231 pb
200 pb
100 pb
k-
9
8
7
6
M
300 pb
231 pb
200 pb
100 pb
Gel poliakrilamida 12%; 120 volt; EtBr 1 µl/ml; 60 menit
Keterangan
:
Lajur kLajur 9
Lajur 8
Lajur 7
Lajur 6
Lajur 5
Lajur 4
Lajur 3
Lajur 2
Lajur 1
Lajur M
: Kontrol negatif (tanpa penambahan cetakan DNA)
: Produk PCR Streptococcus pneumonia
: Produk PCR Neisseria meningitidis
: Produk PCR Haemophilus influenzae
: Produk PCR A/chicken/Indonesia/2006 (H5N1)
: Produk PCR A/Indonesia/2007 (H3N2)
: Produk PCR A/Indonesia/2007 (H1N1)
: Produk PCR A/chicken/Indonesia/2007 (H5N1)
: Produk PCR A/chicken/Indonesia/2006 (H5N1)
: Produk PCR A/chicken/Indonesia/2005 (H5N1)
: Penanda DNA 100 pb
: Menunjukkan pita DNA dan ukurannya
: PCR dilakukan pada suhu annealing 57,6º C, konsentrasi akhir primer 1 µM, dan
konsentrasi akhir MgCl2 2 mM
Keterangan
Gambar 16. Visualisasi produk PCR hasil uji spesifisitas menggunakan
pasangan primer NIF306 + NIR537
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
74
k-
5
4
3
2
M
1
300 pb
200 pb
174 pb
100 pb
k-
9
8
7
6
M
300 pb
174 pb
200 pb
100 pb
Gel poliakrilamida 12%; 120 volt; EtBr 1 µl/ml; 60 menit
Keterangan
:
Lajur kLajur 9
Lajur 8
Lajur 7
Lajur 6
Lajur 5
Lajur 4
Lajur 3
Lajur 2
Lajur 1
Lajur M
: Kontrol negatif (tanpa penambahan cetakan DNA)
: Produk PCR Streptococcus pneumonia
: Produk PCR Neisseria meningitidis
: Produk PCR Haemophilus influenzae
: Produk PCR A/chicken/Indonesia/2006 (H5N1)
: Produk PCR A/Indonesia/2007 (H3N2)
: Produk PCR A/Indonesia/2007 (H1N1)
: Produk PCR A/chicken/Indonesia/2007 (H5N1)
: Produk PCR A/chicken/Indonesia/2006 (H5N1)
: Produk PCR A/chicken/Indonesia/2005 (H5N1)
: Penanda DNA 100 pb
: Menunjukkan pita DNA dan ukurannya
: PCR dilakukan pada suhu annealing 58,6º C, konsentrasi akhir primer 1 µM, dan
konsentrasi akhir MgCl2 2 mM
Keterangan
Gambar 17. Visualisasi produk PCR hasil uji spesifisitas menggunakan
pasangan primer NIF600 + NIR774
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
75
k-
5
4
3
2
1
M
300 pb
218 pb
200 pb
100 pb
k-
9
8
7
6
M
300 pb
218 pb
200 pb
100 pb
Gel poliakrilamida 12%; 120 volt; EtBr 1 µl/ml; 60 menit
Keterangan
:
Lajur kLajur 9
Lajur 8
Lajur 7
Lajur 6
Lajur 5
Lajur 4
Lajur 3
Lajur 2
Lajur 1
Lajur M
: Kontrol negatif (tanpa penambahan cetakan DNA)
: Produk PCR Streptococcus pneumonia
: Produk PCR Neisseria meningitidis
: Produk PCR Haemophilus influenzae
: Produk PCR A/chicken/Indonesia/2006 (H5N1)
: Produk PCR A/Indonesia/2007 (H3N2)
: Produk PCR A/Indonesia/2007 (H1N1)
: Produk PCR A/chicken/Indonesia/2007 (H5N1)
: Produk PCR A/chicken/Indonesia/2006 (H5N1)
: Produk PCR A/chicken/Indonesia/2005 (H5N1)
: Penanda DNA 100 pb
: Menunjukkan pita DNA dan ukurannya
: PCR dilakukan pada suhu annealing 56º C, konsentrasi akhir primer 1 µM, dan
konsentrasi akhir MgCl2 2 mM
Keterangan
Gambar 18. Visualisasi produk PCR hasil uji spesifisitas menggunakan
pasangan primer NIF757 + NIR975
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
76
TABEL
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
77
Tabel 1
Primer untuk mendeteksi N1
Posisi
Ukuran basa
%GC
Tm
N1F64
20
35
60
NIR320
19
37
60
N1F306
21
42
64
N1R537
18
50
65
N1F600
21
47
64
N1R774
18
50
64
N1F757
18
50
64
Expected
band
256 pb
231 pb
174 pb
218 pb
N1R975
18
55
66
N1 = neuraminidase 1; F= foward, R= Reverse
Tabel 2
Hasil pengukuran konsentrasi cDNA virus Avian Influenza
A/chicken/Indonesia/2006 (H5N1)
Sampel
Kadar
OD260 OD280 Konsentrasi
kemurnian
cDNA
cDNA
0,007 0,004
10 ng/µl
1,8
cDNA Avian Influenza
0,008
A/chicken/Indonesia/2006
(H5N1)
0,007
0,004
10 ng/µl
2
0,004
10 ng/µl
1,8
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
78
Tabel 3
Hasil uji sensitivitas PCR masing-masing pasangan primer
Pasangan
Primer
Konsentrasi
MgCl2
Konsentrasi
Primer
Suhu
Annealing
o
NIF64 +
NIR320
4 mM
1 µM
55,2 C
NIF306 +
NIR537
4 mM
1 µM
57,6 C
NIF600 +
NIR774
4 mM
1 µM
58,6 C
NIF757 +
NIR975
4 mM
1 µM
56 C
o
o
Keterangan :
+ = Terbentuk pita DNA spesifik
- = Tidak terbentuk pita DNA
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
o
Konsentrasi cDNA
10 ng/µl
1 ng/µl
0,1 ng/µl
0,01 ng/µl
1 pg/µl
0,1 pg/µl
10 ng/µl
1 ng/µl
0,1 ng/µl
0,01 ng/µl
1 pg/µl
0,1 pg/µl
10 ng/µl
1 ng/µl
0,1 ng/µl
0,01 ng/µl
1 pg/µl
0,1 pg/µl
10 ng/µl
1 ng/µl
0,1 ng/µl
0,01 ng/µl
1 pg/µl
0,1 pg/µl
Hasil
PCR
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
79
Tabel 4
Hasil uji spesifisitas PCR masing-masing pasangan primer
Pasangan
Primer
NIF64 +
NIR320
NIF306 +
NIR537
NIF600 +
NIR774
Konsentrasi
MgCl2
2 mM
2 mM
2 mM
Konsentrasi
Primer
1 µM
1 µM
1 µM
Suhu
Annealing
Strain cDNA
Hasil
PCR
+
o
A/chicken/Indonesia/2005
(H5N1)
A/chicken/Indonesia/2006
(H5N1)
A/chicken/Indonesia/2007
(H5N1)
A/Indonesia/2007 (H1N1)
A/Indonesia/2007 (H3N2)
Haemophilus influenzae
Neisseria meningitidis
Streptococcus pneumonia
+
o
A/chicken/Indonesia/2005
(H5N1)
A/chicken/Indonesia/2006
(H5N1)
A/chicken/Indonesia/2007
(H5N1)
A/Indonesia/2007 (H1N1)
A/Indonesia/2007 (H3N2)
Haemophilus influenzae
Neisseria meningitidis
Streptococcus pneumonia
+
o
A/chicken/Indonesia/2005
(H5N1)
A/chicken/Indonesia/2006
(H5N1)
A/chicken/Indonesia/2007
(H5N1)
A/Indonesia/2007 (H1N1)
A/Indonesia/2007 (H3N2)
Haemophilus influenzae
Neisseria meningitidis
Streptococcus pneumonia
55,2 C
57,6 C
58,6 C
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
+
+
-
+
+
-
+
+
-
80
Pasangan
Primer
Konsentrasi
MgCl2
NIF757 +
NIR975
2 mM
Konsentrasi
Primer
1 µM
Suhu
Annealing
o
56 C
Keterangan :
+ = Terbentuk pita DNA spesifik
- = Tidak terbentuk pita DNA
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
Strain cDNA
A/chicken/Indonesia/2005
(H5N1)
A/chicken/Indonesia/2006
(H5N1)
A/chicken/Indonesia/2007
(H5N1)
A/Indonesia/2007 (H1N1)
A/Indonesia/2007 (H3N2)
Haemophilus influenzae
Neisseria meningitidis
Streptococcus pneumonia
Hasil
PCR
+
+
+
-
81
LAMPIRAN
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
82
Lampiran 1
Komposisi campuran reaksi sintesis cDNA dengan enzim omniscript
reverse transcriptase
Bahan
Distilled water
RT-PCR buffer
5 mM dNTP mix
10 mmol Random primers
5 u/µl enzim omniscript reverse transcriptase
RNAse inhibitor
Template RNA
TOTAL
Volume (µl)
2,0
2,0
2,0
2,0
1,0
1,0
10,0
20,0
[Sumber: Qiagen 2004: 13.]
Lampiran 2
Komposisi campuran reaksi Hot-Start PCR 2 mM MgCl2, 1 µM primer
Bahan
Distilled water
10× PCR buffer (mengandung 1,5 Mm MgCl2)
5× Q-Solution
25 mM MgCl2
10 mM dNTP mix
10 mmol Primer
5 u/µl enzim Hot-Star Taq
Template DNA
TOTAL
Volume (µl)
6,57
1,3
2,6
0,26
0,26
1,3
0,07
0,65
13,0
[Sumber: Widyaningtyas, komunikasi pribadi, 25 Oktober 2007.]
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
83
Lampiran 3
Komposisi campuran reaksi Hot-Start PCR 4 mM MgCl2, 1 µM primer
Bahan
Volume (µl)
Distilled water
4,88
10× PCR buffer (mengandung 1,5 Mm MgCl2)
1,3
5× Q-Solution
2,6
25 mM MgCl2
1,30
10 mM dNTP mix
0,26
10 mmol Primer
1,3
5 u/µl enzim Hot-Star Taq
0,07
Template DNA
0,65
TOTAL
13,0
[Sumber: Widyaningtyas, komunikasi pribadi, 25 Oktober 2007.]
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
84
Lampiran 4
Penghitungan volume larutan 25 mM MgCl2 yang harus ditambahkan
ke dalam campuran reaksi PCR
Tujuan:
Untuk mengetahui volume larutan 25 mM MgCl2 yang harus
ditambahkan ke dalam campuran reaksi PCR agar memiliki konsentrasi akhir
MgCl2 tertentu.
Rumus:
Konsentrasi MgCl2 − 1,5 mM MgCl2
Volume MgCl2 =
x total volume reaksi
25 mM MgCl2
Contoh perhitungan:
Volume 25 mM MgCl2 yang harus ditambahkan
Jika ingin membuat : volume total campuran reaksi PCR 10 µl
konsentrasi MgCl2 dalam reaksi PCR 2,5 mM
maka volume 25 mM MgCl2 yang ditambahkan:
(2,5 mM MgCl2 − 1,5 mM MgCl2)
25 mM MgCl2
(MolecularStation 2008: 1).
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
x 10 µl = 0,4 µl
85
Lampiran 5
Penghitungan volume larutan 10 µM primer yang harus ditambahkan ke
dalam campuran reaksi PCR
Tujuan:
Untuk mengetahui volume larutan 10 µM primer yang harus
ditambahkan ke dalam campuran reaksi PCR agar memiliki konsentrasi akhir
primer tertentu.
Rumus:
M1 x V1 = M2 x V2
M1 adalah working concentration primer dari stok.
M2 adalah konsentrasi akhir reaksi PCR.
V1 adalah volume primer yang ditambahkan ke dalam reaksi PCR.
V2 adalah total volume reaksi PCR.
Contoh perhitungan:
Volume 10 µM primer yang harus ditambahkan
Jika ingin membuat : volume total campuran reaksi PCR 13 µl
konsentrasi primer dalam reaksi PCR 1 µM
maka volume 10 µM primer yang ditambahkan:
(1 µM x 13 µl)
10 µM
(MolecularStation 2008: 1).
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
= 1,3 µl